Name: 磁共振引导的高强度聚焦超声产生热疗:小鼠横纹肌肉瘤模型中的可行治疗方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 了解磁共振引导高强度聚焦超声热疗在小鼠横纹肌肉瘤模型中的应用方法。该技术结合温敏脂质体实现肿瘤靶向药物释放，最大限度降低全身毒性并激活免疫反应，为肉瘤治疗提供可行的临床转化方案。

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我们希望感谢本项目获得的资金支持以及参与人员，包括：C17研究基金、加拿大研究生奖学金、安大略省学生机会信托基金以及詹姆斯·J·哈蒙德基金。

研究工作严格遵守动物护理委员会的规定，在加拿大表型基因组学中心（TCP）和大学健康网络（UHN）动物资源中心（ARC）的动物研究设施内，由监管兽医监督下按照批准的动物使用方案进行。除磁共振引导高强度聚焦超声（MRgHIFU）外，所有涉及动物的操作均在生物安全柜（BSC）中进行，以最大限度减少动物暴露于外界空气或易感感染的风险。
1. 小鼠繁育
注意：预实验共纳入65只小鼠（品系B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J）（雄性：n = 23；雌性：n = 42）。雄性和雌性小鼠均在7至9周龄时使用。其仔鼠断奶后进行基因分型，选用p53杂合子小鼠进行实验。
<ol>
	<li>将两只雌性小鼠与每只雄性小鼠共同饲养以建立繁殖笼。从出生日起计算其仔鼠的年龄（出生日 = 第0天）。</li>
	<li>在第10天，通过耳缘缺口标记仔鼠。在细胞系注射前采集尾尖组织用于基因型鉴定。</li>
</ol>
2. 小鼠基因分型
<ol>
	<li>使用商用DNA提取试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书从采集的2 mm尾部组织样本中提取DNA。</li>
	<li>使用分光光度计（参见材料表）测定260–280 nm处的吸光度，以确定DNA浓度和纯度。</li>
	<li>进行聚合酶链式反应（PCR）。
	<ol>
		<li>配制主混合液：将商用PCR预混液（含Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；参见材料表）、引物和dH2O按12.5:0.25:10.75（µL）的比例混合，配制所需样本数量的主混合液。向每个PCR管中加入1 µL DNA样本，并设置对照：dH2O（空白对照）、p53突变纯合子样本、p53突变杂合子样本以及野生型样本（p53正常基因纯合子）。</li>
		<li>向每个含有DNA的PCR管中加入24 µL主混合液。用移液器反复吹打各PCR管中的溶液，使DNA在主混合液中均匀分布。</li>
		<li>将反应管放入热循环仪中，按以下程序进行扩增：95 °C预变性2 min，随后进行40个循环（95 °C变性15 s、60 °C退火15 s、72 °C延伸1 min），最后在4 °C保存直至进行凝胶电泳分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
	<ol>
		<li>制备2%琼脂糖凝胶（50 mL 1x TAE缓冲液加1 g琼脂糖）：将琼脂糖加入TAE缓冲液中加热并搅拌至完全溶解。待溶液冷却但仍为液态时，加入2.5 µL DNA凝胶染料并混匀。将凝胶倒入电泳胶板中插入梳子。凝胶凝固后，将其放入电泳装置（参见材料表）并用1x TAE缓冲液覆盖。</li>
		<li>在凝胶上样10 µL 1 kB DNA Ladder。每个样本上样12.5 µL。在135 V电压下电泳25分钟。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用凝胶成像系统（参见材料表）并选择与所用DNA凝胶染料相匹配的成像参数对凝胶进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肿瘤模型制备（图1）
<ol>
	<li>在注射前1周，将M25FV24C细胞系（第12-15代）接种于75 mL培养瓶中，使用完全生长培养基（含添加剂的Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]：10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽），在37 °C、5% CO2条件下培养。当细胞融合度达到约80%时，吸除培养基，并用5 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞1次。 
	注：M25FV24C是一种经基因工程改造的小鼠细胞系，可过表达突变型FGFR4V550E，该突变在儿童及成人横纹肌肉瘤（RMS）中均有发现1,26。</li>
	<li>沿培养瓶壁加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，室温孵育2-3分钟以消化细胞。待细胞明显脱落时，加入2.5 mL室温的完全生长培养基以终止胰蛋白酶活性。取10 µL细胞悬液样本，使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法测定活细胞浓度。</li>
	<li>根据所需注射量，配制适当体积的DPBS悬浮细胞液，并转移至1.5 mL微量离心管中：离心体积 = （小鼠数量 × 每只小鼠所需细胞数）/ 细胞浓度，其中小鼠数量 = 实际注射小鼠数 + 额外预留10只用于误差补偿，每只小鼠注射细胞数为104个。</li>
	<li>以153 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于适量的肌内注射缓冲液（F10培养基 + 0.5% FBS）中，总体积为每只小鼠10 µL × 小鼠总数，并在细胞悬液制备后1小时内完成注射。</li>
</ol>
4. 肌肉内细胞注射
注意：将 M25FV24C 细胞注射至 4 至 6 周龄小鼠的右后肢。4 周龄时注射会产生体型较小的小鼠，其肿瘤周围组织较少，不利于热疗（HT）的热量扩散，治疗难度较大；而等到 6 周龄注射则获得体型较大的小鼠，更有利于肿瘤治疗。
<ol>
	<li>吸取前将细胞悬液轻轻颠倒混匀数次，以帮助细胞在溶液中均匀分布。使用微升注射器吸取10 µL（104个细胞）（参见材料表）。抓起小鼠背部皮肤固定小鼠；固定后，通过伸展后肢可暴露大腿后侧肌肉区域。使用电动剃毛器剃除腿部毛发，并用70%乙醇擦拭消毒。</li>
	<li>使用带有26s G针头的气密式微升注射器，将M25FV24C细胞悬液（10 µL，104个细胞）注射至一只4–6周龄小鼠的右侧后肢大腿肌肉中。 
	注意：针头应平行于股骨朝向膝盖方向插入，注意避免损伤坐骨神经。由于后肢肌肉量较小，仅需插入针尖部分（约2 mm）即可。</li>
	<li>以稳定的速度推注溶液。注射完成后拔出针头，并确认无出血现象。将小鼠放回另一个饲养笼中。</li>
	<li>每天观察动物状态，通过触诊监测其后肢肿瘤的生长情况。若出现以下任一早期终点指标，应使用二氧化碳实施安乐死：肿瘤直径超过1.5 cm、肿瘤发生溃烂，或出现全身性病态症状（如毛发竖立、弓背姿势、活动减少、摄食或饮水量下降）。</li>
</ol>
5. 筛查性 MRI 扫描
<ol>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉，麻醉深度应达到足部挤压无反应的程度，具体参数如下：在诱导室中以4%异氟烷、1.5 LPM流速进行诱导，随后转移至MRI扫描仪滑床上的鼻罩，并通过鼻罩以0.75 LPM流速维持1.5%-2%异氟烷麻醉。连接呼吸监测仪。在麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。</li>
	<li>使用MRI扫描仪（见材料表）对麻醉后的小鼠进行成像。在T2加权图像（Ax_Screen序列，表1）上，记录肿瘤所在层面的平面尺寸以及肿瘤所涉及的轴向切片数量。注意肿瘤相对于股骨及大腿外侧表面的位置，后者为超声波入射区域。 
	注意：肿瘤在肌肉中表现为与对侧不对称的高信号团块。对于需要多次治疗的急性或生存研究，建议起始肿瘤大小为2 mm × 2 mm × 2 mm。若肿瘤过大，则仅适用于急性研究，因为肿瘤可能在完成每周三次治疗前即达到实验终点尺寸。HIFU治疗的排除标准包括：肿瘤包绕股骨、距离股骨过近、位置过于靠后、位于股骨内侧或距离直肠过近。</li>
	<li>将小鼠从扫描仪中取出，并记录基础体重。在麻醉状态下使用电动剃毛器将小鼠从中段躯干至足部的毛发剃除。 
	注意：理想情况下应在治疗前1天进行剃毛，以便小鼠恢复后可进行理毛行为，从而提高脱毛膏的使用效率。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中使用加热垫对小鼠进行复苏，将加热垫置于笼子一端。当小鼠恢复胸卧位时，将其放回原笼中。</li>
</ol>
6. 实验：HIFU 治疗日动物准备
<ol>
	<li>准备小孔径HIFU（参见 材料表）系统，&#160;打开发生器，向换能器中加入足量去离子水，直至换能器下方的膜膨胀展开，但膨胀程度不宜过强，以免压迫小鼠。对换能器回路中的水进行30分钟脱气处理，以去除介质中溶解的氧气。</li>
	<li>准备相关的计算机系统。
	<ol>
		<li>打开控制计算机并确保其已连接 通过 以太网连接至HIFU发生器并 通过 USB连接至热探针显示器。启动软件并点击 首页 在插入小鼠之前对换能器进行归零。</li>
		<li>校准光纤热探针：获取室温基线值，并记录磁共振成像（MRI）室内的温度变化。注意每个探针因磁场强度引起的温度漂移幅度。将漂移管温度探针插入装有钆剂的玻璃管中，用于扫描期间的温度校准，并用胶带固定漂移管。 
		注意：基线室温（漂移管）需在软件的图形用户界面（GUI）中手动添加为测温参数。在MR图像的漂移管内设定一个感兴趣区域（ROI），用于检测任何温度漂移，并将自动校正测温图像。</li>
		<li>将待注射药物吸入1 mL注射器中，并将其放入自动输注泵内（参见 材料表用自动给药泵上的手动给药按钮，推动药物直至完全充满将连接小鼠尾静脉导管的管路，完成管路的预充。</li>
		<li>使用加热灯在转移小鼠至麻醉室前将其笼盒内的小鼠加热约20分钟。 
		注意：预热可促进血管扩张，小鼠一旦麻醉后即会出现此效应，有助于导管放置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用异氟烷麻醉小鼠（诱导：4% 浓度，1.5 LPM 流速；维持：1.5%–2% 浓度，0.75 LPM 流速），并转移至鼻罩。在眼睛表面涂抹角膜润滑剂，以防止麻醉期间因眨眼反射消失导致的眼部损伤。</li>
	<li>将脱毛膏涂抹于剃毛区域，包括整个右侧后肢，按照生产商说明进行脱毛。 
	注意：在生物安全柜中对麻醉状态下的小鼠进行脱毛时，将其置于加热灯下以帮助维持体温调节。</li>
	<li>用温水洗去脱毛膏后，将小鼠置于电子天平上称重，并记录数据以用于药物剂量计算。</li>
	<li>将小鼠移至MRI兼容的鼻罩上，置于MRI滑床上。在准备MRI扫描时，为小鼠放置加热灯以维持体温。将小鼠置于侧卧位，非荷瘤侧朝下，荷瘤侧朝上，固定于滑床上的3D打印小鼠固定装置内补充图1 和 图2）。确保肿瘤位置正确（即在探头水平和垂直方向的中心位置，高度略高于小鼠固定器边缘，以补偿超声探头压迫所致的位移）。 
	注意：如有需要，可将压缩的超声耦合剂垫片裁剪成适当大小，置于小鼠下方并铺满固定装置底部，其厚度应使肿瘤与固定装置顶部齐平。</li>
	<li>将未涉及肿瘤的腿从患瘤腿一侧移开，可置于小鼠身体下方，或与屈曲的患瘤腿一同伸展。确保双足不在肿瘤及超声束路径的近场或远场范围内。将加热灯置于距尾部15 cm处，以加温便于导管插入尾静脉。</li>
	<li>插入食管温度探头。
	<ol>
		<li>将食管探针穿过鼻锥，捏住小鼠颈部的皮肤。将小鼠鼻部向上倾斜，伸展头部，使其口腔至胃部呈一条直线。将热探针沿舌上方滑入小鼠食管约0.5 cm，并将鼻锥重新固定在小鼠鼻部周围。在滑轨顶部固定食管探针和鼻锥。 
		注意：插入后应立即监测呼吸困难的迹象，因为导管可能误入气管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>插入直肠温度探头。 
	注意：直肠和食管温度探头的读数应彼此相差在 3 °C 以内。</li>
	<li>将呼吸监测仪置于小鼠头部方向，并使连接线朝向小鼠头部，以避免干扰超声探头的放置。用胶带固定。</li>
	<li>将27 G蝶形针尾静脉导管插入侧尾静脉，导管连接微管，微管死腔体积为20 µL，并用胶带妥善固定。固定后，确保导管仍能顺利冲洗。</li>
	<li>由两人将准备好的小鼠、小鼠滑板、麻醉管路、呼吸监测管路、尾静脉导管和温度探头导线移至MRI扫描仪内，并放入MRI滑板固定架中。</li>
	<li>请提供完整的源文本内容，以便进行准确翻译。当前提供的文本不完整，无法确保翻译的科学准确性与上下文连贯性。 材料表操作者通过目视检查，将换能器的弯月面直接移动到肿瘤上方，以进行初步对准27在肿瘤上方的无毛皮肤上涂抹眼用润滑剂或脱气超声耦合凝胶，并将HIFU换能器耦合至肿瘤区域。</li>
	<li>将自动泵的给药管路连接至尾静脉导管。计算尾静脉管路及连接管路中的死腔体积。将小鼠HIFU滑板沿MRI导轨推入MRI中心。</li>
	<li>根据药物类型、浓度和动物体重设定泵的药物输注量，并加入死腔体积。将泵的输注速率设置为 200 µL/min。 
	注意：本研究中，FD 和 TLD 的使用浓度为 2 mg/mL，剂量为 5 mg/kg 体重。</li>
	<li>记录基础热探针温度。</li>
	<li>放置空气对流加温装置（参见 材料表) 调至最高温度设置。将吹气管对准位于MRI孔中心的小鼠，并用胶带固定。随后将加热装置调至最低设置（32 °C），以防止小鼠在超声过程中过热。</li>
	<li>获取定位 MR 图像（轴位定位像，矢状位定位像； 表1）以确定肿瘤位置，用于聚焦超声治疗的靶向定位，包括深度信息。根据影像测量结果，在HIFU软件中输入所需的移动距离，然后点击箭头方向，相应调整换能器的位置（图3A）。同时注意漂移管的位置。根据需要重复上述步骤。</li>
	<li>通过在 Test_Shot 测温采集期间执行一次短暂的 5 秒、50 mV 振幅连续“测试脉冲”超声照射，确定换能器在冠状面内的焦点位置。表1).</li>
	<li>在HIFU软件中将MR定位图像与焦点区域的冠状面视图对齐。根据骨性结构和直肠的位置评估肿瘤的定位，并根据需要调整换能器的位置。</li>
	<li>重复进行九次重复热成像期间的测试脉冲超声处理表1）以确认肿瘤区域是否实现均匀且精确的加热，同时尽量减少非靶区加热。调整扫描层面位置、换能器位置和聚焦深度，并通过重复测试验证加热效果 &#34;测试镜头&#34; 根据需要。</li>
	<li>使用HIFU治疗监测软件，通过测量移动距离并在程序中调整网格坐标，于最终加热轮廓内定义用于测温监测的感兴趣区域（ROI）。在漂移管周围设置ROI以进行漂移校正。根据直肠探头温度输入测温测量的基线温度。HIFU系统用于启动HIFU治疗的超声照射，并进行测温监测。</li>
	<li>在软件中打开20分钟热疗处理参数，待参考磁共振图像采集完成且温度测量开始后，启动超声照射。</li>
	<li>进行20分钟处理（图3B热成像期间（）表1使用内置的比例-积分-微分（PID）控制器软件进行控制。在感兴趣区域（ROI）温度升至目标温度（40 °C）后，于1.5分钟时注入选定药物。</li>
	<li>在整个治疗过程中监测核心温度。如果治疗期间直肠温度迅速升高，可能需要重新调整小鼠位置，以避免在10或20分钟的治疗过程中直肠温度过高。若直肠温度升高至 &#62;40 °C</li>
</ol>
7. 实验：用于急性研究的小鼠模型成像与超声处理程序
<ol>
	<li>治疗结束后，将小鼠从磁共振成像仪孔洞中取出，确保尾静脉导管插入部位止血完全。随后将小鼠转移至生物安全柜中，并置于鼻罩上以维持麻醉状态。</li>
	<li>将小鼠仰卧于蓝色吸水垫上，固定四肢并暴露心脏。</li>
	<li>通过放血法处死小鼠 通过 心脏穿刺后取出心脏，立即采集血液，并以10,621 x g离心分离血浆 g 10 分钟。</li>
	<li>进行尸体解剖，并按分析要求保存器官。将器官置于液氮中速冻，随后于 -80 °C 保存数月，或长期保存于液氮罐中。</li>
	<li>通过加入九倍重量（w/w）的去离子水，并使用珠磨式匀浆器破碎组织，对肿瘤组织进行机械匀浆。向600 µL匀浆组织中依次加入75 µL的300&#8239;毫克/毫升硝酸银，75 µL 的 10&#8239;毫摩尔硫酸和2.5&#8239;1 mL 1:1 异丙醇:氯仿。涡旋振荡 20 分钟，于 −20 °C 过夜保存。</li>
	<li>为进行高效液相色谱（HPLC）分析的样品制备，将步骤7.5所得溶液在4,500 x g，移除有机溶剂层，并在氮气流下干燥异丙醇:氯仿。用100 µL 2:1 MeOH:H2O. 使用 HPLC-MS/MS 测定阿霉素浓度28.</li>
</ol>
8. 实验：用于生存研究的小鼠模型成像与超声处理流程
注意：对于生存研究，请遵循高强度聚焦超声（HIFU）治疗当天的动物准备程序（步骤 6.1 至 6.25）。
<ol>
	<li>治疗结束后，将小鼠置于加热灯下使其恢复，并监测其呼吸和活动情况，直至恢复胸卧位。然后将动物放回笼中。 
	注意：确保笼子的一半区域处于加热灯下方，因为麻醉和高温治疗会影响动物的体温调节功能。</li>
	<li>每天观察小鼠的行为、进食模式和呼吸频率，以检查是否存在任何痛苦迹象。</li>
	<li>按照步骤 6.1 至 6.25，每周进行一次治疗，连续进行 3 周。</li>
	<li>每周进行两次小鼠的 MRI 成像以测量肿瘤大小。在治疗期间，每周进行一次 MRI 扫描和一次超声检查。治疗结束后，改为每两周进行一次超声成像。</li>
	<li>在完成系列治疗后第 60 天处死小鼠，或在达到人道终点时处死（肿瘤体积 &#62;1.5 cm3 或因肿瘤导致明显病态），随后进行解剖，切除肿瘤及器官用于分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何需披露的财务利益或利益冲突。

本方案旨在利用磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）对后肢肿瘤进行轻度热疗，并触发脂质体包载药物的释放。 体内 在初步研究期间，本方案中遇到了几个关键步骤，对这些关键步骤的优化使得后续治疗成功率较初步研究有所提高。首先是彻底清除拟进行超声辐照区域的毛发。毛发中若残留任何气体，会阻碍超声波束的穿透，从而阻止超声能量进入靶组织。1其次，小鼠的定位对于治疗的成功至关重要；应将肿瘤置于小鼠固定装置的上方，以使其更贴近超声换能器。此外，应调整位置使骨骼结构避开超声束的路径，同时避免对小鼠造成损伤。研究表明，骨骼能高效吸收超声波，进而充当 原位 热源。它可能影响加热过程，同时阻碍超声能量向目标区域的传导4对侧肢体也应移出超声路径范围，可通过将腿部向上收拢至身体下方，或将其伸展并在双腿之间填充超声耦合剂或凝胶垫来实现。直肠必须避开超声路径，以避免非靶区加热以及温度探针引起的反射。精确的肿瘤定位是完成成功治疗的最关键步骤。 
正确放置后，需小心插入食管温度探头，...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64544">Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model </a>. The Authors section was updated from:
Claire Wunker1,2 
Karolina Piorkowska3 
Ben Keunen3 
Yael Babichev2 
Suzanne M. Wong3,4 
Maximilian Regenold5 
Michael Dunne5 
Julia Nomikos1,2 
Maryam Siddiqui6 
Samuel Pichardo6 
Warren Foltz7 
Adam C. Waspe3,8 
Justin T. Gerstle3,9 
Rebecca A. Gladdy1,2,10 
1 Institute of Medical Science, University of Toronto 
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital 
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children 
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto 
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto 
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary 
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto 
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto 
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto 
10 Department of Surgery, University of Toronto
to:
Claire Wunker1,2 
Karolina Piorkowska3 
Ben Keunen3 
Yael Babichev2 
Suzanne M. Wong3,4 
Maximilian Regenold5 
Michael Dunne5 
Julia Nomikos1,2 
Maryam Siddiqui6 
Samuel Pichardo6 
Warren Foltz7 
Adam C. Waspe3,8 
Justin T. Gerstle3,9 
James M. Drake1,3,4,10 
Rebecca A. Gladdy1,2,10 
1 Institute of Medical Science, University of Toronto 
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital 
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children 
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto 
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto 
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary 
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto 
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto 
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto 
10 Department of Surgery, University of Toronto

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64544">Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
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Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model

横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RMS）是一种骨骼肌肿瘤，最常见于儿童和年轻成人1。局限性病变通常采用包括化疗、电离辐射和手术在内的多模式治疗。在儿科患者中，多药联合化疗方案的应用更为普遍，其疗效优于成年患者2；然而，尽管持续开展研究，该病最侵袭性形式的5年生存率仍维持在约30%3,4。目前标准的化疗方案为包含长春新碱、环磷酰胺和放线菌素D的多药联合方案。对于复发或难治性病例，则采用其他化疗药物，包括标准（游离）阿霉素（FD）和异环磷酰胺1。尽管上述所有化疗药物均存在全身毒性，但阿霉素的心脏毒性会导致终身用药剂量受限5-7。为了提高药物向肿瘤部位的递送量并减少全身毒性，已开发出多种替代制剂，包括脂质体包封技术。这类制剂可分为非热敏型阿霉素（已获批用于乳腺癌和肝细胞癌的治疗）和热敏型阿霉素（目前正处于临床试验阶段）8,9,10,11,12,13。其他递送脂质体包封药物的方法，如多囊脂质体和配体靶向脂质体，也已得到评估，并在肿瘤治疗中展现出良好前景9。在本研究中，加热具有多重作用，包括促进药物释放14。利用磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）产生高温（HT），联合使用热敏脂质体阿霉素（TLD），是一种新型的多模式治疗策略，可在最小化剂量限制性毒性的前提下，有效利用这一高效但具毒性的药物治疗RMS，并可能增强机体对肿瘤的免疫应答。
阿霉素在温度升高时从TLD中快速释放 &#62;39 °C，明显高于人体平均体温37 °C，但尚未达到引起组织损伤或消融的温度；组织损伤通常在43 °C开始出现，当温度接近60 °C时损伤发生速度显著加快15. 已采用多种方法来生成 HT 体内包括激光、微波、射频消融和聚焦超声，其中许多为侵入性加热方法16MRgHIFU 是一种非侵入性、非电离的加热方法，可在靶组织内实现精确的温度控制 原位 磁共振（MR）成像能够提供实时影像，可通过计算机软件在整个治疗过程中计算组织的测温数据；随后，该数据可用于实时控制超声治疗，以达到并维持设定的目标温度17MRgHIFU 已在多种组织类型中进行测试，可用于从轻度热疗到消融的各种温度治疗，并已在临床上成功用于治疗疼痛性骨转移18此外，HT 已被证明可导致肿瘤细胞毒性，调节蛋白质表达，并改变肿瘤微环境中的免疫反应19,20,21,22一项研究在协同性R1大鼠模型中，将轻度高温治疗（HT）与靶向脂质体递送（TLD）联合，随后采用磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）进行消融。23，导致肿瘤核心坏死并使药物递送至肿瘤边缘区域。传统上，放射治疗作为辅助疗法用于损伤肿瘤细胞并降低局部疾病复发率。然而，其应用受到终身累积剂量限制以及脱靶损伤的制约1因此，HT的独特之处在于，它能在不产生相同毒性和限制的情况下，引发一些相似的效果。
用于横纹肌肉瘤（RMS）的临床前动物模型包括同源性免疫健全模型以及在免疫缺陷宿主中建立的患者来源异种移植模型（PDX）。尽管免疫缺陷模型能够支持人类肿瘤的生长，但缺乏适当的肿瘤微环境，且在研究免疫应答方面存在局限性。24FGFR4激活突变是成人和儿童横纹肌肉瘤预后不良的潜在生物标志物及治疗靶点1,25在Gladdy实验室建立的同源RMS模型中，肿瘤能够在具有免疫能力的宿主体内生长，该宿主可对肿瘤产生天然免疫和适应性免疫应答26由于高温治疗（HT）会影响免疫反应，观察小鼠免疫反应的变化是该肿瘤模型的一个重要优势。为检测与冻融死亡细胞（TLD）相比，全细胞裂解物（FD）对肿瘤的反应，以及肿瘤对化疗和高温治疗两种处理下免疫反应的变化，本研究建立并采用了一项方案，用于治疗同系小鼠横纹肌肉瘤（RMS）肿瘤。 体内 使用MRgHIFU和TLD，这是本研究的重点。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>1kb plus DNA Ladder</td><td>Froggabio</td><td>DM015-R500</td><td></td></tr><tr><td>2x HS-Red Taq（PCR 混合液）</td><td>Wisent</td><td>801-200-MM</td><td></td></tr><tr><td>7 Tesla MRI BioSpec</td><td>Bruker</td><td>T184931</td><td>70/30 BioSpec，Bruker，Ettlingen，德国</td></tr><tr><td>C1000 梯度 PCR 仪</td><td>Biorad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>毛发修剪器</td><td>Whal Peanut</td><td>8655</td><td></td></tr><tr><td>压缩超声耦合剂凝胶</td><td>Aquaflex</td><td>HF54-004</td><td></td></tr><tr><td>对流加热装置</td><td>3M Bair Hugger</td><td>70200791401</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Nair</td><td>61700222611</td><td>Shopper's Drug Mart</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Wisent</td><td>219-065-LK</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 提取试剂盒</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Wisent</td><td>311-420-CL</td><td></td></tr><tr><td>药物注射系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 70-2131</td><td>PHD 22/2200 MRI 兼容注射泵</td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Optixcare</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>F10 培养基</td><td>Wisent</td><td>318-050-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>081-105</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose</td><td>FroggaBio</td><td>A87</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>BioRad</td><td>GelDocXR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td>Morganville Scientific</td><td>HL0100&amp;nbsp;</td><td>与该产品类似</td></tr><tr><td>血管内聚乙烯导管（0.015&quot; 内径 × 0.043&quot; 外径，20G）</td><td>SAI infusion</td><td>PE-20-100</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>M25FV24C 细胞系</td><td>Gladdy 实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>01-01-7648</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc XR</td><td>Biorad</td><td>170-8170</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定装置</td><td>所用 3D 打印材料为 ABS-M30i，并在 FDM Fortus 380mc 设备上打印&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>尺寸：长度 = 43 mm，外径 = 15 mm，内宽（小鼠放置位置）= 20.7 mm。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MyRun 仪器</td><td>Cosmo Bio Co Ltd</td><td>CBJ-IMR-001-EX</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 8000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>p53 引物</td><td>Eurofins</td><td>N/A</td><td>定制引物</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Diamed</td><td>SSI3131-06</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Wisent</td><td>450-200-EL</td><td></td></tr><tr><td>Proteus 软件&amp;nbsp;</td><td>Pichardo 实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>呼吸监测系统</td><td>SAII</td><td>Model 1030</td><td>适用于小型动物的 MRI 兼容监测与门控系统</td></tr><tr><td>小型聚焦超声（HIFU）设备，LabFUS</td><td>Image Guided Therapy</td><td>N/A</td><td>LabFUS，Image Guided Therapy，Pessac，法国；阵元数量：8&lt;br/&gt; 频率：2.5 MHz&lt;br/&gt; 直径&amp;nbsp;：25 mm&lt;br/&gt; 曲率半径：20 mm&lt;br/&gt; 焦点区域尺寸：0.6 mm × 0.6 mm × 2.0 mm&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 电机：2 轴&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 发生器：&lt;br/&gt; 通道数：8&lt;br/&gt; 单通道最大电功率 Wel：4&lt;br/&gt; 总最大电功率 Wel：32&lt;br/&gt; 带宽：0.5 - 5 MHz&lt;br/&gt; 每通道控制参数：频率、相位和振幅&lt;br/&gt; 每通道测量参数：Vrms、Irms、cos(theta)&lt;br/&gt; 100% 功率下的占空比：%100，持续 1 分钟&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 换能器：&lt;br/&gt; 阵元数量：8&lt;br/&gt; 频率&amp;nbsp;：2.5 MHz&lt;br/&gt; 直径：25 mm&lt;br/&gt; 曲率半径：20 mm&lt;br/&gt; 焦点区域尺寸&amp;nbsp;：0.6 mm × 0.6 mm × 2.0 mm</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TAE</td><td>Wisent</td><td>811-540-FL</td><td></td></tr><tr><td>尾静脉导管（27G 0.5&quot;）</td><td>Terumo Medical Corp</td><td>15253</td><td></td></tr><tr><td>热敏探针</td><td>Rugged Monitoring</td><td>L201-08</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Wisent</td><td>325-052-EL</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂凝胶</td><td>Aquasonic</td><td>PLI 01-08</td><td></td></tr></tbody></table>

磁共振引导高强度聚焦超声产生的热疗：小鼠横纹肌肉瘤模型中的一种可行治疗方法

Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model

磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）是一种用于产生局部热疗的成熟方法。由于具备实时成像和声能调节能力，该技术可在特定区域内实现精确的温度控制。目前正利用这种无创、非电离辐射的技术探索多种热疗应用，例如通过热敏感脂质体载体实现药物释放。这些药物可包括阿霉素等化疗药物，因其全身性副作用（尤其是心脏毒性）限制了剂量，故需要实现靶向释放。阿霉素是治疗多种恶性肿瘤的主要药物，常用于复发性或难治性横纹肌肉瘤（RMS）。RMS是儿童和年轻成人中最常见的颅外实体软组织肿瘤。尽管采用积极的多模式治疗，过去30年来RMS的生存率始终未见改善。为应对这一尚未满足的临床需求，本研究建立了一种实验方案，旨在利用MRgHIFU作为热源，在免疫功能健全、同基因型的RMS小鼠模型中评估热敏感脂质体阿霉素（TLD）的药物释放效果。

利用MRgHIFU产生的热疗方案，可将后肢肿瘤持续加热至治疗期间所需的设定温度图4 显示一个代表性处理（10 或 20 分钟，n = 65）。要判定治疗成功，ROI 必须维持在以上 39 °C 在整个治疗过程中， &lt;6 °C 治疗过程中温度变化需均匀，且不得加热非靶向组织。此外，核心温度必须保持在以下水平 39 °C，根据直肠探针或初始直肠温度加上食管探针温度的变化（补充图2超声消融（MRgHIFU）停止后，肿瘤温度迅速恢复至基线水平。
肿瘤被靶向至 40.5 °C 以达到快速释药所需的温度，同时避免累积温度效应超过设定阈值 43 °C所有经处理肿瘤的ROI平均温度为 40.6 °C （n = 65），两次测量间平均差异为 10th 百分位数和90th 百分位体素的 4.3 °C平均温度的标准差为 1.3 °C 在10分钟和20分钟处理期间的整个治疗过程中（图5）。治疗方案符合纳入...

本文介绍了一种利用磁共振引导的高强度聚焦超声产生可控性高热，以在横纹肌肉瘤小鼠模型中触发温度敏感脂质体药物释放的实验方案。

磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）是一种用于产生局部热疗的成熟方法。鉴于其可提供实时……

本方案可实现针对肿瘤的靶向热疗与热敏药物联用的新型临床前测试，可用于提高肉瘤患者的生存率并降低全身毒性。该技术的主要优势在于，化疗药物的释放被限制在加热区域，从而在肿瘤内部实现药物释放的最大化，同时最小化药物在健康组织中的全身性释放。我们的方法可转化为临床应用，用于治疗肉瘤。此外，我们的研究正在探索局部低温如何激发免疫系统，以协助机体在标准化疗的同时靶向癌症。本次操作演示将由以下人员完成：Star 创新中心首席 MRI 物理学家 Warren Foltz 博士、多伦多病童医院 HIFU 首席物理学家 Adam Waspe 博士，以及来自该医院 Drake 实验室的应用科学硕士毕业生 Suzanne Wong。首先，使用剃毛器剃除固定小鼠后肢的毛发，并用 70% 乙醇擦拭。使用微量注射器吸取约 10,000 个细胞，体积为 10 微升的细胞悬液。伸展小鼠的右侧后肢，用带有 26 号针头的微量注射器将细胞悬液以稳定的速度注射至大腿肌肉组织中。针头应平行于股骨朝向膝盖方向插入，注意避免刺中坐骨神经。取下针头，将小鼠放回第二个笼子中。每天对动物进行评估，并通过触诊监测其后肢肿瘤的生长情况。使用磁共振成像仪对麻醉后的小鼠进行成像。在T2加权图像上，注意记录肿瘤所涉及的平面尺寸以及在轴向切片中的层数。注意记录肿瘤相对于股骨及大腿外侧表面的位置，后者是超声波进入的部位。准备小孔径HIFU系统时，先打开发生器，将膜安装在换能器上，并向换能器内注入足够的去离子水，直至膜在换能器下方充分膨胀。但硬度不应过大，以免压迫小鼠。在换能器回路中对水进行30分钟脱气处理，以去除培养基中溶解的氧气。将小鼠麻醉后转移至鼻罩，向其眼部涂抹角膜润滑剂，以防止因麻醉导致眨眼反射消失而造成角膜损伤。剃除小鼠右侧后肢的毛发。将脱毛膏涂抹于剃毛区域，包括整个右侧后肢。将小鼠置于生物安全柜内的加热灯下，以帮助其体温调节。涂抹后一分钟后，去除毛发和脱毛膏。将小鼠移至磁共振成像（MRI）滑橇上兼容MRI的鼻罩，并将小鼠非荷瘤侧朝下、荷瘤侧朝上放置于滑橇上的3D打印小鼠固定器中。在小鼠附近放置一盏加热灯以保持其体温。如有需要，可将压缩的超声凝胶垫裁剪成适当片段，置于小鼠下方，沿固定器底部铺平，厚度以使肿瘤与固定器顶部齐平为准。将未涉及肿瘤的腿从小腿侧移开，可置于小鼠身下，或与患肿瘤腿一同屈曲伸展。确保双足不在肿瘤及超声束通路的近场或远场范围内。插入食管温度探针时，先将食管探针穿过小鼠的鼻锥，同时抓住小鼠颈部的皮肤。将小鼠的鼻部向上倾斜，通过伸展头部使口部与胃部呈一条直线。将温度探针沿舌上方滑入小鼠食管约0.5厘米，然后将鼻锥重新套回小鼠鼻部。将食管探头和鼻罩固定在滑轨顶部。接着，插入直肠温度探头，并用胶带固定。如有需要，可再插入一个凝胶垫，并在右后肢周围涂抹眼用润滑剂或超声耦合剂，以填补任何间隙。将带有27号蝶形针的尾静脉导管插入小鼠侧尾静脉，该导管连接一段死腔体积为40微升的微型导管，并用胶带牢固固定。将呼吸监测仪放置在小鼠身上，连接线朝向小鼠头部，以避免干扰超声探头的放置，并用胶带固定。由两人协作将准备好的小鼠、小鼠滑板、麻醉管路、呼吸监测管路、尾静脉导管及温度探头导线移入MRI扫描仪，并放置于MRI滑板支架中。每个人都已接受筛查，确保没有携带任何铁磁性物品或可能在系统强磁场中受损的物品进入磁共振检查室。在HIFU软件操作员将换能器的弯月面初步对准肿瘤上方后，将眼用润滑剂或脱气超声耦合凝胶涂抹于肿瘤上方的无毛皮肤处，并将HIFU换能器耦合至肿瘤区域。将自动泵的给药管路连接至尾静脉导管，并计算尾静脉管路及连接管路中的死腔体积。将小鼠HIFU滑轨沿MRI导轨推入MRI中心，并将空气对流加热装置调至最高加热档位。将吹气管对准MRI孔道中心的小鼠，并用胶带固定。在后续超声辐照过程中，为防止小鼠过热，将加热装置调至最低档位。获取轴向和矢状面的扫描 MR 图像，以确定肿瘤位置，用于超声消融靶向，包括深度信息。根据图像上测量的距离，在 HIFU 软件中输入所需的移动距离，然后点击箭头方向进行调整，以相应调整换能器的位置。同时，注意记录漂移管的位置。根据需要重复操作。在测试温度测量采集期间，进行一次持续五秒、50毫伏的短暂连续测试脉冲，以确定换能器在角膜平面的焦点位置。在HIFU软件中将MR扫描图像与焦点的角膜视图对齐。根据骨性结构和直肠的位置关系评估肿瘤的影像，必要时调整换能器的位置。在九次重复热成像过程中重复测试性消融，以确认肿瘤体积内是否实现均匀且精准的加热，同时尽量减少对非靶区的加热。根据需要调整成像层面位置、换能器位置及聚焦深度，并通过重复测试性消融确认加热效果。使用HIFU治疗监测软件，在最终加热轮廓内通过测量移动距离并调整程序中的网格坐标，来定义用于测温监测的兴趣区域（ROI）。在漂移管的液体信号内设置一个ROI，用于对测温输出进行漂移校正。如果在肿瘤层面的轴向规划图像中该液体信号不清晰，则使用漂移管内光纤温度探针的直接输出进行漂移校正。根据直肠探头温度输入测温的基线温度。在软件中打开20分钟的热疗治疗参数，待参考MR图像采集完成且测温开始后，启动超声照射。在热成像过程中，使用内置的比例-积分-微分（PID）控制器软件进行20分钟的治疗。在感兴趣区域（ROI）温度升高至目标温度后1.5分钟，注射选定的药物。若治疗过程中直肠温度迅速上升并超过40摄氏度，应停止超声辐照，待直肠温度下降后再重新开始。治疗结束后，将小鼠从MRI孔径中取出，确保尾静脉导管插入部位止血，并将其转移至生物安全柜中。用水冲洗小鼠后肢上的超声耦合剂和润滑剂。将小鼠转移至笼中，监测其恢复情况。将加热灯对准笼子的一端，以协助小鼠在恢复期间进行体温调节。通过使用该高热治疗方案，能够持续将后肢肿瘤加热至治疗期间所需的设定温度。本图展示了代表性治疗过程中监测到的温度。此处显示了感兴趣区域（ROI）内所有体素的平均前10百分位和前90百分位温度。在优化阶段，检测了每只小鼠感兴趣区域（ROI）内治疗期间的平均温度及其标准差。同时展示了总体平均温度。随着时间推移，热疗的成功率也得到提高。治疗效果取决于纳入标准，即全身温度、肿瘤温度以及感兴趣区域（ROI）内的温度变化情况，且无远端加热现象。其中，蓝线表示治疗成功的实验小鼠所占的百分比，橙色条形表示接受治疗的小鼠数量。每种处理指实验进行的不同日期。为了确定后续研究的最佳低温处理时间，测试了两种处理时长：10 分钟和 20 分钟。采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC MS）检测肿瘤中阿霉素的含量，并量化不同处理时长下阿霉素累积量的差异。结果表明，与常温对照组相比，20分钟热敏脂质体阿霉素联合热疗组肿瘤中阿霉素的含量具有显著差异。在游离阿霉素组中，肿瘤内的药物含量未见差异。在制备和放置肿块时，必须确保HIFU声束无任何阻碍。应避免凝胶或骨骼在光束路径中产生气泡。我们采集组织和血液，以分析药物在各器官中的药代动力学和毒性水平，并检测免疫系统对治疗的即刻和延迟反应。

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Cancer Research

癌症研究

磁共振引导的高强度聚焦超声产生热疗:小鼠横纹肌肉瘤模型中的可行治疗方法

微泡的超声辐照是一种有前景的策略，可在降低的时间平均声功率下实现肿瘤消融，并实现治疗药物的靶向递送。本研究的目的是开发低占空比的超声脉冲策略和纳米载体，以最大程度地实现非热性微血管消融，并将载药递送至皮下C6胶质瘤。...

通过载药纳米颗粒递送与微血管消融实现小鼠胶质瘤的超声造影靶向治疗

取一只已麻醉的荷瘤小鼠，剃除其头部毛发。将其放置在与聚焦超声系统集成的磁共振成像（MRI）扫描仪中。最初的磁共振成像扫描可定位脑肿瘤及邻近的血管。静脉注射造影剂，然后给予包裹在充气微泡上的荧光标记纳米颗粒。造影剂和微泡循环并到达大脑。将聚焦超声波应用于肿瘤部位。超声波使微泡扩张和收缩，从而破坏肿瘤附近血脑屏障（BBB）的紧密连接。这会在血管中形成暂时性、局部的开口，使造影剂进入，从而确认血脑屏障的破坏。微泡破裂，释放出其表面的纳米颗粒。这些纳米颗粒通过血脑屏障的开放进入脑组织，并在肿瘤及其周围区域积聚。荧光成像可追踪纳米颗粒在肿瘤区域的定位，从而深入了解纳米颗粒在神经治疗药物递送中的分布情况。...

聚焦超声增强纳米颗粒递送在小鼠肿瘤治疗模型中的应用

来源：Mess, G., 等. 利用便携式台式聚焦超声系统在小鼠模型中进行胶质母细胞瘤的声动力治疗。J. Vis. Exp.

使用声动力疗法在小鼠模型中治疗脑肿瘤

已开发出一种与磁共振成像兼容的 定制化基于激光的加热装置，用于对皮下肿瘤进行局部加热，从而在肿瘤区域特异性地激活热敏脂质体中药物的释放。...

定制设计的基于激光的加热装置用于在磁共振成像引导下触发热敏脂质体释放顺铂

本文介绍了一种通过自组装制备氧化铁纳米颗粒包壳微泡（NSMs）的方案，该方案将磁性、声学和光学响应性协同整合于一个纳米治疗平台中，用于磁热疗与光热联合癌症治疗。...

磁性、声学与光学三重响应型微泡用于磁热与光热联合癌症治疗

本方案介绍了利用先进的递送与监测系统，精确实施磁性纳米颗粒热疗所需的技术与方法。...

使用定制递送系统进行磁性纳米颗粒热疗的体外与体内递送

本方案介绍了在实体瘤模型中实施靶向热疗所必需的技术与方法。该方法利用瘤内注射的金纳米棒对近红外光的光热转换作用，从而在肿瘤微环境中诱导局部加热。...

通过瘤内注射金纳米棒介导近红外光的光热转换在小鼠肿瘤模型中诱导靶向性轻度高热

在既往接受过放疗的区域中，孤立性复发性肺癌的治疗具有挑战性。本文介绍一种在既往放疗区域中针对局限性肺癌复发患者，采用支气管内超声（EBUS）引导下顺铂注射的治疗方法。...

超声支气管镜引导下肿瘤内注射顺铂治疗肺癌孤立性纵隔复发

本方案描述了在雌性C57BL/6J小鼠中建立原位膀胱肿瘤并监测肿瘤生长的方法。...

一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统

我们描述了一种利用靶向外周照射在小鼠中诱导类似疲劳行为的方法。选定的非致死照射剂量可导致小鼠自主转轮跑动活动减少，持续约一周时间。...

一种由外周照射诱导疲劳的小鼠模型

了解磁共振引导高强度聚焦超声热疗在小鼠横纹肌肉瘤模型中的应用方法。该技术结合温敏脂质体实现肿瘤靶向药物释放，最大限度降低全身毒性并激活免疫反应，为肉瘤治疗提供可行的临床转化方案。

磁共振引导高强度聚焦超声产生的热疗：小鼠横纹肌肉瘤模型中的一种可行治疗方法

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