Name: 大鼠 离体 肺灌注模型的设计和实现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: 了解大鼠离体肺灌注模型的设计与实现方法，学习气管切开、插管和灌注技术。该模块化实验装置成本低廉，可在受控环境中维持肺活力长达150分钟，适用于心肺复苏及呼吸功能研究。

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部分支持来自美国退伍军人事务部生物医学实验室研究的优异奖评审（101 BX003482）&amp;#38;D 服务、美国国立卫生研究院资助（5R01 HL123227）、美国心脏协会变革性项目奖（962204）以及授予瑞斯博士的机构资金。巴尔泽博士获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的独立资助，项目编号为 BA 6287/1-1。作者谨此感谢 Matthew D. Olsen、Chun Zhou、Zhu Li 和 Rebecca C. Riess 为本研究作出的宝贵贡献。

实验的体内部分（从全身麻醉到安乐死）需事先获得相应的机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本文所述所有操作步骤均已获得范德堡大学医学中心（美国田纳西州纳什维尔）IACUC的批准（方案编号 M1700168），并遵循ARRIVE指南14执行。在开始实验前，所有大鼠均饲养于本机构的动物护理设施中，可自由获取水和食物。除本论文范围之外的其他研究外，截至目前我们共使用了148只雄性Sprague Dawley大鼠，年龄为7至10周，体重介于250 g至400 g之间。
1. 仪器装置的构建
注意：所有部件及其相应制造商均列于材料表中。
<ol>
	<li>为固定每件设备，构建一个定制的支架结构，以便于灵活配置并整合新设备（图1）。使用十字夹具将铝制杆（长度1至2英尺，直径1厘米，可在任何五金店购买）相互连接，形成一个三维支架结构，并将其放置在塑料托盘（30英寸×21英寸）上，以防止液体溢出。</li>
	<li>将压力传感器安装至与肺部等高的位置，并将其连接至肺动脉（PA）、肺静脉（PV）以及通气管路。 
	注：这些传感器将数据传输至连接到数据采集系统（DAQ）及其软件的相应生物放大器。</li>
	<li>不使用市售的套管，而是使用2 mm宽的硬质塑料管段手工制作定制套管（图2），将其末端用明火加热扩口，以便牢固地打结固定缝线。将套管弯成U形，以减少悬挂时对肺部的应力，并使其适配肺腔。</li>
	<li>为构建肺组织通气和灌注的腔室，将一个1,000 mL烧杯置于一个1,500 mL烧杯内，在两者之间及1,000 mL烧杯内部注入水浴，形成双层加热装置。将这对烧杯置于设定为48 °C的加热板上，从而创建一个既保持湿润又抗温度波动的肺腔环境。</li>
	<li>将实验用缓冲液置于150 mL容量瓶中，并将容量瓶放在设定为37 °C的加热板上。使用磁力搅拌子在烧杯内循环缓冲液。调节缓冲液弯月面高度，使其高于肺组织4 cm，以在肺静脉（PV）上形成4 cmH2O的固有压力。在手术过程中，确保动物肺部与缓冲液处于相同高度，以减少静水压性肺水肿的形成。 
	注：使用容量瓶可最小化与空气接触的表面积，从而减少气体扩散。</li>
	<li>使用蠕动泵将缓冲液经由加热线圈和除气装置组成的回路输送至肺组织灌注。将来自肺静脉（PV）的流出液回收至容量瓶中。将加热线圈和除气装置均连接至另一个设定为37 °C的循环水浴。根据泵速调节水浴温度，使灌注液始终保持37 °C的恒定温度。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>实验开始前，准备好实验装置。
	<ol>
		<li>确保软件正在运行（见下文）并正确采集数据。</li>
		<li>每天校准所有压力传感器，以确保其读数无漂移。</li>
		<li>制备缓冲液（参见 表1 用于配制含4%牛血清白蛋白（BSA）的生理盐水溶液的成分，并使用HCl调节pH至7.4。使用预热的缓冲液建立灌流系统（表1) 在整个系统中循环，确保无气泡存在。在实验开始前至少30分钟加入BSA，以保证其充分溶解。若无氧合器，可在加入BSA前，用含65% N₂的混合气体向灌注缓冲液中通气。2，30% O₂2，以及5% CO2 模拟 CO2 水平 体内 肺。这可以防止加入BSA后溶液起泡。</li>
		<li>准备好手术区域，放置所有必要的手术器械、缝线和胶带。将手术板倾斜15°角，使麻醉后的大鼠头部高于身体其他部位，便于操作气管及心肺组织块。</li>
		<li>穿戴适当的个人防护装备，称量大鼠体重，并腹腔注射戊巴比妥钠（65 mg/kg）-110分钟后，使用足趾夹捏法确认是否已达到外科麻醉水平。如有必要，追加麻醉剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大鼠转移至手术区域，并用胶带将其前肢分别固定于手术板上，随后将后肢并拢固定，确保前肢的固定松紧适度，以便在麻醉深度不足时能够观察到疼痛反射图3A).</li>
	<li>用一条长而细的胶带在门齿后方固定大鼠的嘴部，以固定其头部，注意不要限制舌头或气流，确保仍在自主呼吸的大鼠呼吸通畅（图3B).</li>
	<li>使用镊子夹住气管上方的皮肤，用手术剪剪开，进行气管切开术。用弯头镊子钝性分离肌肉和组织，以暴露气管。确保此步骤中无出血。
	<ol>
		<li>将弯钳穿过气管下方，打开钳子以留出空间，便于将3-0缝线从下方穿过，随后可预先打成方结图3B在气管软骨环之间做一个小切口，插入气管插管（用胶水将直径1 mm的导管固定在改良的18 G针头尖端以形成凹槽）。结扎缝线，确保气管切口无气体泄漏，且插管对气管无任何牵拉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将呼吸机设置为使用以下气体混合物运行 30% O2，5% CO₂2，以及 65% N2，其中包含一个 潮气量（VT） 的 10 mL/kg，一个 呼气末正压（PEEP） 的 0 cmH₂O2O，以及一个速率 60 次呼吸/分钟.</li>
	<li>气管插管固定后，立即按照上述参数开始对大鼠进行通气。 
	注意：所采用的手术方法改编自 Nelson 等人。9 并逐步进行描述。</li>
	<li>使用大型手术剪和镊子去除大鼠腹部的毛发。 
	注意：实验开始前也可使用脱毛膏进行脱毛。</li>
	<li>用镊子夹住剑突，于肋骨下方做一较小的横向切口，确保膈肌保持完整。待内脏可安全暴露后，扩大横向切口以充分暴露整个膈肌。</li>
	<li>极度小心以避免刺破肺部，注射肝素（3,000 U/kg）-1) 用22 G注射器注入下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>再次用镊子夹住剑突，沿胸骨向头侧剪开，同时持续观察肺部，以防剪到。</li>
	<li>为了清晰观察心肺块，使用两把大镊子将肋骨向外撑开，注意避免折断肋骨，以免尖锐的骨碎片刺穿肺组织。图3C). 
	注意：一旦打开胸腔，应使用 2–3 cmH₂O 的呼气末正压（PEEP）。2O，由连接在呼吸机呼气支上的水封瓶设定，以避免肺不张。</li>
	<li>此时，切断下腔静脉以放血处死大鼠。需仔细确保自肝素注射（见步骤2.9）后已至少间隔1分钟，以保证肝素充分循环，防止肺部形成微小血栓。</li>
	<li>放置灌注导管时，需持续监测压力，以确保未发生突然变化。 
	注意：泵以恒定速度运行时，压力突然升高表明发生了堵塞，而压力突然下降则可能表明存在泄漏。</li>
	<li>修剪多余的胸腺组织，以便更清晰地观察肺血管结构。找到肺动脉（PA），将小型弯钳从其下方穿过，再次将3-0缝线从下方穿过，并预先打成方结。</li>
	<li>在心脏右心室做一小切口，插入肺动脉导管（由直径为2 mm的塑料管制成，末端经明火加热扩口，以便缝合固定），操作轻柔，避免损伤邻近动脉。用缝线固定导管后开始灌注，起始流速为1.5 mL/min-1 (图3D).</li>
	<li>立即切除心脏心尖部分，以防止肺部压力积聚。使用小型弯头镊子刺破二尖瓣，并目视确认镊子能够无阻碍地进入左心房。</li>
	<li>在心房下方放置预先打结的3-0缝线环绕心脏（图3E).</li>
	<li>将PV导管（结构与PA导管相似）插入左心房，并在结扎缝线前确保缓冲液可从中流出。 
	注意：必须将肺静脉导管置于二尖瓣远端，以确保能够正确结扎，同时不可插入过深，以免损伤肺静脉或阻碍血流图3E结扎缝线时需格外小心，结扎过松会导致血流丢失，而结扎过紧则可能损伤心脏，削弱插管的固定效果，并可能导致泄漏。</li>
	<li>使用钝头剪刀修剪胸腔与气管造口切口之间的多余组织，以避免损伤气管。确保气管套管下方的整个气管以及完整的心肺组织块均清晰可见。</li>
	<li>用弯头钝头剪刀夹住气管插管，剪除气管后方的结缔组织，保留食管附着以提供额外结构支撑，从而取出心脏-肺组织块及气管图3F).</li>
	<li>逐渐将流速增加至最大40 mL/kg-1/分钟-1. 让前 50 mL 缓冲液流过系统，以去除可能释放的任何炎性细胞因子（图 3G).</li>
	<li>将分离的肺轻轻移至由两个烧杯制成的双层蒸馏装置腔室中。在移动或悬挂肺的过程中，确保肺动脉、肺静脉或气管插管在任何时刻均未发生扭曲。 
	&#8203;注意：在肺脏获取及连接装置过程中，预防肺不张至关重要，尤其当体外肺灌注（EVLP）用于已有损伤的肺脏，或计划在EVLP前进行干预措施时。可通过在转移至呼吸机前于吸气末使用小型夹子夹闭气管等方式实现。15.</li>
</ol>
3. 数据采集
<ol>
	<li>进行数据采集时，使用任何市售的模数转换器和数据采集系统。</li>
	<li>注意采样频率应满足特定实验需求（本实验为 200 Hz），并确保同步采集来自生物放大器及其他输入设备的所有相关因变量参数（本方案选择气道压力、PA 和 PV 压力）16。</li>
	<li>记录自变量参数（例如灌注速度、通气频率、通气气体成分、缓冲液电解质成分以及肺脏重量）。</li>
</ol>

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<li>Riess, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrolyte+measurements+in+blood-free+balanced+salt+solutions+-+comparison+of+i-STAT%C2%AE+with+ABL80%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Electrolyte measurements in blood-free balanced salt solutions - comparison of i-STAT® with ABL80.</a> Anesthesia and Analgesia. 130 (5), 984(2020).</li>
</ol>

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

我们实验室已使用该装置成功完成了100多项实验。该定制装置的模块化设计为实验需求的潜在变更提供了极大的灵活性。而其他装置则采用脱氧器18 以模拟恒定的氧气消耗和CO2 由靶器官产生，该简化模型未采用此特性，因其重点在于研究不同气体成分对肺血管张力的影响。该方法中，CO2 仅由吸入气体浓度控制，也允许对CO进行差异性调节2 与每分通气量无关。
采用闭路循环系统（图1）以重新循环改良的Krebs缓冲液（表1），从而减少牛血清白蛋白（BSA）的浪费，这一步骤对控制成本至关重要。通过恒定流速灌注以模拟恒定的心输出量，可在不伴随心输出量变化的情况下，研究不同剂量药物对肺血管张力的影响，避免了体内实验（in vivo）中因心输出量波动带来的干扰。该系统亦可轻松改造为恒压灌注模式，只需在回路中加入一个高度可调的压力柱，并相应调节泵速即可实现；此时流量成为因变量而非压力，因此...

离体肺灌注（EVLP）技术1在过去十年中的应用日益广泛，可用于研究肺移植2、缺血/再灌注损伤3、肺代谢4以及免疫反应5。分离但结构完整、并维持通气与灌注的肺脏，能够在排除神经调节、激素影响及体内血流动力学变化等混杂因素干扰的情况下，直接评估肺组织（包括肺血管系统）对潜在干预措施和/或治疗手段的反应，从而提供至关重要的研究能力。与此同时，该模型保留了通气与灌注之间的生理相互作用，这与体外（in vitro）条件形成鲜明对比。例如，一项研究肺部免疫反应的课题5，其所需的数据质量应与旨在扩大肺移植供体池规模的研究6相当。EVLP模型可应用于多种物种，包括小鼠3、大鼠7,8,9,10,11,12、猪13和人类2。因此，有必要建立一种能够在多种不同实验参数下产生可靠数据的模型。后续研究将利用EVLP模型作为工具，进一步产生具有临床相关性的研究成果。
尽管大多数物种已有可购买的商用设备，但这些设备往往价格昂贵，且使研究人员受限于特定品牌的仪器和专有软件。任何对即用型设备的改动（例如，从一种物种转换到另一种物种）都需要预先规划并对现有设置进行调整，这可能非常困难甚至无法实现。下文将介绍一种用于大鼠离体肺的自制（DIY，自己动手）装置，该装置具有模块化和成本效益高的特点，同时还将描述肺组织分离的手术操作步骤。

<table><tbody><tr><td>1,000 mL 玻璃烧杯</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,500 mL 玻璃烧杯</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空气捕集顺应性腔室</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>生物放大器</td><td>CWE Inc</td><td>BPM-832</td><td></td></tr><tr><td>夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02626</td><td></td></tr><tr><td>DAQ（数据采集系统）</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>NI USB-6343</td><td></td></tr><tr><td>气体混合器</td><td>CWE Inc, Ardmore, PA</td><td>GSM-4</td><td></td></tr><tr><td>加热线圈</td><td>Radnoti, Covina, CA</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Pfizer</td><td>W63422</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 完整开发系统 2014</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Diamondback Drugs</td><td>G2270-0235-50</td><td></td></tr><tr><td>pH700 探针</td><td>OAKTON, Vernon Hills, IL&amp;nbsp;</td><td>EW-35419-10</td><td></td></tr><tr><td>Polystat 水浴槽</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12121-02</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物呼吸机</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Model 683</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole-Parmer, Wertheim, Germany&amp;nbsp;</td><td>Ismatec REGLO Digital MS 2/8</td><td></td></tr><tr><td>斯普拉格-道利大鼠</td><td>Charles River, Wilmington, MA</td><td>品系编号 001</td><td></td></tr><tr><td>VetScan i-STAT 血气分析仪</td><td>Abraxis, Chicago, IL</td><td>i-STAT 1</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠的设计与构建 离体 肺灌注模型

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

离体肺组织是一种有用的研究模型，可应用于多个不同的研究领域，能够补充相应的体内和体外模型。希望使用离体肺组织的实验室需要了解关键步骤及固有的挑战，以建立一个经济、可靠且易于根据研究主题进行调整的实验系统。本文介绍了一种用于离体大鼠肺通气与灌注的DIY（自己动手制作）模型，可用于研究药物和气体对肺血管张力的影响，且不受心输出量变化的干扰。构建该模型包括：a）装置的设计与组装，以及b）肺组织的分离操作。该模型比商业化的替代方案更具成本效益，同时具备足够的模块化特性，可灵活适应特定研究问题的变化。为确保模型的稳定性并适用于多种不同的研究课题，必须克服多种技术障碍。一旦建立，该模型已被证明高度可调，适用于多种研究问题，并可轻松修改以用于不同学科领域的研究。

在稳定10分钟并记录基线数据后，我们将第一组10只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为五个小组：分别进行5、7.5、8、9或10分钟（每组n = 2）的全局限流性缺血，随后进行再灌注；这些有限的初步剂量探索实验旨在确定在气道压力急剧且不可逆升高以及肺水肿形成之前，仍能维持足够通气和再灌注的最长缺血时间。重要的是，在缺血期间，我们并未停止通气，而是将通气频率从60次/分钟降低至20次/分钟-1，以防止离体肺发生萎陷和不可逆的肺不张。ex situ肺采用恒定呼气末正压（PEEP）可能达到相同目的，这类似于临床实践中在吸气后夹闭待移植肺的气管17。图4表明，在这些条件下，仍能维持150分钟再灌注的最长缺血时间为8分钟。
<img alt="肺灌注实验装置与示意图；设备包括水浴箱、呼吸机、缓冲系统。" class="xfigimg" src="/fil...

离体 肺可用于多种实验，以在排除混杂变量的情况下收集生理数据 体内 实验。商业设备通常价格昂贵，且在可收集的数据类型方面存在局限。我们描述了一种构建完全模块化装置的方法，可适应多种研究设计。

离体肺组织制备是一种有用的研究模型，可应用于多个不同的研究领域，补充相应的体内与体外实验……

我们展示了一种从零开始创建和实施离体肺实验装置的简单方法。该方法可实现一种经济、模块化的装置，适用于多种实验设置。本文介绍的技术成本低廉、具有模块化特点，并可根据实验室建立方案的具体需求进行调整。离体操作可用于补充体内模型，以帮助阐明新的机制。该自制装置旨在可控环境中研究肺脏，与本实验室的主要研究方向一致，即探索多种方法以改善心肺复苏后的预后效果。然而，该装置可根据不同的研究目的进行调整，因而具有高度的灵活性。手术需要具备呼吸系统解剖学和生理学的基本知识，通过遵循本方案可迅速掌握。尽管如此，严格遵循本方案中描述的各个步骤至关重要，尤其在去除肋骨时必须重点保护肺部。进行气管切开术时，用镊子夹起麻醉大鼠气管上方的皮肤并切开。钝性分离肌肉和组织以暴露气管，确保无出血。随后将弯钳置于气管下方并打开，留出足够空间以便穿过3-0缝线。接着将缝线预先打成方结。在气管软骨环之间做一个小切口，插入气管插管。结扎缝线以防止空气从气管切口逸出，并确保插管不会对气管造成牵拉。固定气管插管后，开始对大鼠进行通气。使用大型手术剪和镊子，去除大鼠腹部的毛发。用镊子夹住剑突，并在肋骨下方做一个小的横向切口，注意保持膈肌完整。扩大横向切口以暴露整个膈肌。使用22号针头的注射器将肝素注入下腔静脉，注意避免刺破肺部。用镊子夹住剑突，沿胸骨向头侧剪开，过程中需持续观察肺部以防止剪伤。用两把大镊子撑开肋骨，剪断下腔静脉，通过放血法处死大鼠。修剪多余的胸腺组织，以便更清晰地观察肺血管结构。找到肺动脉，将小型弯头镊子从其下方穿过。再次将3-0缝线从下方穿过，并预先打成方结。然后在心脏右心室做一小切口，插入肺动脉导管。用缝线固定导管，并以1.5毫升/分钟的速度开始灌注。立即切除心尖部分，以防止肺部压力积聚。使用小型弯头镊子撕裂二尖瓣，并目视确认镊子可无阻碍地进入左心房。在心房下方用3-0缝线紧密缠绕心脏一周，将肺静脉导管插入左心房，在打结前确保缓冲液可从导管流出。接着，使用钝头剪刀修剪胸腔与气管切开切口之间多余的组织，以避免损伤气管。确保气管插管下方的气管以及整个心肺组织块均可见。移除心肺组织块和气管时，应握住气管插管，使用弯头钝头剪刀切除气管后方的结缔组织。展示缺血与再灌注后肺组织的存活情况。允许150分钟再灌注的最长缺血时间为8分钟。正确插管血管系统对于确保离体肺在整个实验过程中保持活性至关重要。手术后肺组织保持完整，便于在实验结束后进行湿重、干重或组织学等基本测量。

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大鼠 离体 肺灌注模型的设计和实现

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离体肺灌注：一种用于兔模型肺部研究的技术

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分离方法 离体 大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（EVLP）项目的经验总结

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常温非原位灌注异位心脏移植大鼠模型

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建立一种 离体 用于肺移植转化研究的大鼠肺灌注模型

在此，我们描述了一种基于聚合人血红蛋白（PolyhHb）的氧载体作为灌注液的应用，以及该灌注溶液在大鼠模型中进行测试的实验方案 离体...

利用新一代聚合血红蛋白氧载体在大鼠离体肺灌注模型中探索替代性灌注液

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热预处理期间 离体 移植前修复受损肺移植物的肺灌注技术

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离体肌腱的机械加载

了解大鼠离体肺灌注模型的设计与实现方法，学习气管切开、插管和灌注技术。该模块化实验装置成本低廉，可在受控环境中维持肺活力长达150分钟，适用于心肺复苏及呼吸功能研究。

大鼠的设计与构建离体肺灌注模型

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