Name: 使用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿氦中表达转基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 了解利用重组腺病毒在天然啮齿动物膀胱尿路上皮中高效表达cDNA和siRNA的方法。该技术转导效率接近95%，有助于深入研究尿路上皮基因功能及相关疾病机制。

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本研究工作获得了以下资助：P30DK079307 项下的试点项目资助（授予 M.G.D.），NIH 资助 R01DK119183（授予 G.A. 和 M.D.C.），NIH 资助 R01DK129473（授予 G.A.），美国泌尿学会职业发展奖及 Winters 基金会资助（授予 N.M.），匹兹堡肾脏研究中心肾脏细胞生理学与模式生物成像核心（P30DK079307）的支持，以及 S10OD028596（授予 G.A.），该资助用于购置本文中部分图像采集所使用的共聚焦成像系统。

涉及腺病毒制备的实验需要具备BSL2认证，并在匹兹堡大学环境健康与安全部门以及机构生物安全委员会的批准下进行。所有动物实验（包括需要ABSL2认证的腺病毒转导实验）均遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道照护与使用》和《动物福利法》的相关指南与规定，并在匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会的批准下实施。所有涉及重组病毒的操作均需佩戴手套、护目装备及适当的防护服。任何液体或固体废弃物均应按照下文所述方式进行处理。动物在转导后的垫料以及任何产生的动物尸体均应视为生物危害性材料，并根据机构政策进行处置。
1. 高滴度腺病毒储备液的制备
注意：有效转导啮齿类动物膀胱依赖于使用纯化且浓缩的病毒原液，通常为 1 x 107 至 1 × 108 每感染性病毒颗粒（IVP） &#181;L. 本部分实验方案的重点是从现有的病毒制备物中制备高滴度的腺病毒储备液。所有步骤均应在细胞培养生物安全柜中使用无菌试剂和器械进行。尽管目前使用的腺病毒株均为复制缺陷型，但大多数机构仍要求对腺病毒及重组DNA的使用进行审批。这通常包括将特定细胞培养室指定为可用于腺病毒生产与扩增的BSL2级认证设施。在病毒生产与纯化的各个阶段，一般需采取佩戴口罩、护目用具、手套以及适当的防护服装等安全措施。在进行离心操作时，若离心管无紧密贴合的盖子，则建议使用安全盖。所有非一次性材料，包括可能被污染的离心机安全盖、瓶子和转子，均需用抗病毒溶液处理（参见 材料表），然后用清水或70%乙醇冲洗。液体废弃物需加入漂白剂至终浓度10%（v/v）进行处理。这些液体废弃物的处置应遵循各机构的相关规定。固体废弃物通常应弃置于生物危害废物容器中。
<ol>
	<li>培养 HEK293T 细胞
	<ol>
		<li>将一管冻存的HEK293T细胞在37℃水浴中解冻 &#176;C，并使用5 mL移液管将细胞转移至直径15 cm的细胞培养皿中。用25 mL移液管缓慢加入20 mL含10%（v/v）胎牛血清和青霉素/链霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-FBS-PS）。将细胞置于37 &#176;C 细胞培养箱，充入 5% (v/v) CO₂2 直到细胞汇合度达到80%–90%（约2 × 107 细胞。</li>
		<li>使用连接至真空源的玻璃移液管吸除培养基，然后加入 20 mL 无菌 PBS（2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂PO₄，137 mM NaCl，8 mM Na₂HPO₄，pH 7.4）冲洗细胞2PO4，136.9 mM NaCl 和 8.9 mM Na2高磷酸盐血症4) 加入培养皿中，使用25 mL移液管。吸除用过的PBS，然后使用5 mL移液管加入3 mL预热（37 &#176;C）蛋白酶溶液（参见 材料表将培养皿放入细胞培养箱中孵育，直至细胞脱落（约3-4分钟）。 
		注意：可通过缓慢来回倾斜培养皿，观察细胞是否从培养皿各区域释放到流动的液体中，以最佳评估蛋白酶消化效果。HEK293T细胞对 prolonged 蛋白酶处理敏感，在蛋白酶溶液中放置数分钟后即会死亡。</li>
		<li>使用10 mL移液管将7 mL DMEM-FBS-PS转移至含有脱离细胞的培养皿中，然后用同一支移液管吸取细胞和培养基。将悬浮细胞转移至50 mL锥形管中，随后在低速临床离心机中以200 x g离心，使细胞沉淀。 g 5 分钟后，使用连接真空源的玻璃移液管吸除上清液。用 25 mL 移液管将细胞沉淀重悬于 15 mL DMEM-FBS-PS 中。</li>
		<li>向每个含有 19 mL DMEM-FBS-PS 的十五个 15 cm 培养皿中加入 1 mL 细胞悬液。</li>
		<li>在组织培养箱中培养细胞，直至细胞汇合度达到85%–90%（约3–4天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备稀释的病毒溶液
	<ol>
		<li>加入约 1.5 × 109 至 3 × 109 将现有病毒储备液（5-10 IVP/细胞）加入装有45 mL不含FBS和抗生素的DMEM的50 mL锥形管中。 
		注意：可以使用较低浓度的病毒（1-5 IVP/细胞）；然而，病毒的产生所需时间将更长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用病毒转染培养的细胞。
	<ol>
		<li>使用连接真空源的玻璃移液管，吸出第1.1.5步中接近汇合的细胞的培养基。</li>
		<li>使用25 mL移液管将3.0 mL稀释后的病毒溶液（按步骤1.2.1制备）转移至每个细胞培养皿中。然后使用10 mL移液管向每个培养皿中加入7.0 mL不含FBS或抗生素的DMEM培养基。将培养皿置于细胞培养箱中孵育60分钟，随后向每个培养皿中加入10 mL含有20%（v/v）FBS和2×PS的DMEM培养基。 
		注意：使用15个培养皿中的一个作为对照组（不添加病毒），有助于在下一步中识别病毒感染细胞后由病毒引起的细胞变圆和死亡现象。</li>
		<li>将细胞置于细胞培养箱中孵育 2-4 天，直至大多数细胞开始变圆 &#62;60% 的细胞已脱落。 
		注意：若使用较低滴度的病毒，细胞死亡可能需要长达一周时间才会发生。如果一周内未出现细胞死亡，则可能需要重复该过程，并使用更高滴度的病毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从细胞裂解液中回收病毒
	<ol>
		<li>使用细胞刮刀刮取每块培养皿底部，使贴壁细胞释放到培养基中。</li>
		<li>使用25 mL移液管，从每块细胞培养皿中收集并汇集培养基、细胞及细胞碎片至50 mL锥形细胞培养管中。 
		注意：为节约资源，可将两皿培养基合并至一个50 mL离心管中。</li>
		<li>通过低速台式离心机离心沉淀细胞材料：室温下3,000 x g离心5分钟 g使用连接真空装置的玻璃移液管吸除上清液。</li>
		<li>使用10 mL移液器结合吹打混匀，将所有离心所得沉淀物重悬于7 mL无菌过滤的含10 mM EDTA的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）（Tris-EDTA溶液）中。将混合液转移至无菌的15 mL细胞培养锥形管中，并置于冰上。 
		注意：此时，病毒制剂可在 -80 ℃ 冻存 &#176;C 无限期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备细胞裂解液
	<ol>
		<li>进行三次冻融循环，以破坏残留的细胞，从而进一步释放已形成的病毒颗粒。将步骤1.4.4中汇集的材料通过将管子浸入液氮中冷冻（约30-60秒），然后将管子置于37℃水中快速解冻。 &#176;C 培养箱中。将样品涡旋振荡 15 秒，然后重复快速冻融步骤 2 次。 
		注意：病毒溶液可在37℃下快速解冻 &#176;在水浴中融化，但需谨慎操作，因为温度波动可能导致试管破裂，使病毒溶液泄漏到水浴中。为防止此情况发生，应将含有病毒上清液的试管放入一个较大的试管中，再将该大试管置于水浴中。</li>
		<li>使用10 mL移液器将经过三次冻融的细胞材料转移至超速离心管中。在4℃条件下，以43,000 × g离心30分钟 &#176;C型超速离心机，转速约18,500 x g.</li>
		<li>用10 mL移液管回收约7 mL富含病毒的上清液，并转移至15 mL锥形管中。将样品置于冰上保存，直至进行下一步操作。 
		注意：此时可考虑保留一份未纯化的病毒上清液，作为启动新病毒制备（或作为备份）的前序步骤。将此份样品储存于 -80 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用密度梯度离心法分离和纯化病毒。
	<ol>
		<li>在12 mL PET薄壁透明超速离心管中制备CsCl不连续梯度（见 材料表) 或等效物。使用带有18 G针头的3 mL注射器，小心地将2.5 mL密度为1.4 g/mL的CsCl溶液注入管底，然后使用新的注射器/针头在其上层加入2.5 mL密度为1.25 g/mL的CsCl溶液。 
		注意：将溶液直接滴加到已有液层上方会导致显著且不期望的混合。应将针头的斜面部分紧贴试管边缘，然后非常缓慢地推动注射器活塞，随着溶液逐渐充满试管，同步缓慢抬高针头位置。</li>
		<li>使用10 mL注射器，以类似方式将约7 mL病毒上清液加至梯度液顶部。若病毒上清液与管口之间距离超过2-3 mm，可添加额外的Tris-EDTA溶液，直至管内剩余空间为2-3 mm。</li>
		<li>制备一根类似的平衡管，其中含有CsCl层，但用Tris-EDTA溶液替代病毒上清液。 
		注意：这两个离心管必须具有相同的重量（以及相似的密度），以防止超速离心机中出现可能危险的不平衡负载情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用速率区带超速离心法分离病毒。
	<ol>
		<li>将步骤 1.6.2–1.6.3 中形成的梯度液加入 SW41 转子或同等型号的离心桶中。拧紧桶盖，将转子放入已预冷至 4℃ 的超速离心机中 &#176;C），并在约 150,000 x g.</li>
		<li>离心过程中，将下方步骤 1.9.1 中所述的层析柱进行平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收分离的病毒颗粒
	<ol>
		<li>离心步骤结束后，小心地将离心桶从转子上取下，在细胞培养超净台内打开桶盖，取出离心管并放入试管架中。</li>
		<li>收集漂浮在1.25 g/mL与1.4 g/mL CsCl溶液界面处富含病毒颗粒的条带物质。将含有密度梯度的试管置于细胞培养皿的下半部分上方（用于接住可能洒出的液体），用连接3 mL注射器的1英寸18号针头小心刺穿试管，穿刺位置位于病毒条带下方。缓慢吸取病毒液，通常可回收约1 mL。</li>
		<li>将针头从管中取出，使梯度中剩余的材料流出管外，进入培养皿的下半部分（所有液体应作为危险废物处理）。</li>
		<li>将注射器中的病毒溶液转移至冰上预冷的无菌微量离心管中。 
		注意：在此步骤中回收病毒时，应将针头位置调整为针管腔朝上&#160;针尖位于病毒富集带下方几毫米处。避免被有时出现在病毒带上方2-3毫米处的、由组装异常病毒形成的细带污染（见细黑箭头所示）。 图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过凝胶过滤从样品中去除CsCl。
	<ol>
		<li>将预装有 Sephadex G-25M 的 PD-10 柱用 50 mL 0.2 &#181;m 经0.22 μm无菌滤膜过滤的PBS，含10%（v/v）甘油。 
		注意：初始平衡步骤需要 2-3 小时才能完成，这是为了确保彻底洗去制造商用于稳定色谱柱的防腐剂。</li>
		<li>让洗涤液液面降至烧结滤板（柱层析介质顶部的白色材料保护圆盘）以下，然后小心地将步骤1.8中收集的纯化病毒溶液转移至柱的顶部。待富含病毒的溶液液面降至烧结滤板以下后，开始用PBS-甘油填充层析柱。 
		注意：滤芯的功能之一是防止柱子流干。因此，在向柱子中添加更多洗脱液之前，允许有短暂的延迟。</li>
		<li>将洗脱液收集到12个无菌微量离心管中，每管0.5 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定病毒产量。
	<ol>
		<li>使用分光光度法确定病毒峰值组分。将每份组分用 PBS 稀释 1:100，测定 OD260 使用缓冲液单独稀释100倍作为空白对照，在分光光度计中测定。病毒颗粒应在空体积中洗脱，起始于约第6个组分。收集OD值最高的组分并合并260 读数</li>
		<li>将汇集的病毒组分做1:100稀释后重新测定OD260. 使用以下公式计算合并组分中病毒颗粒的最终浓度及IVP数量：每毫升病毒颗粒数 = OD260 &#215; 100（用于校正稀释倍数） &#215; 1012通常估计病毒颗粒中有1%具有感染性，因此：IVP/mL = OD260 &#215; 100 &#215; 1010 或 IVP/&#181;L = OD260 &#215; 100 &#215; 107.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将汇集的病毒组分（含有 5 x 107 至 1 × 108 IVP）加入无菌微量离心管或冻存管中。将样品于 -80 &#176;C.</li>
</ol>
2. 啮齿类动物膀胱的转导
注意：如果初次使用该技术，建议每次转导的动物数量限制在2至4只。可通过为每只动物错开开始时间来实现，特别是在步骤2.2的去垢剂处理阶段，以及步骤2.3的病毒孵育阶段。有经验的研究人员可同时转导最多六只动物。
<ol>
	<li>导尿管插入膀胱
	<ol>
		<li>使用带有鼻罩的麻醉机对雌性C57Bl/6J小鼠（通常为8–10周龄，体重约20–25 g）或雌性Sprague Dawley大鼠（通常为2–3月龄，体重约250 g）进行麻醉。将麻醉机校准至产生3.0%（v/v）异氟烷和97%（v/v）O₂的混合气体。2 用于小鼠或 4.0% (v/v) 异氟烷、96% (v/v) O₂2 针对大鼠。通过夹捏脚趾无反应（通常在1-2分钟后）确认动物已麻醉。</li>
		<li>将动物置于加热垫上以维持其体温。在整个转导过程中监测动物状态，确保动物处于麻醉状态，且在操作过程中无疼痛反应。</li>
		<li>将异氟烷浓度降低至小鼠1.5%（v/v）或大鼠2.0%（v/v），并在整个实验过程中维持动物处于麻醉状态。</li>
		<li>为防止向膀胱内引入空气，应将静脉注射导管的塑料导管部分充满（参见 材料表）并使用移液管用无菌 PBS 冲洗并连接至中心集液装置。</li>
		<li>将动物置于仰卧位，用70%酒精擦拭尿道外口，然后将无菌导管插入尿道外口，经尿道进入膀胱。
		<ol>
			<li>进行此操作时，使用精细镊子轻轻夹住形成尿道外口的组织，并将其垂直向外牵拉，远离动物体。用另一只手将导管小心地垂直插入尿道外口约3-4 mm（位于阴道开口上方的一小块肉质隆起处）。由于尿道存在弯曲，随后应将已插入尿道外口的导管向动物尾部方向轻柔下压，以使其顺利进入经由耻骨下方延伸的尿道段，最终进入膀胱 
			注意：尤其是对于小鼠，导管可能过长，插入动物体内的长度不应超过1.0–1.1 cm，否则将导致膀胱黏膜损伤。为避免此情况，应在导管尖端下方约1 cm处做标记，并确保导管插入不超过该标记处。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让膀胱中的尿液漏出。通过执行Credé法清除残留尿液。&#233;&#39;s 操作：按摩并轻轻按压下腹部区域的膀胱隆起处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用去垢剂溶液处理尿路上皮，使其易于转导。
	<ol>
		<li>通过将装有 PBS 的无菌 1 mL 注射器连接到导管接头，冲洗小鼠或大鼠膀胱。注入 100 &#181;毫升无菌 PBS 注入小鼠膀胱（或 450 &#181;L（大鼠膀胱情况下）。将注射器从导管接头处取下，使 PBS 排出。如有必要，可实施克雷德法以排出膀胱内多余液体。</li>
		<li>灌注 100 &#956;0.1% (w/v) N-十二烷基-β-巯基乙醇溶液&#946;-D-麦芽糖苷（DDM）（溶于 PBS 和 0.2 &#181;m 滤膜除菌）通过无菌 1 mL 注射器注入小鼠膀胱。通过保留注射器在原位，使 DDM 在膀胱内保留 10 分钟。在大鼠中，DDM 的体积增加至 450 &#181;L.</li>
		<li>通过取下注射器使 DDM 从膀胱中排出。必要时进行 Crede 手法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将病毒注入膀胱。
	<ol>
		<li>将无菌的1 mL注射器连接至导管接头，注入0.5 × 107 至 1 × 108 腺病毒（在步骤1中制备）经100 μL稀释后经静脉注射 &#181;毫升无菌 PBS（用于小鼠）或 450 &#181;将1毫升（大鼠用L）注入膀胱。保持注射器与导管连接，以防止病毒溶液溢出。</li>
		<li>30分钟后，取下注射器，使病毒溶液排入一次性垫巾中。用吸水纸巾吸去残留的病毒溶液，并将垫巾和纸巾丢弃至生物危害废物容器中。 
		注意：甘油具有细胞毒性，因此小鼠灌注病毒溶液的最大体积限制为5 μL。 &#181;L（稀释至100时） &#181;PBS 的体积将导致最终甘油浓度约为 0.5% [v/v]）。此外，可通过增加灌注的病毒颗粒数（IVP）以及将病毒孵育时间延长至 45 分钟来提高转导效率。</li>
		<li>可选步骤：可按照上述步骤 2.2.1 中所述用 PBS 冲洗膀胱；但此步骤并非必需。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让动物恢复。
	<ol>
		<li>停止异氟烷的气流，待动物恢复并能完全自主活动后，再将其放回笼中，尤其是当动物为群养时。 
		注意：由于病毒转导 本身 如果没有引起可观察到的下尿路症状或疼痛，通常不需要术后治疗。然而，如果所编码的转基因具有毒性，则根据机构要求，术后可能需要使用镇痛剂或抗生素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在处理后12至72小时内，采用mRNA等方法分析转基因表达的影响 原位 杂交、蛋白质印迹或免疫荧光9,10,23 （参见代表性结果）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管 Ramesh 等人致力于开发利用腺病毒转导治疗膀胱癌的策略18，最近的报告已证明这些技术在研究正常尿路上皮生物学/生理学及病理生理学方面的实用性10,18,19,20,21该方法的重要特征包括：（i）在整个啮齿类动物膀胱壁中，&#160;仅尿路上皮被转导10,19,20,21,22在大鼠中，转导主要局限于伞细胞层，而在小鼠中，整个尿路上皮均...

尿路上皮是衬覆于肾盂、输尿管、膀胱及近端尿道的特化上皮组织1它由三层结构组成：最表层为高度分化且具有极性的伞细胞层，常含有双核，其顶面与尿液接触；中间层为过渡扩增细胞层，其中部分细胞为双核，可在表层伞细胞急性丢失时生成新的伞细胞；最底层为单层基底细胞，其中一部分具有干细胞功能，能够在慢性损伤后再生整个尿路上皮。伞细胞主要负责形成高电阻的尿路上皮屏障，该屏障的组成包括顶膜（富含胆固醇和脑苷脂），对水和溶质具有低通透性，以及高电阻的顶侧连接复合体（由紧密连接、黏附连接、桥粒及相关的肌动球蛋白环构成）。1膀胱充盈期间，伞细胞的顶面及其连接环均会扩张，并在排尿后迅速恢复至充盈前状态1,2,3,4,5除了在屏障功能中的作用外，尿路上皮还被认为具有感觉和信号转导功能，可感知细胞外环境的变化（例如牵张），并传递这些信息 通过 向下方组织（包括尿路上皮下传入神经末梢）释放介质（如ATP、腺苷和乙酰胆碱）6,7,8. 在缺乏尿路上皮表达两种尿血小板溶素的 小鼠中，近期发现了支持这一作用的证据 Piezo1 和 Piezo2，这会导致排尿功能改变9此外，在伞细胞层中过表达紧密连接孔道形成蛋白CLDN2的大鼠会出现类似于间质性膀胱炎患者所见的炎症和疼痛。10据推测，尿路上皮感觉/转导功能或屏障功能的破坏可能与多种膀胱疾病有关6,11.
要更好地理解尿路上皮在正常和疾病状态下的生物学特性，依赖于能够方便地使内源性基因表达下调或在天然组织中表达外源基因的工具。虽然一种下调基因表达的方法是构建条件性尿路上皮基因敲除小鼠，但该方法受限于携带flox等位基因的小鼠是否可及，且耗时耗力，通常需要数月甚至数年才能完成12。因此，研究人员已开发出转染或转导尿路上皮的技术，可在较短时间内获得实验结果。已发表的转染方法包括使用阳离子脂质13、反义硫代磷酸化寡脱氧核苷酸14，或与HIV TAT蛋白穿膜11肽偶联的反义核酸分子15。然而，本实验方案的重点是利用腺病毒介导的转导技术，这是一种经过充分研究的方法，可高效地将基因递送至多种细胞类型，已在大量临床试验中得到验证，最近还被用于向某种新冠疫苗受试者递送编码新冠病毒衣壳蛋白的cDNA16,17。关于腺病毒生命周期、腺病毒载体及其临床应用的更详尽描述，读者可参考文献17。
利用腺病毒转导尿路上皮的一个重要里程碑是Ramesh等人发表的一项研究报告，该研究显示，使用去垢剂（包括N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，DDM）进行短时间预处理，可显著增强携带β-半乳糖苷酶基因的腺病毒对尿路上皮的转导效率18。以此项原理验证研究为指导，目前腺病毒介导的尿路上皮转导已被用于表达多种蛋白质，包括Rab家族GTP酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子、肌球蛋白马达片段、成孔型紧密连接相关蛋白claudin以及ADAM1710,19,20,21,22。相同的方法也被改造用于表达小干扰RNA（siRNA），其效应可通过共表达对siRNA具有抗性的转基因变体得以挽救22。本文所述方案包括高效制备高浓度腺病毒大量制剂的一般方法——这是实现上述技术所必需的步骤，同时也整合了Ramesh等人18所建立方法的改进，以实现转基因在尿路上皮中的高效表达。

<table><tbody><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>无菌，血清移液管，独立包装</td></tr><tr><td>12 mL 超速离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>PET 薄壁超速离心管</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td>无菌</td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305196</td><td>18 G × 1.5 英寸针头</td></tr><tr><td>20 mL 移液管</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>无菌，血清移液管，独立包装</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td>无菌</td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>无菌，血清移液管，独立包装</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>抗病毒溶液</td></tr><tr><td>细胞培养皿 - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>无菌，组织培养处理&amp;nbsp;（150 mm × 25 mm 培养皿）</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>手柄长度 24 cm，刀片长度 1.7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306</td><td>分子生物学级 &amp;ge; 98%</td></tr><tr><td>DMEM 培养基（高葡萄糖）</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>含 4.5 g/L 葡萄糖 + L-谷氨酰胺 + 酚红</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>生物超纯级 &amp;ge; 99%</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>定义型血清</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5.75 英寸玻璃移液管，已高压灭菌</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>分子生物学级 &amp;ge; 99%</td></tr><tr><td>HEK293 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T 细胞是表达 SV40 大 T 抗原的 HEK293 细胞变体</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>小鼠静脉导管</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G × 3/4 英寸安全静脉导管&amp;nbsp;具射线不透性</td></tr><tr><td>大鼠静脉导管</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G × 1 英寸安全静脉导管，具射线不透性</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>分子生物学级 &amp;ge; 99%</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>细胞培养级&amp;nbsp; &amp;ge; 99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Millipore Sigma</td><td>431478</td><td>&amp;nbsp;&amp;ge; 99.99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>分子生物学级 &amp;ge; 99%</td></tr><tr><td>N-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4641</td><td>&amp;nbsp;&amp;ge; 98%</td></tr><tr><td>多动物用鼻罩</td><td>定制设计</td><td></td><td>商业可选产品包括 Parkland Scientific（RES3200）提供的型号</td></tr><tr><td>PD-10 柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>预装 Sephadex G-25M 的层析柱</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素抗生素（100 倍浓缩液）</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100 倍浓缩溶液</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>BioPhotometer</td><td></td></tr><tr><td>支架和夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q 和 05-769-8FQ</td><td>可从多家供应商处获得</td></tr><tr><td>无菌滤器单元</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 &amp;micro;m 快流速滤器单元（150 mL）</td></tr><tr><td>无菌滤器单元 0.2 &amp;micro;m（注射器式）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>可连接至注射器的 Millipore Sigma Milex 0.22 &amp;micro;m 滤器单元</td></tr><tr><td>超高速离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5810R</td><td>配备 Eppendorf F34-6-38 固定角转子（12,000 rpm）</td></tr><tr><td>注射器（1 mL）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td>1 mL 鲁尔锁头注射器 - 无菌</td></tr><tr><td>注射器（3 mL）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309656</td><td>3 mL 滑动头注射器 - 无菌</td></tr><tr><td>台式离心机（低速）</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5702</td><td>配备摆桶转子</td></tr><tr><td>移液管（转移用）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>聚乙烯 3.4 mL 转移移液管</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>分子生物学级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE 选择性蛋白酶溶液</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>TrypLE Express 酶（1 倍浓度），不含酚红</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>配备 Beckman SW41 转子（41,000 rpm）</td></tr><tr><td>挥发器&amp;nbsp;</td><td>General Anesthetic Services, Inc.</td><td>Tec 3</td><td>异氟烷挥发器</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>模拟式涡旋混合器</td></tr></tbody></table>

利用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿路上皮中表达外源基因

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

除了形成高电阻屏障外，覆盖于肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道的尿路上皮还被认为能够感知并传递其环境信息至下方组织，从而促进排尿功能与行为。尿路上皮屏障或其感觉/转导功能的破坏可能导致疾病。目前缺乏简单有效的方法来改变尿路上皮中的基因和蛋白表达，这限制了对这些复杂事件的研究。本文所述方法可使研究人员高效、简便地制备大量高滴度的腺病毒，用于高效转导啮齿类动物的尿路上皮。通过腺病毒转导可表达cDNA和小干扰RNA，并可在转导后12小时至数天内评估外源基因表达对尿路上皮功能的影响。这些方法在利用小鼠或大鼠动物模型研究正常与异常尿路上皮生物学方面具有广泛的应用价值。

病毒制备 
通过密度梯度离心纯化病毒的一个示例如图1A所示。在所加载的细胞材料与1.25 g/mL CsCl层之间的界面处可见浅粉红色条带，主要由破裂的细胞及其碎片组成（见图1A中的紫色箭头）。其略带粉红的颜色来源于步骤1.5中残留的少量培养基。目标病毒颗粒呈乳白色条带，位于1.25 g/mL CsCl与1.40 g/mL CsCl溶液之间的界面处（见图1A中的黄色箭头）。此外，还可观察到在富集的病毒颗粒上方2–3 mm处漂浮的一条物质带（见图1A中的细黑箭头），其成分为未组装的病毒颗粒和碎片，几乎不含完整病毒粒子（IVP），在收集病毒样品时应避免采集此部分。
使用 PD10 柱进一步纯化病毒并进行缓冲液置换的过程如图 1B所示，洗脱后各组分的 O...

本文描述了大量制备重组腺病毒的方法，这些病毒可用于转导天然啮齿类动物尿路上皮，从而实现外源基因的表达或内源性基因产物的下调。

除了形成高电阻屏障外， lining 肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道的尿路上皮还被假定具有感知……的功能

本方案描述了可在天然膀胱尿路上皮中表达cDNA或siRNA的研究方法。该技术的主要优势在于操作相对简便，能够高效地在尿路上皮中表达cDNA和siRNA，且耗时较短。该技术最难的部分在于导管插入操作。然而，一旦掌握，该整体技术相对容易精通。演示该操作的将是本实验室的四级研究专家 Giovanni Ruiz。首先，将麻醉后的小鼠放置在靠近鼻罩的加热垫上。在整个实验过程中保持动物处于麻醉状态。通过脚趾夹捏确认小鼠已完全麻醉。为防止空气进入膀胱，使用无菌移液管或注射器将无菌 PBS 注入静脉留置针的塑料导管部分及其连接头内，使其充满。将动物置于仰卧位后，用70%酒精擦拭尿道外口。然后用精细镊子轻轻夹住构成尿道外口的组织，并将其垂直向外牵拉。将无菌导管插入尿道外口。用另一只手小心地将导管垂直插入尿道口约三到四毫米。然后将已插入外尿道口的导管朝动物尾部方向下压，以使其更容易进入经由耻骨下方通向膀胱的尿道部分，最终进入膀胱。让膀胱中的尿液自然流出。通过在腹部下区的膀胱隆起处进行按摩并轻柔下压，实施克雷德法（Crede's maneuver）以排出残留尿液。为使尿路上皮易于转导，将装有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌1毫升注射器连接至导管接头，冲洗小鼠或大鼠膀胱。向小鼠膀胱内注入100 µL无菌PBS。将注射器从导管接头取下后，让 PBS 自然排出。使用无菌的 1 毫升注射器，向小鼠膀胱内灌注 100 微升溶于 PBS 中并经 0.2 微米滤器过滤除菌的 0.1% N-dodecyl-beta-D-maltoside。通过保持注射器原位，使 N-dodecyl-beta-D-maltoside 在膀胱内保留 10 分钟。通过取下注射器并让其自然排出，将十二烷基-β-D-麦芽糖苷从膀胱中去除。为将病毒导入膀胱，将一支无菌的1毫升注射器连接至导管接头，并向膀胱内注入5,000,000至100,000,000 IVP的腺病毒，该病毒已用100微升无菌PBS缓冲液稀释（小鼠）或450微升（大鼠）。30分钟后，取下注射器，使病毒溶液排空至一次性吸水垫上。用吸水纸巾擦去残留的病毒溶液，并将垫料和纸巾丢弃至生物危害废物容器中。为使动物恢复，停止异氟烷气流。在将动物放回笼中前，应确保其已恢复并能完全自主活动，特别是对于群养动物更需注意。在处理后12至72小时内，使用mRNA原位杂交、蛋白质印迹或免疫荧光等方法分析转基因表达的效果。对尿路上皮裂解物进行蛋白质印迹分析，结果显示在转导的膀胱尿路上皮中存在V5标签的人类生长激素表达，而在未转导的膀胱中则无表达。通过使用识别人类生长激素或V5表位标签的抗体进行免疫荧光染色，也证实了该表达。 Western blot 分析证实，在转导了腺病毒的大鼠中存在 Claudin-2 的表达，而在转导了对照性编码 GFP 病毒的大鼠中则无表达。免疫荧光分析进一步证实，在转导了编码 Claudin-2 cDNA 病毒的尿路上皮伞细胞中存在外源性 Claudin-2 的表达。通过免疫荧光和共聚焦显微镜对完整铺片或横切尿路上皮进行检测，发现 Tight Junction Protein 1 中存在紧密连接结构以及 Claudin-2 在细胞质内的胞内积聚现象。图像结果显示，通过计数转导的伞状细胞数量，发现转导效率接近95%；在整个膀胱壁中，仅有尿路上皮被转导，灌注的腺病毒未靶向其他任何组织。导尿操作对于该实验方案的顺利实施至关重要。该技术可使研究人员研究正常的尿路上皮生物学特性，同时也有助于理解蛋白质过表达或低表达所导致的疾病状态。

expression-transgenes-native-bladder-urothelium-using-adenovirus

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿氦中表达转基因

小鼠膀胱壁注射是一种用于原位研究膀胱干细胞和癌症生物学的有效方法。这种精细的显微外科技术通过严谨的操作和反复练习即可掌握。...

小鼠膀胱壁注射

建立原位膀胱肿瘤模型，以评估经膀胱内递送的saRNA的抗肿瘤效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。...

一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射saRNA治疗的评价

本视频展示了利用尿道插管与电穿孔技术相结合的方法，将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮。所述操作步骤可用于建立小鼠膀胱癌模型。...

将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮：一种基于电穿孔的高效递送方法，用于在小鼠膀胱尿路上皮细胞中导入DNA质粒以构建基因工程模型

将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49...

用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

为了测试靶向MUC1的免疫疗法，在人黏蛋白1（MUC1）转基因小鼠中建立了由N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺诱导的膀胱癌模型。给予MUC1靶向多肽疫苗后，通过检测血清细胞因子水平和T细胞特异性活性，证实了针对MUC1的细胞毒性T淋巴细胞反应。...

在免疫系统完整的人源MUC1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

本方案描述了一种新建立的将病毒递送至小鼠前列腺的方法。该技术可通过CRISPR/Cas9技术、基因过表达或Cre重组酶递送，实现基因表达的原位调控，并建立一种新型的小鼠前列腺癌模型。...

病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因改造

我们介绍一种将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮细胞的新方法 体内...

通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

本方案提供了建立源自致癌物诱导的小鼠膀胱癌的膀胱肿瘤类器官的三维体外培养的详细实验步骤。文中描述了肿瘤类器官的传代、基因工程改造以及原位移植等培养方法。...

小鼠膀胱肿瘤类器官的培养、操作及原位移植

本方案描述了携带目的基因缺失的小鼠尿路上皮类器官的生成与表征过程。方法包括小鼠尿路上皮细胞的获取、 离体 使用带有CMV启动子驱动Cre表达的腺病毒进行转导，以及 体外 以及 体内...

Ex Vivo 腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

本方案描述了一种利用荧光Ca²⁺成像技术评估天然尿路上皮细胞中机械激活离子通道功能的方法2+ 传感器...

离体分析尿路上皮细胞中机械激活的Ca2+瞬变

了解利用重组腺病毒在天然啮齿动物膀胱尿路上皮中高效表达cDNA和siRNA的方法。该技术转导效率接近95%，有助于深入研究尿路上皮基因功能及相关疾病机制。

利用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿路上皮中表达外源基因

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