利用低强度聚焦超声在大鼠模型中破坏血-脊髓屏障

血-脊髓屏障结合紧密，通透性有限。本方案允许研究人员利用微泡和聚焦超声安全且短暂地打开血-脊髓屏障。该技术可将血-脊髓屏障的开放精确限定于目标脊髓节段。

此外，可通过肉眼观察或荧光显微镜轻松确认破坏效果。本方案可进一步探索其在改善基因治疗或药物向脊髓递送方面的潜力，用于肿瘤、萎缩或损伤的治疗。本实验操作将由 Meghana Bhimreddy 演示。

我实验室中一位出色的医学博士生，他每天都在工程学与医学之间架起桥梁。首先，准备一套具备足够技术参数的聚焦超声换能器系统，以实现大鼠血-脊髓屏障（BSCB）的开放。将3D打印的探头支架和水锥固定在换能器上。

确保锥形装置与换能器之间形成严密的防水密封。使用橡皮筋将已灭菌、厚度为50微米、声学透明的聚酯膜固定在水锥底部。利用进水和出水管路，将脱气去离子水注入水锥内。

避免锥体内产生气泡，因为气泡会干扰换能器与目标之间的声学耦合。此时，Mylar 膜应略微膨胀。将包含波形发生器和射频驱动放大器的驱动设备连接到换能器上。

将立体定位臂固定到固定板上，并将探针架连接到臂上。记录麻醉后的雌性Sprague-Dawley大鼠的体重，并进行足趾和尾部夹捏测试，以确认麻醉效果。在固定板上放置加热垫和无菌吸收垫。

将大鼠置于吸水垫上。涂抹眼药膏，并插入直肠温度计以监测体温。触诊大鼠最后一根肋骨，该肋骨附着于第13胸椎的脊柱处。

使用电动剃须刀剃除最后肋骨至颈部之间背侧表面的毛发。用浸有10%碘伏的纱布擦拭暴露的皮肤。使用虹膜剪做正中切口，并分离筋膜，直至暴露出棘突和椎板。

使用偏移式骨剪和斜面刀刃的虹膜剪去除骨骼，直至暴露脊髓。通过夹住椎板切除部位附近的棘突，将大鼠固定在固定板上。然后轻轻牵拉夹子，使脊柱绷紧。

使用立体定位臂调整换能器的位置，直至其精确地位于椎板切除部位的正上方。将激光装置固定在水锥底部，并将其下放至可见激光点。然后调整换能器的侧向位置，直至激光点位于血脊髓屏障（BSCB）破坏的目标位置上方。

移除激光设备，并在椎管内锥体与脊髓之间的空隙填充脱气的超声耦合剂，注意避免引入气泡。根据换能器的功率输出设置超声辐照参数。按照制造商说明书配制微泡溶液。

为了提高尾静脉插管的成功率，将尾巴浸入温水中，并在尾巴根部放置止血带，以扩大静脉直径。然后插入22号尾静脉导管，并用0.2毫升肝素化生理盐水冲洗。通过导管注射每千克1毫升的3%伊文思蓝染料（Evans Blue Dye，简称EBD）。

然后用 0.2 毫升肝素化生理盐水冲洗导管。通过观察大鼠皮肤、眼睛或背部脊髓静脉是否出现蓝色变化，确认尾静脉插管成功。向导管内注射 0.2 毫升微泡团注剂量，并在开始超声辐照前用肝素化生理盐水冲洗。

处死大鼠后，取出脊髓并置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定过夜。次日，用PBS替换多聚甲醛。为观察血脊髓屏障（BSCB）的破坏情况，使用剃刀刀片分离出围绕超声处理部位的两厘米长节段。

使用切片机将组织切成10微米厚的切片，并用苏木精-伊红染色。对于荧光显微镜观察，将含有脊髓切片的载玻片进行脱蜡处理，并用25微升溶解于封片剂中的DAPI复染。将切片在4摄氏度下避光孵育10分钟，以防止荧光淬灭。

孵育后，使用荧光显微镜对所有切片进行成像。使用光学显微镜对苏木精和伊红染色的切片进行成像。脊髓血管在椎板切除术后可见，显示出后脊静脉以及多条向外侧辐射的较小血管。

静脉注射伊文思蓝染料（EBD）后，周围组织和脊髓血管呈现蓝色。超声处理后，靶向区域出现蓝色斑点，表明由于血脊髓屏障（BSCB）被破坏，EBD渗出至脊髓白质实质中。对接受低强度聚焦超声（LIFU）超声处理的大鼠取出的脊髓组织进行观察，证实了EBD明显渗入脊髓。

未接受LIFU处理的阴性对照大鼠未显示EBD外渗现象。接受LIFU声照射的脊髓组织表现出显著更强的EBD自发荧光强度，高于未接受声照射的脊髓组织，且两组中DAPI的荧光强度相似。

苏木精-伊红染色分析显示，超声处理部位未见神经元损伤、出血或空腔样病变。作为对比，图中展示了因手术操作不当及高强度超声导致脊髓损伤的示例。在接受微泡联合低强度聚焦超声治疗的大鼠中，术前、术后以及为期五天的存活期间，运动评分均未发生改变。

在超声处理分析之前、期间和之后，脊髓温度均未观察到明显变化。在椎板切除术中应尽量减少对脊髓的手术损伤。通过显微镜观察苏木精和伊红（H&E）染色切片，可判断是否发生任何损伤。

在利用聚焦超声破坏血-脊髓屏障后，可向动物体内注射抗肿瘤药物或基因治疗剂。该结果将确定此技术是否能够改善治疗药物的递送效果，并延长脊髓病变情况下的生存期。