使用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿氦中表达转基因

该协议描述了允许研究人员在天然膀胱尿路上皮中表达CDNA或SIRNA的方法。该技术的主要优点是其相对简单，能够在相对较短的时间内高效地在尿路上表达cDNA，siRNA。这项技术最难的部分是导尿术。

但是，一旦学习，整体技术相对容易掌握。演示该程序的将是我实验室的IV研究专家Giovanni Ruiz。首先，将麻醉小鼠放在鼻锥旁边的加热垫上。

在方案期间保持动物处于麻醉状态。用脚趾捏住确认鼠标已完全麻醉。为防止空气进入膀胱，请使用无菌移液管或注射器用无菌 PBS 填充静脉导管的塑料导管部分和相关枢纽。

动物仰卧位时，用70%酒精擦拭尿道外道口。然后轻轻抓住形成尿道外道的组织，并使用细镊子将其垂直伸出远离动物。将无菌导管插入外鼻道。

用另一只手小心地将导管垂直插入尿道口约三到四毫米。然后将插入外鼻道的导管朝动物的尾巴降低，这使其更容易进入通过耻骨下方并最终进入膀胱的尿道部分。让膀胱中的尿液泄漏出来。

通过按摩并轻轻按压下腹部的膀胱隆起来执行 Crede 的动作来清除任何残留的尿液。为了使尿路上皮接受转导，通过将装有PBS的无菌一毫升注射器连接到导管枢纽来洗涤小鼠或大鼠膀胱。将100微升无菌PBS注射到小鼠膀胱中。

将注射器从导管接头上拆下后，让PBS排出。使用无菌一毫升注射器将100微升溶解在PBS中的0.1%N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷和0.2微米过滤器灭菌到小鼠膀胱中。将注射器留在原位，将N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷保留在膀胱中10分钟。

通过分离注射器并使其排出，从膀胱中取出N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷。要将病毒引入膀胱，将无菌一毫升注射器连接到导管枢纽，并将5， 000， 000至100， 000， 000 IVP的腺病毒稀释在100微升无菌PBS中（小鼠）或450微升大鼠稀释到膀胱中。30分钟后，拆下注射器，让病毒溶液将膀胱排空到一次性垫子上。

用吸收性湿巾吸干任何残留的病毒溶液，同时丢弃垫子并擦拭生物危害废物。为了让动物恢复，停止异氟醚的流动。在将动物放回笼子之前，让动物恢复并完全移动，特别是如果动物是集体饲养的。

使用mRNA原位杂交，蛋白质印迹或免疫荧光等方法分析处理后12至72小时转基因表达的影响。尿路上皮裂解物的蛋白质印迹分析显示V5标记的人生长激素在转导膀胱的尿路上皮中表达，但在未转导的膀胱中没有。该表达也通过使用识别人类生长激素或V5表位标签的抗体的免疫荧光得到证实。

蛋白质印迹分析证实了Claudin-2在腺病毒转导的大鼠中的表达，但在用受控GFP编码病毒转导的大鼠中没有。免疫荧光分析进一步证实了用病毒编码的Claudin-2 cDNA转导的尿路上皮伞细胞中的外源性Claudin-2表达。通过免疫荧光和全切片尿路上皮的共聚焦显微镜检测紧密连接蛋白 1 中的外源性 Claudin-2 揭示了细胞质中 Claudin-2 的紧密连接和细胞内积累。

图像字段显示，计数转导伞细胞的数量显示出接近95%的效率，并且在整个膀胱壁中，只有尿路上皮被转导，并且没有其他组织被灌注的腺病毒靶向。导尿对于方案按预期工作至关重要。该技术使研究人员能够研究正常的尿路上皮生物学，以及了解蛋白质过度表达或表达不足导致疾病的条件。