Name: 光控生物活性化合物的体外和体内评价 - 癌症光药理学的潜在候选药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 了解光控抗癌肽的体外和体内评价方法，包括二维和三维细胞培养中的细胞毒性检测、光异构化效率测定以及体内疗效评估。该技术为癌症光药理学研究提供了重要的临床前实验方案。

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作者感谢欧盟通过 H2020-MSCA-RISE 项目 PELICO（#690973）和 ALISE（#101007256）提供的资助。本研究得到了德国研究基金会 DFG-GRK 2039（SA、TS 和 ASU）、亥姆霍兹学会 NACIP 项目（SA 和 ASU）以及德国联邦教育与研究部 BMBF 的 VIP+ 项目（OB 和 ASU）的支持。我们感谢卡尔斯鲁厄理工学院的 Serhii Koniev 博士合成了化合物 LMB002，并对其进行了纯化，且慷慨提供了本研究所需的该化合物。作者还感谢 Maksym Chupryna 在乌克兰完成了本视频的拍摄与剪辑工作，并向所有勇敢的乌克兰保卫者致以敬意，正是他们的努力使得本论文的实验工作、撰写和视频拍摄得以完成。

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IVK、OB、SA 和 ASU 是已授权专利家族“具有光控生物活性的肽模拟物”（WO2014127919 [A1]、EP2958934 [B1]、US9481712 [B2]、UA113685 [C2]）的发明人，该专利已授权给 Lumobiotics GmbH。IVK、OB、TS 和 SA 是 Lumobiotics GmbH 的创始人及股东。IVK 是 Enamine LLC 的科学顾问，HK、TM、IP 和 PB 是 Enamine LLC 的员工。除上述披露外，作者与任何组织或实体均无其他相关隶属关系或经济利益，亦不存在与本出版物所讨论主题或材料相关的经济利益冲突。

光控化合物在药物开发中尚属前所未有；然而，目前尚未建立针对其临床前和临床评价的方法。最接近的单药治疗类似物——光动力疗法（PDT）——已被许多国家采用作为癌症治疗的临床手段，并正在开发用于其他适应症19,20。与光药理学类似，PDT同样依赖光来激活生物活性物质（单线态氧）。因此，PDT中用于临床前和临床研究的一些实验方法可被光药理学借鉴采用。例如，用于PDT的光源、光递送方式及医疗器械均已发展成熟并获得批准，可直接用于光控药物的评价。然而，PDT与光药理学之间存在诸多差异4，这说明有必要为后者建立专门的方法体系。
首先，光动力疗法（PDT）中未激活的物质（氧气）在活体组织中始终以&#160;无毒浓度存在。相比之下，未激活的光控生物活性化合物可能具有残余活性和非预期的毒性。因此，理想的光药理学药物在其给药形式下应具有尽可能低的生物活性，而在光照激活形式下则必须具有高度活性，其&#34;光治疗窗口&#34;21应尽可能宽。发现苗头化合物并进行苗头到先导化合物的优化，需要在药物研发的早期阶段就筛选出合适的化合物，并对相对大规模的化合物库进行筛选。本文中，我们提出采用自动化的高通量共聚焦荧光显微镜技术，用于识别高效的光可切换化合物。
所选的细胞毒性评价方法能够轻松满足最关键的条件——维持PSS或可见光敏感型光异构体的稳定性。这是因为该方法在实施过程中可将光照暴露降至最低。因此，若选择其他替代方法，应优先考虑自动化方法。该方法可靠且信息丰富。在此阶段使用三维细胞培养（球状体）可更真实地模拟组织微环境，从而全面理解细胞对治疗的响应。此外，通过显微镜这一直接方法，还可获得有关化合物作用机制的宝贵信息。采用适当的染色方案进行共聚焦荧光显微镜观察，可直观评估细胞和球状体的形态，并检测到细胞死亡及细胞内部变化的重要细节。
其次，光照射的应用需要谨慎选择光剂量。在光动力疗法中，过量的光照对组织极为有害。22光药理学治疗在强光照射条件下可能具有优势。激活态物质的上限由非激活态物质的给药剂量及其药代动力学决定。然而，光照剂量仍是光药理学中的一个问题。需注意确保照射功率密度和暴露时间不会 较少 高于治疗所需剂量。原则上，可对活化物质的生成进行监测 体内然而，出于生物伦理学的考虑，我们设计了一项使用模型组织（新鲜绞肉）与非活化化合物混合的实验15该实验操作简单，可修改以使用不同的光源。此外，该实验还可适用于光物理剂量的估算以及热效应的测量。同样，通过使用模型组织，可实现光照射剂量的最小化，相较于在更精确的光开关效率测定中所采用的方法，例如， 体内 条件，一种可能始终值得考虑的替代方案。
最后，那些在测试中表现出优异特性的化合物 体外 毒性筛选，并可高效光控切换，至少在模型组织深达1-1.5 cm处有效，方可进入后续昂贵、耗时且费力的步骤 在体 研究中。在本方案中，我们使用了相同的细胞系（LLC） 体外 评估以构建同种异体移植癌症模型。肿瘤生长动态、死亡率和转移灶数量是评估抗癌效果最合适的参数。与传统化疗相比，光药理学治疗额外引入了一个因素——光。因此，需要设置两个对照动物组：一组仅接受载体处理，另一组接受载体并进行光照。该设计可评估光对所测参数的影响。在本实验中，两个实验组动物均给予未激活的化合物，其中一组小鼠的肿瘤接受光照。对照组与治疗组的光照方案保持一致。此阶段无需与标准化疗进行比较，因为实验主要目的是验证光照与化合物联用的协同效应。表现出最佳协同效应的化合物可被筛选出来，用于后续深入研究 体内 毒性和与基准的比较，以对其开发做出关键的决策。从技术上讲， 体内 我们所描述的实验可轻松适用于药代动力学或药效动力学研究，例如针对已选定作为候选药物的化合物。

近年来，光控生物活性化合物已成为人类疾病安全化疗以及特异性消除恶性实体瘤的有前景的组成部分1。这类化合物含有可逆光异构化的片段（分子光开关），在不同波长的光照下可在无活性和有活性的光异构体之间切换。
与非光控类似物相比，光控药物可能更安全，因为它们可以以活性较低且基本无毒的形式全身性地引入患者体内，随后仅在必要部位（如肿瘤、溃疡和伤口）通过光照激活。尽管近年来的学术论文中已报道了多种此类分子药物原型的令人振奋的示例2,3,4,5,6,7，但临床光药理学——即获批药物/医疗器械/疾病组合的应用——这一领域尚不存在。光药理学仍处于药物发现阶段，尚未开展系统的临床前研究。
我们直到最近才证明了这一点 体内 对某些光控抗肿瘤肽具有安全优势，即肽类抗生素短杆菌肽S的类似物8这些光控衍生物包含一种二芳基乙烯（DAE）光开关，可在红光照射下生成的“开环”光异构体与紫外光照射下生成的“闭环”光异构体之间发生可逆的光诱导转化（如图所示）。 图1 对于其中一种衍生物，化合物 LMB002。
<img alt="光化学反应图，LMB002 DAE 结构，紫外-红光诱导，结构变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：光控细胞毒性肽 LMB002 及其光异构化。 二芳基乙烯片段以红色标出。缩写：DAE = diarylethene。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
发现苗头化合物并进行苗头化合物到先导化合物的优化，通常需要对合适的化合物库进行体外和体内筛选9,10。本文展示了一种适用于光控化合物细胞毒性系统性高通量筛选的方法学。我们还测定了光异构化效率，估算了模型组织中的光剂量，并评估了表现最佳候选化合物的体内功效。该方法符合生物伦理和动物护理的相关要求。
在本研究中，对传统的临床前方法进行了改进，以避免被测化合物发生非可控的光异构化。应用这些改进方法的总体目标是建立一种通用策略，该策略简便快速，且能够获得具有统计学意义的数据，从而实现可靠比较 体外 活性并进行合理化分析 体内 光开关化合物的效能测试，用于先导化合物的筛选与进一步开发。
该策略包含三个连续步骤。第一步涉及通过二维（2D，单层）和三维（3D，球状体）细胞培养结合共聚焦高通量自动荧光显微镜技术，测定选定的光控生物活性化合物在连续稀释条件下其活性与非活性光异构体的IC50（表观50%细胞存活率）。通过比较两种光异构体之间IC50的差异来评估光治疗窗口，并筛选出表现最优的候选化合物。在此阶段，采用自动显微镜与其他细胞毒性筛选平台（检测方法）进行毒性评估并无特定优势11；更复杂的基于细胞的肿瘤模型12可在此阶段轻松实施。
对于在步骤1中选定的化合物，第二步是通过在组织模拟物中使用经照射样品提取物的紫外检测高效液相色谱法（HPLC）定量测定其较不活跃光异构体的光致异构化效率，从而根据距照射组织表面深度的真实情况估算这些化合物在组织内部的光致异构化效率。体内也可研究光致异构化效率，但我们建议使用一种简单的组织模拟物——绞碎的猪肉。我们已验证了该方法的有效性。我们在小鼠癌症模型上测量了这些可光致异构化化合物的体内转化情况，观察到在某一深度下的光转化率与此前在小鼠实验中测得的结果大致相同8。也可选用任何合适的替代性人工组织13、3D生物打印组织/器官14、活检材料或其他豁免的动物源性材料。然而，该方案在经济性、速度和伦理方面达到了良好平衡。
第三步是确定 体内 在小鼠癌症模型中的抗癌功效。在特性上表现更优的化合物 体外 选择在模型组织中至少 1-1.5 cm 深度处能够进行实验并实现高效光切换的条件用于本实验。
该方案可适用于含有不同类型光开关的化合物，只要其光异构体（或光稳态，PSS）在合理时间内保持稳定（数天或更长时间）。为说明起见，本文采用一种先前报道的源自二芳基乙烯（DAE）的化合物 LMB002 作为示例15. LMB002 光敏形式具有热稳定性，可在 −20 °C 至少一年内不会发生显著降解。本研究选用刘易斯肺癌（LLC）细胞进行此项实验。 体外 和 体内 演示，但对细胞类型无限制。LLC细胞具有贴壁性，易于在三维条件下培养，并可用于生成肿瘤类器官（如参考文献所述）16). 在体 内 LLC 细胞可用于模拟转移过程，在免疫功能健全的小鼠中经皮下注射后可迅速形成实体瘤。 体内 该方法可普遍应用于其他癌症模型17,18该策略的详细实施步骤如下所述。

<table><tbody><tr><td>Agilent 1100 系列毛细管液相色谱系统</td><td>ALSI-Chrom（Agilent 分销商）</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642，LL/2（LLC1）Lewis 肺癌细胞系</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NCrl 小鼠，雌性，近交系</td><td>Charles River</td><td>品系编号：027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture，CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning，384 孔球状体微孔板</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco，DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>短杆菌肽 S</td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>定制合成</td></tr><tr><td>HyClone，DMEM/高糖</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS 成像系统</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen，Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉机</td><td>ASA</td><td>序列号：ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM 溶液</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-surgeon 半导体手术激光器</td><td>Fotonika plus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>LMB002</td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>定制合成</td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素稳定溶液</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate，96 孔板</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>光度计 PCE-LED 20</td><td>PCE Instruments</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific，Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific，碘化丙啶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝，0.4% 溶液</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;ndash;EDTA，10 倍溶液</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz 带通气盖细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz 瓶顶滤器，PES，0.22 &amp;mu;m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP，C18 HPLC 色谱柱（4.6 mm &amp;times; 250 mm，5 &amp;micro;m）</td><td>Altmann Analytik（Avantor 分销商）</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

体外与体内光控生物活性化合物的评价——癌症光药理学潜在药物候选物

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

光控生物活性化合物是一类新兴的化合物 &#34;智能&#34; 候选药物。由于可通过将无害的非电离光精确引导至患者体内的特定部位，实现其在时空上的精准激活，因此在全身化疗中提供了额外的安全性。本文介绍了一组用于评估的方 体外 效价和 离体 光控生物活性化合物光激活的效率以及 体内 在药物开发早期阶段评估疗效。该方法应用于抗癌细胞毒性肽，即含有二芳基乙烯的已知抗生素短杆菌肽S（gramicidin S）类似物。实验采用癌细胞系（Lewis肺癌，LLC）的二维（贴壁细胞）和三维（球状体）细胞培养、活体组织替代物（猪肉糜）以及免疫健全小鼠的同种异体移植癌模型（皮下LLC）。通过自动荧光显微镜筛选最有效的化合物并估算实际的光治疗窗口。在不同深度的模拟组织中测定不同光照方案下的光激活效率，并将最优光剂量应用于最终的治疗。 体内 实验

本研究通过二维和三维细胞实验，测定LMB002的“闭环”和“开环”形式在不同孵育时间下的半数抑制浓度（IC50）（见图1），并将这些值与原型肽gramicidin S（作为阳性对照）的相应结果进行比较。典型的二维培养LLC细胞经染色后孵育图像如图5所示。使用Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）共染色后，与“闭环”形式相比，“开环”形式处理的细胞中呈现更多不同深浅的紫色，表明两种形式之间的细胞毒性存在显著差异，且该差异易于量化。本实验成功示例基于采用96孔板格式收集的数据，其中按不同浓度加入肽的不同变体，如图2所示。类似数据也可通过384孔板及高密度孔板获得。然而，由于每孔体积减少，技术误差和系统误差将随之增加，导致IC50测定的准确性随孔密度升高而下降。
<img alt="细胞活力检测结果、荧光显微镜图像，LMB002 和短杆菌肽 S 随时间处理的效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：单层培养 LLC 细胞毒性实验的代表性图像。 细胞经 Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）染色。所示时间：10 分钟、60 分钟、24 小时和 72 小时，为化合物孵育时间。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在模拟组织（新鲜猪肉糜）中，通过激光照射测定LMB002的光转化过程：将LMB002“闭环”（非活性）形式溶解于PBS后与肉糜混合，制备样品，并沿辐射传播方向检测该非活性形式转化为LMB002“开环”（活性）形式的程度。将样品装入注射器中，用平束激光从一侧照射约10分钟（通常用于体内实验的照射时间），如图3所示。照射结束后，通过推动注射器活塞并用解剖刀切割出等厚的样品片，将样品圆柱体分段。采用反相高效液相色谱法（RP HPLC）测定各片层提取物中LMB002“开环”形式的浓度。
图6展示了由数据分析获得的剂量-效应曲线图6A-D。为了确定经Hoechst 33342和PI染料核共染色的死细胞百分比，我们使用了一种内置的分类器工具，该工具在选定的测量参数上设置数值阈值，将所有细胞计数划分为若干类别。例如，当对照组中红色通道（碘化丙啶）信号处于阈值（约110-130单位）时，细胞可被分类为碘化丙啶阳性（视为死亡）或碘化丙啶阴性（视为未受化合物影响）。对于LMB002，可见碘化丙啶阳性细胞百分比随化合物浓度变化的S形依赖关系。根据这些数据可确定IC50值。
<img alt="细胞活力分析、剂量-反应曲线、图表、LMB002 化合物、PI 阳性细胞、浓度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：二维培养中细胞毒性的分析。 在 Lewis 肺癌（LLC）细胞培养中，经化合物处理后在（A）10 分钟、（B）60 分钟、（C）24 小时和（D）72 小时时段孵育所获得的 S 形拟合曲线。通过拟合可准确确定 IC50 值（未显示）。误差棒表示标准误（SEM）。缩写：LLC = Lewis 肺癌；PI = 碘化丙啶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
根据获得的IC50值可以得出结论：这三种化合物的毒性均随孵育时间的延长而增加。实验结果显示，LMB002的“开环”形式比原型肽格拉米西丁S的毒性低约一个稀释梯度；而“闭环”形式的毒性则低三到四个稀释梯度，且其毒性随孵育时间延长而进一步增强。这两个稀释梯度之间的差异不受孵育时间延长的影响，可作为实验测定的光治疗窗数值6，用于与潜在化合物库中其他化合物进行比较。格拉米西丁S的IC50值被设定为参考点，以校正实验误差或生物学重复之间的差异性结果。
3D 细胞实验产生了相同类型的原始数据——每个孔中单个细胞分辨的球状体图像。通过加入钙黄绿素作为第三种染色染料，可对代谢活跃细胞的比例进行定量分析（在绿色通道中观察）。通过使用 384 孔板、增加技术重复次数、排除冗余的共孵育时间点以及调整稀释倍数，我们能够在单次测试运行（使用单个板）中直接比较多种化合物，如 图 7 中的板布局所示。
<img alt="随时间变化的细胞活力检测图；药物浓度，10 分钟至 72 小时，数据采用颜色编码。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图 7：两种化合物的 3D 培养实验板图。 图中所示为化合物与对照组的颜色编码。孔中数字表示浓度，单位为 µM。10 min、24 h 和 72 h 为孵育时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图8 显示了在存在待测化合物的情况下，以每孔1个类球体的密度培养的LLC类球体以及对照类球体在染色后拍摄的部分技术重复样本的图像。
<img alt="免疫荧光测定；细胞对 LMB002 和短杆菌肽 S 的反应；延时成像；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图 8：三维培养细胞毒性测定的代表性图像。 图像显示了经 LMB002 的两种光异构体和短杆菌肽 S 共同孵育 10 分钟、24 小时和 72 小时后，48 小时龄的 LLC 类球体经 Hoechst 33342（蓝色）、钙黄绿素 AM（绿色）和碘化丙啶（红色）染色的结果。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用仪器软件，从Z轴堆叠的图像中获得了剂量-效应曲线，类似于二维实验中的结果（图9A）。此外，可通过整体球体直径对三维培养中致密且无变形的类球体进行表征（图9B）。同时注意到，类球体的整体直径随化合物浓度的变化而变化。
<img alt="细胞活力与类球体大小随浓度变化的图表；PI 染色法；延时数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图 9：采用三维培养进行的细胞毒性评估。（A）LLC 细胞三维共培养物与短杆菌肽 S 共同孵育 10 分钟、24 小时和 72 小时后，在染色前采集数据所得的浓度依赖性细胞毒性拟合曲线；（B）相应的浓度依赖性类球体直径变化图。误差线表示标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
第2步的实验通过紫外检测高效液相色谱法测定两种光异构体中LMB002的浓度。利用该装置可方便地评估并量化模型组织中的光转化效率（图3）。数据来源于对样品提取物色谱图的定量分析。在这些测试实验中，LMB002的色谱图在270 nm和570 nm波长下进行光谱检测。在270 nm处，观察到许多额外信号，归因于从模型组织中共提取的化合物（通过不含该化合物的对照提取物验证）。两种光异构体在保留时间和吸收特性上具有足够差异。然而，LMB002的“开环”信号与这些背景信号实现了基线分离（参见图10A中的代表性色谱图），因此该信号可无干扰地进行积分。在570 nm处，色谱图中仅含有LMB002“闭环”形式的信号（图10B）。在此，我们采用反相高效液相色谱法（RP HPLC）进行浓度测定。然而，若采用液相色谱-质谱联用（LC/MS）作为分析方法，则可实现更高的准确度和更低的检测限。
<img alt="色谱结果；紫外-可见光谱图显示随时间变化的化合物分离峰。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"> 
图10：从模型组织中提取的LMB002的代表性色谱图。（A）距辐照表面2 mm处的样品，在270 nm处记录（积分LMB002“开环”形式）；（B）距辐照表面38 mm处的样品，在570 nm处记录（积分LMB002“闭环”形式的峰）。保留时间值（已标出）进一步确认了该化合物的身份。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
对所有采集样品的相应信号进行积分后所得数据用于构建浓度-深度曲线图，如图11所示。基于这些图表，可方便地评估模型组织不同深度处的光转化效率。结果证实，在组织模拟物绞肉中（约103 mW/cm2条件下），我们的红光光源可在深度达1 c处诱导LMB002发生“闭环”光转化。
<img alt="激活态与非激活态物质浓度 A (mg/kg) 随距离 L (mm) 变化的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图11"> 
图11：光转化效率评估。 模型组织照射表面不同距离处（L，mm）LMB002 的“闭环”（非激活态，蓝色圆点）和“开环”形式（激活态，橙色圆点）的浓度（A，mg/kg）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
实验结果 体内 实验 - 按照所示时间表进行的方法学第3步 图4 - 用显示肿瘤生长随时间变化的曲线图表示（图12）以及Kaplan-Meier生存曲线（图13).
<img alt="肿瘤生长曲线；比较照射后给予载体和LMB002的肿瘤生长情况，为期20天；体积随时间变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图12"> 
图12：动物体内肿瘤生长动态。 接受LMB002治疗的动物与接受载体治疗的动物进行比较（C57BL/6NCrl小鼠皮下LLC同种移植模型，化合物剂量为7 mg/kg，静脉注射，孵育2 h 40 min后在650 nm波长、100 mW/cm2功率密度下照射20 min）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="生存分析Kaplan-Meier曲线；照射对照组与LMB002治疗组，治疗后天数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 13"> 
图13：动物死亡率曲线。 接受LMB002治疗的动物与接受对照溶剂治疗的动物比较（C57BL/6NCrl小鼠皮下LLC同种移植模型，化合物剂量为7 mg/kg，静脉注射，孵育2小时40分钟，随后在650 nm波长、100 mW/cm2功率密度下照射20分钟）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了一套用于评估光控抗癌肽的实验方法，可用于此类化合物的临床前筛选。内容包括在二维和三维细胞培养体系中进行的细胞毒性评估、对肽类作用效果的评价 离体 （模型组织）光异构化效率，以及 体内 功效

光控生物活性化合物是一类新兴的“智能”候选药物，可在全身给药时提供额外的安全性……

光控型生物活性化合物在其分子中包含可逆光致异构化的片段，即光开关。这些化合物是通过二芳基乙烯片段修饰的环状肽，该片段可发生可逆的光诱导电环化转变。它们能够进行光切换，即在紫外光生成的生物非活性形式和红光生成的生物活性形式之间相互转换。人们认为，光控开关类药物比非光控开关类药物更安全。这是因为可以向人体给予无毒且处于失活状态的药物形式，并仅在需要的局部区域（例如肿瘤、溃疡或伤口处）通过光照激活其药效。目前尚无针对此类光药理学药物的临床前或临床开发标准方法或方案，因此在此，我们将向您展示可用于此类早期临床前研究的实验方法。Kateryna Horbatok 和 Tetiana Makhnii 将演示相关操作步骤。动物护理和实验程序已获得 Bienta 公司生物伦理委员会的批准。首先使用标准方法配制缓冲液。或者使用市售的溶液。配制化合物的储备液。对于每种化合物，将环闭型光致变色形式的化合物分别称取两份，每份5.12毫克，加入两个1.5毫升的Eppendorf离心管中，一个为透明管，另一个为黑色不透光管。作为阳性对照，在另一支离心管中称取2.28毫克未进行光控的母体肽。向每个样品中加入100微升纯DMSO，并涡旋振荡30秒。将透明管壁离心管中的储备液置于650纳米激光下照射（光功率密度为6瓦特每平方厘米），同时涡旋振荡以确保充分混匀，从而实现光异构化。继续操作直至颜色由深紫色变为浅棕色。使用铝箔避光保护。每孔接种 5,000 至 10,000 个细胞。在96孔无菌板的中央60个孔中，每孔加入约8,000个Lewis肺癌细胞和200微升DMEM培养基，该板底部透明，侧壁为黑色不透光。其余36个孔中加入纯DMEM培养基。将培养板置于37摄氏度、5%CO2气氛中孵育过夜。第二天，在聚丙烯灭菌透明板中配制化合物及阳性对照的系列稀释液。以DMSO中的储备液为起始，用DMEM进行稀释，但最终最高浓度中的DMSO体积不得超过1%。为防止所研究的化合物发生不受控的光异构化，需关闭超净台内的照明灯。将100微升稀释液转移至56个已预先加入100微升DMEM的孔中，以达到孔内化合物所需的最终浓度，通常为5至150微摩尔范围。接着，向四个孔中各加入100微升DMEM，作为阴性对照。用铝箔或不透明塑料盖覆盖培养板，以防止发生不受控的光转换。将培养板放入细胞培养箱中，在 37 摄氏度下孵育选定的时间。孵育结束后，每孔加入 50 微升染色液。本实验的最终染色液为 5 微摩尔的 Hoechst 33342 和 1 微摩尔的碘化丙啶。再次于37摄氏度孵育20分钟。使用20倍放大倍数的物镜进行自动荧光成像。该部分方法的实验室操作与二维实验所述操作完全相同：细胞培养物的制备、与待测化合物共孵育以及成像。然而，在本实验中，细胞被制备成致密且成熟的球状体，培养于384孔、超低吸附、U型底、具有黑色不透明壁的培养板中。使用这种规格的培养板可在一次实验中同时比较两种化合物。在本实验中，我们还额外使用了钙黄绿素AM作为多色染色溶液的第三种组分。使用仪器自带的自动图像分析软件分析从二维和三维实验中获得的图像。用Hoechst和碘化丙啶染料共染色的细胞被视为坏死性死亡细胞，其比例随浓度变化的关系用于计算IC50值。组装用于样品辐照的光路系统。它由来自激光光源的光缆、一个焦距可变的透镜、一个带有不透明外罩的注射器以及一个平切末端组成。所有后续操作必须在暗室中进行，工作区域照明应降至最低。准备含有非活性光交联化合物的模型组织样本。在常规操作中，将五克新鲜绞猪肉与该化合物的 PBS 溶液进行机械混合，以达到每千克 50 毫克的终浓度。用负载后的样品填充注射器。在光学系统中对样品进行照射，照射时间和光剂量需满足实验要求。暴露后，用活塞将样品从注射器中推出，并用解剖刀切成4毫米厚的切片。在1.5毫升离心管中，使用乙腈、水、三氟乙酸混合液（70%乙腈和0.1%三氟乙酸）称重并提取化合物。以20×g离心30分钟，重复两次，以去除不溶物，并收集上清液。记录其闭环形式在570纳米、开环形式在270纳米处的紫外检测色谱图。使用与细胞实验中储备液类似制备的未照射和照射对照样品，确定各组分的特异性保留时间并校准方法。重复实验三次，并在百分比相对于照射组织表面距离的图中绘制每种光异构体的归一化百分比。在第0天，将约50万个Lewis肺癌细胞悬浮于约100微升DMEM与Matrigel混合液中，皮下接种至每只约20克重的C57黑6成年雌性小鼠的右后肢。该操作在5%异氟烷麻醉下进行。动物在第5至第8天可开始接受治疗，此时肿瘤已可触及。所有涉及检测的操作均应在半暗条件下进行。在给予化合物剂量后处理动物时，也应持续保持该条件，为期两天。将动物随机分为四组，每组八只，并去除肿瘤区域的毛发。两个对照组接受静脉注射溶剂，每20克动物注射100微升生理盐水；两个实验组动物接受测试化合物的非活性光形式，溶于生理盐水溶液中，浓度为每毫升1毫克。以每公斤5毫升的剂量将化合物快速推注至尾静脉。在化合物注射后2小时45分钟，使用650纳米激光，在异氟烷麻醉下以100毫瓦/平方厘米的光功率密度照射肿瘤区域20分钟。随后30分钟内密切观察动物状况。此后每日观察动物，并测量其体重及肿瘤尺寸。测量肿瘤体积，并记录坏死的进展情况。采用标准方法测定存活率。本方案第一步在二维细胞培养实验中的结果可以图像形式展示，如此处所示：在不同浓度的LMB002处理下，以及在不同孵育时间后，Lewis肺癌细胞的代表性图像。使用Hoechst和碘化丙啶共染色可在蓝色通道中观察细胞核，从而获得总细胞数。在红色通道中可观察到细胞膜完整性受损的细胞。假设后者为坏死性死亡细胞，则所研究化合物的表观细胞毒性可量化为碘化丙啶阳性细胞所占的百分比。通过自动图像分析获得的数据量化结果如图所示。对于LMB002，可见碘化丙啶阳性细胞百分比随化合物浓度呈现S形依赖关系。根据这些数据可确定IC50值。我们的实验表明，LMB002 的开放形式比原型肽 Gramicidin S 的毒性低约一个稀释梯度，而其闭环形式的毒性则低三到四个稀释梯度，且毒性随孵育时间延长而增加。三维细胞实验产生了相同类型的原始数据，即单细胞分辨率的每壁一个类球体图像。加入钙黄绿素作为第三种染色染料，可实现对绿色通道中观察到的具有代谢活性的细胞比例进行定量分析。剂量效应曲线（如二维实验中的曲线）由Z轴堆叠图像获得。图A展示了此类曲线，验证了二维实验的结果。如图B所示，类球体的整体直径随化合物浓度变化而变化。第二步实验通过紫外检测的高效液相色谱法，实现了对两种光异构体中LMB002浓度的测定。两种光异构体在保留时间和吸光度上均表现出足够差异，如图中A和B两个图板所示。所得数据在图中进行了汇总，证实我们的红光光源可在组织模拟物（绞肉）中深度达一厘米处，以约103毫瓦每平方厘米的光强诱导LMB002发生闭环光转化。体内实验的结果，即本研究方法的第三步，通过Kaplan-Meier生存曲线图展示，显示肿瘤生长随时间的变化情况。本文所展示的评估光控可切换药物候选物的策略具有实用性，适用于含有二芳基乙烯型光控开关的化合物。第一步，细胞毒性定量，可用于光控化合物库的初步筛选。第二步，光控开关效率评估既易于实施又符合伦理要求，无需使用活体动物。第三步，在活体光药理学模型中，该疗法可应用于小型动物。

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