Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue-Resident Macrophages In Vivo in Mice

与其他用于体内巨噬细胞基因操作的病毒方法相比，使用慢病毒载体可实现转基因组织巨噬细胞的稳定整合、高效的转基因表达，并具有最大的载体容量。在采用体内慢病毒操控代谢酶的过程中，我们发现了组织驻留巨噬细胞中显著的功能变化。因此，目前我们正在研究免疫代谢及其在维持组织特异性功能中的作用，包括表观遗传学和免疫功能。

未来，我们希望致力于研究组织巨噬细胞在稳态及疾病模型中如何影响其他局部细胞群体，以及如何利用这些相互作用来预防和治疗疾病。首先，在一个15毫升的离心管中加入慢病毒组分，并用EC缓冲液定容至600微升。加入36微升增强剂溶液，使用1毫升移液器反复吹打混匀，将部分液体吸入并重新排入溶液中。

五分钟后，加入 120 微升转染试剂，轻轻混匀约 20 次，操作方式如前所述。将离心管置于室温下静置 10 分钟。随后，向管中加入 5.2 毫升 cDMEM。

使用一次性移液管，将转染混合物逐滴加入培养于T175培养瓶中的HEK293T细胞单层。通过轻轻左右摇动培养瓶使质粒均匀分布。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。

孵育后，在荧光显微镜下通过观察 GFP 荧光来确认 HEK293T 细胞转染的有效性。现在倾斜培养瓶，使用 25 毫升血清移液管收集培养基，注意不要扰动细胞单层。将培养基转移至预先标记好的 50 毫升离心管中，并盖紧管盖。

沿培养瓶壁加入 25 毫升温热的 cDMEM，避免扰动单层细胞，然后将培养瓶放回培养箱。24 小时后，收集培养基，向培养瓶中加入去污染溶液，并将培养瓶水平放置 24 小时。首先，从 50 毫升注射器中取出活塞，并将一个低蛋白结合力的聚醚砜或聚偏二氟乙烯 0.45 微米无菌滤器插入注射器末端。

使用 25 毫升血清学移液管，将慢病毒转染的 HEK293T 细胞悬液加入注射器中，并轻轻复位活塞。缓慢推动活塞，将滤液收集至一个新的 50 毫升离心管中。操作完成后，从注射器上取下滤器，并将其丢弃至去污溶液中。

在超速离心管底部加入3 mL的20%蔗糖溶液。接着，将移液器助吸器调至最低速度。将超速离心管保持约45度角，缓慢将过滤后的含慢病毒培养基沿管壁加入。

观察离心管中明显的分层现象。如果离心管总体积小于29毫升，需加入新鲜cDMEM，以防止离心过程中管体塌陷。用70%酒精擦拭超速离心机吊桶，并将离心管适配器置于吊桶底部。

然后，将超速离心管放入转子桶中。盖好桶盖，并将其放入转子架中。将超速离心机预冷至四摄氏度。

小心将桶放入转子中，然后打开真空。将加速度和减速度调至最低档，于4°C条件下以26,000 RPM离心90分钟。离心结束后，关闭真空，小心取出转子，避免扰动样品。

观察超速离心机，确认离心桶无溢出和泄漏。将超速离心管中的内容物一次性平稳倒入废液容器中。将离心管倒置在双层滤纸上，静置10分钟。

同时，用浸有70%乙醇的纸巾擦拭桶内壁，并将其倒置晾干。用纸巾小心擦干超速离心管管口残留的液体。将沉淀重悬于1毫升适当的无血清培养基中，静置15分钟。

使用1毫升移液器轻轻混匀慢病毒制备液，并将其分装至1.5毫升螺口离心管中。将慢病毒制备液于-80摄氏度保存。成功的慢病毒制备可实现使用5微升剂量时感染率超过95%。

感染细胞的平均荧光强度随剂量增加而升高。腹腔注射100微升慢病毒制剂，在小鼠腹腔细胞中获得最高比例和最强强度的GFP信号。使用100微升慢病毒注射的时间过程实验显示，在第3天和第7天可检测到显著比例的GFP表达定居细胞，随后在第14天感染细胞群消失。