实时空隙点测定

本报告中描述的方法可用于了解健康和疾病状态下自愿排尿的生理和神经行为方面。这种技术使我们能够监测小鼠在一天的明暗阶段的体积行为，并提供有关排尿事件的时间、空间和体积信息。要制备实时空隙点测定或 RT-VSA 记录室，请根据一天中的时间在 RT-VSA 记录笼的底部放置一张薄或厚的滤纸。

在滤纸的顶部，放置一个用于睡眠空间的塑料冰屋;一个用于富集目的的无菌1.5ml微量离心管;和一个60 mm x 15 mm的塑料培养皿，其中包含两块或三片小鼠干食物;和14至16克凝胶包形式的水。记录室准备就绪后，将鼠标轻轻放在滤纸上。确保鼠标从外壳笼转移到记录笼时应力最小。

鼠标进入记录笼后，放置盖子并用吸收剂长凳蓝色垫覆盖盖子的顶部，以尽量减少有机玻璃盖表面上的直接环境光反射。打开下腔室的紫外线灯。要从顶部和底部摄像机录制RT-VSA视频，请使用配置为同时从多个网络摄像头或网络摄像机录制的视频监控录制软件。

通过在程序窗口中按Cmd R开始录制。以每秒一帧的速度执行视频录制。开始录音后，立即退出房间并轻轻关上门。

确保整个实验期间房间保持安静。按 Cmd T 停止录制，关闭紫外线灯。停止录制后，软件会为每个摄像机自动生成一个m4v格式的电影文件，并将其以摄像机名称保存在先前选择的目标文件夹中。

验证在每个相机的文件夹中，实验是否按日期组织到文件夹中。在每个日期或实验文件夹中，验证是否存在一个 m4v 文件以及与每个影片帧对应的所有单个 jpeg 文件。在桌面上创建一个包含实验名称和日期的文件夹，并将 m4v 文件传输到此文件夹中。

将电影文件夹复制到闪存驱动器中，以便在外部计算机上进行分析。打开底部相机在亮阶段或上相机在暗阶段收集的动画文件进行分析。评估影片质量后，通过使用快进命令或时间栏滑块移动到正确的时间窗口来分析实验。

在上午 11:00 至下午 5:00 之间记录光照阶段的排尿活动，在黑暗阶段，在午夜和早上 6:00 之间记录排尿活动。通过单击快进图标以快进模式播放电影，或手动滚动电影，寻找鼠标正在排空的证据。寻找滤纸上突然出现明亮的尿点或行为变化，包括向笼子角落移动和小鼠排尿时短暂的不活动。记录每个空隙发生的时间。

按照惯例，排尿的时间是在检测到尿液的第一个迹象时记录的。要测量空隙，首先使用滚动条向前或向后移动，寻找尿点发生最大扩散的点。此时暂停电影，并将计算机鼠标箭头放在分析的点上，以标记屏幕截图中感兴趣的点。

使用相关编号命名屏幕截图文件，以说明影片中的出现顺序。分析完所有空隙点后，通过捕获屏幕截图并描绘滤纸的边框来测量滤纸的总面积。计算每个尿点的百分比面积。

使用校准曲线和绘图软件中的插值功能将百分比面积的值转换为每个空隙点的尿液体积。在白天的黑暗和光明阶段记录雌性和雄性Piezo1，2，敲除和对照小鼠的排尿行为。在它们的非活性光阶段，与对照组相比，在分析雌性或雄性敲除小鼠的任何参数中没有观察到显着差异。

然而，在活跃的暗期，雌性和雄性基因敲除小鼠表现出改变的排尿表型，其特征在于小空隙斑点的数量和总量显着增加。与对照组小鼠相比，雌性或雄性敲除小鼠的原发性空隙斑点或PVS数量，每个PVS的平均体积或总PVS体积没有显着差异。在基础条件下和环磷酰胺处理后测试雌性小鼠的排尿行为。

与基础条件相比，环磷酰胺治疗后每个排尿的尿量较小，排尿事件更频繁。检测重现性的一个关键方面是尽可能轻柔地操作动物，并在整个测试期间将它们保持在最小的压力下。由于这是一种无创检测，之后可以进行其他程序，包括细胞术和肌电图，以分别评估膀胱和尿道外括约肌功能。

实施这项技术将使研究人员能够定义特定途径对健康和疾病状态下排尿行为的贡献。