实时空斑检测法

本报告中所述方法可用于研究健康和疾病状态下自主排尿的生理学及神经行为学特征。该技术使我们能够监测小鼠在昼夜明暗周期中的排尿行为，并提供关于排尿事件的时间、空间和尿量信息。为准备实时排尿斑点检测（real-time void spot assay，RT-VSA）记录装置，请根据一天中的不同时段，在RT-VSA记录笼底部放置一张薄或厚的滤纸。

在滤纸上方放置一个塑料圆顶小屋作为小鼠的睡眠空间；一个无菌的1.5 ml 微量离心管用于富集目的；一个60 mm × 15 mm的塑料培养皿，内含两到三块小鼠干燥饲料；以及以凝胶包形式提供的14至16克水。记录室准备就绪后，将小鼠轻柔地放置在滤纸表面。确保将小鼠从饲养笼转移到记录笼的过程中尽可能减少应激。

将小鼠放入记录笼后，盖上笼盖，并用吸水性蓝色实验台垫覆盖笼盖顶部，以尽量减少环境光在亚克力笼盖表面产生的直接反射。打开下层腔室的紫外灯。使用视频监控录制软件，通过已配置为可同时从多个网络摄像头或网络连接摄像头录制的系统，分别从顶部和底部摄像头记录RT-VSA视频。

在程序窗口中按下 Cmd R 开始录制。以每秒一帧的速度进行视频录制。启动录制后，立即离开房间并轻轻关闭房门。

确保整个实验过程中房间保持安静。按下 Cmd T 停止录制。关闭紫外灯。停止录制后，软件会自动为每台相机生成一个 m4v 格式的视频文件，并将其保存在先前选定的目标文件夹中，文件名与相机名称一致。

确认每个相机的文件夹中，实验数据已按日期整理为相应的文件夹。在每个日期或实验文件夹中，确认包含一个 m4v 文件以及与该视频每一帧对应的全部独立 jpeg 文件。在桌面上创建一个以实验名称和日期命名的文件夹，并将 m4v 文件复制到该文件夹中。

将电影文件夹复制到U盘，以便在外部计算机上进行分析。打开底部相机在光照阶段或顶部相机在黑暗阶段采集的视频文件以进行分析。在评估视频质量后，使用快进命令或时间轴滑块跳转至正确的时间窗口，进而分析实验数据。

在光照期的排尿活动记录时间为上午11:00至下午5:00，在黑暗期的记录时间为午夜至凌晨6:00。通过点击快进图标以快进模式播放视频，或手动滚动视频画面，寻找小鼠排尿的证据。注意观察滤纸上是否突然出现明亮的尿液斑点，或小鼠是否出现行为变化，例如移动至笼子角落以及排尿时短暂的静止状态。记录每次排尿发生的具体时间。

按照惯例，排尿时间以首次检测到尿液的时刻为准。进行排尿测量时，首先使用滚动条前后移动时间，寻找尿液斑点扩散达到最大的时间点。在此时刻暂停视频，将电脑鼠标箭头置于待分析的斑点下方，以在截图中标记出感兴趣的区域。

使用相关的编号命名截图文件，以表示其在视频中出现的顺序。当所有空白区域分析完成后，通过截取滤纸图像并勾画滤纸的边界，测量滤纸的总面积。计算每个尿液斑点所占的面积百分比。

使用绘图软件中的校准曲线和插值函数，将每次排尿斑点的面积百分比数值转换为尿液体积。记录了雌性和雄性Piezo1、2基因敲除小鼠及对照小鼠在昼夜周期中黑暗期和光照期的排尿行为。在它们不活跃的光照期，与对照组相比，雌性或雄性基因敲除小鼠在所分析的任何参数上均未观察到显著差异。

然而，在活跃的黑暗期，雌性和雄性基因敲除小鼠表现出排尿表型的改变，其特征是微小排尿斑点的数量和总体积显著增加。与对照组小鼠相比，雌性或雄性基因敲除小鼠在主要排尿斑点或PVS数量、每个PVS的平均体积以及PVS总体积方面均无显著差异。在基础条件下以及环磷酰胺处理后，检测了雌性小鼠的排尿行为。

与基础状态相比，环磷酰胺处理后每次排尿的尿量减少，且排尿次数显著增加。确保实验可重复性的关键之一是在整个测试期间尽可能轻柔地操作动物，并将其应激程度保持在最低水平。由于该检测为非侵入性实验，后续还可进行其他操作，包括流式细胞术和肌电图检测，以分别评估膀胱和尿道外括约肌的功能。

实施该技术将使研究人员能够明确特定通路在健康和疾病状态下对排尿行为的贡献。