Name: 在胸腺的鼠标采用双光子显微镜的原位成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学习使用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像技术，观察T细胞迁移与选择机制。该方法可实时追踪单细胞动态，为免疫学研究提供高分辨率活体成像方案。

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感谢 Matt Paul 和 Jimmy Wu 提供的技术支持。

过继性转移
在出生后前3至7天内，使用胰岛素注射器对新生小鼠进行2至4次骨髓注射，每次50-100 µL，最终达到供体与受体比例为1:1。注射部位应位于胸骨和肋骨下方，但高于肠道和胃部。进针深度应足以穿透腹膜，注意避免刺破膈肌。注射过程中部分骨髓流失是常见现象。注射时可适当放松对幼鼠的抓握，使皮肤得以伸展，从而减少流失，并在注射完成后缓慢拔出针头。
胸腺的解剖
沿中线做切口，剪开或撕开皮肤以暴露肋骨。抓住胸骨，切开腹膜和膈肌。沿肋骨两侧向上剪开，以暴露胸腔。胸腺位于心脏上方。为保持胸腺结构完整，在分离胸腺时应握住周围组织。用PBS冲洗胸腺，防止其在解剖过程中干燥。轻轻剥离胸腺被膜表面的多余组织，并将两个叶分开。
准备组织以进行成像
使用兽用组织粘合剂将胸腺粘附到方形盖玻片上。用移液器滴加微量粘合剂，将胶水涂抹至与胸腺大致相同的长度和宽度。固定胸腺位置，使其紧贴盖玻片，并将其拖动至合适位置。
双光子成像
将组织浸没在不含酚红的DMEM中，用95%氧气和5%二氧化碳灌流，并加热至37°C。双光子激发采用调谐至900 nm的Spectra-Physics MaiTai激光器实现，CFP、GFP、YFP和Texas Red的发射光通过495、515、560二向色镜分离，并使用PMT检测器收集。

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过胸腺中的双光子成像，我们能够在活体、完整的器官中观察胸腺内选择事件所依赖的细胞相互作用与迁移过程。

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

双光子显微镜（TPM）使我们能够深入胸腺内部成像，记录对胸腺细胞发育至关重要的事件。为了在大量胸腺细胞中追踪单个细胞的迁移行为，我们构建了新生期嵌合体，其中少于百分之一的胸腺细胞来源于一种转基因供体，该供体普遍表达一种荧光蛋白。为了生成这类部分造血嵌合体，我们在新生受体出生后3至7天内向其注射骨髓细胞。4至6周后，处死小鼠，小心解剖并沿中线切开胸腺，以保持待成像组织的原有结构。将胸腺组织用胶固定在盖玻片上，为TPM的离体成像做准备。成像过程中，胸腺组织被置于不含酚红的DMEM培养基中，并持续灌流含95%氧气和5%二氧化碳的气体，同时将温度维持在37°C。利用该方法，我们可以研究生成多样化T细胞受体库所需的关键事件。

我们提供了生成新生嵌合体的逐步操作说明，以及为进行双光子显微镜离体成像而进行的胸腺解剖与制备方法。

双光子显微镜（TPM）使我们能够对胸腺深层进行成像，并记录对胸腺细胞发育至关重要的事件。为了追踪……

双光子成像在免疫学中具有重要价值，因为它使我们能够追踪单个细胞在与其微环境相互作用过程中的迁移行为。通过观察胸腺内细胞的迁移位点，利用双光子显微镜，我们可以解析阳性选择和阴性选择的机制。大家好，我是来自加州大学伯克利分校 Ellen Roby 博士实验室的 Ina Lottie。这位是同样来自 Ellen Roby 实验室的 Paul Herzmark。今天我们将向您展示如何对胸腺组织进行原位成像，我将介绍如何使用双光子显微镜对胸腺进行成像。接下来，我将为您展示进行双光子成像前的各个步骤。这些步骤包括：从骨髓中分离造血干细胞、将骨髓细胞过继转移至新生小鼠、胸腺的解剖与切半处理，以及为双光子激光扫描显微镜成像准备组织样本。现在我们开始吧。在准备胸腺进行成像之前，我们必须首先将骨髓细胞过继转移至新生小鼠体内。这些骨髓细胞来源于全身性表达GFP的转基因小鼠的后肢。这是一支含有50 µL骨髓的胰岛素注射器。我们对3至7日龄的宿主进行2到4次注射，每只幼鼠注射均使用来自同一供体的骨髓。此处为一只5日龄幼鼠，需捏住背部皮肤以防止注射过程中幼鼠移动，并使皮肤保持紧绷。注射部位应选择在肺和肋骨下方，但位于肠道和胃部上方的位置。注射时，应逐渐放松对皮肤的抓握，使其得以伸展。最后，缓慢拔出注射器，以尽量减少骨髓的流失。这些小鼠将被饲养4至6周，随后可取出胸腺进行成像。经过四到六周后，可以移除胸腺。用于成像时，我将使用一套大型镊子和剪刀，以及一套小型镊子和剪刀。该组织已根据我们的动物使用规程处死，并用乙醇喷洒消毒。我将使用大号镊子夹住皮肤，并在正中线处做一切口。现在我可以使用剪刀沿正中线剪开，也可以将皮肤从腹膜上撕开，然后用针固定皮肤以暴露胸腔。我将抓住胸骨，在切开腹膜时作为支点，通过膈肌进入胸腔，然后沿肋骨 cage 的两侧剪开。你可以看到胸腺就位于心脏的上方。我要把它们放回原位。这就是胸腺。我将避免触碰它。你使用较小的镊子，仍然夹住胸腺周围的组织。好的，现在我将用一些 PBS 喷洒，并开始去除部分多余的组织。因此，我将使用胸腺周围的组织进行抓握。在清理胸腺时，我会小心地剪除多余的组织。现在，在清理过程中，我们还需要将胸腺的两个叶分离。但首先，我要清除附着在胸腺表面的所有这些额外血管。我需要非常小心，以免破坏我们将要成像的胸腺结构，因此我仅移除位于表面的组织。现在我将开始轻轻分离这两个叶。这是腹侧叶和背侧叶，我们将要将其分开，并轻轻切割组织，小心地分离。我们不希望组织变干，因此会滴加少量 PBS 液体到组织上。现在我已经将两个叶分离。这是背侧叶，具有特征性的吉他形状。而这里是腹侧叶。我将清理掉每个叶上的多余组织，以确保成像区域没有多余的组织遮挡。但在清理时会保留少量组织，以便我们能够抓握甲状腺。在成像过程中，如果存在这些不必要的多余组织，将会降低成像质量；因此，将其去除可以显著提高图像质量。现在我们已获得两个已切开的叶，可准备将其固定到盖玻片上进行成像。为了制备用于成像的切开胸腺，您需要一些兽用组织粘合剂和 18 × 18 的盖玻片。我喜欢使用移液器在盖玻片上滴加少量（不足一微升）的胶水。因此，我将滴加一滴胶水，其长度大约与我们将要成像的胸腺相当。然后我喜欢将胶水摊开，使其覆盖范围与胸腺的宽度一致。这样，我可以将两个胸腺叶放置在同一盖玻片上。所以我要在这里再放一个。我会从多余组织中拿起一个叶，将其放在盖玻片上，然后拖动到有胶水的区域。另一个叶我也采用同样的方法，再次将手靠在没有胶水的盖玻片位置以保持稳定，然后将另一个胸腺小叶放置在盖玻片上。现在我们已将两个胸腺球体固定在盖玻片上，接下来将其交给保罗进行成像。谢谢伊娜。让我们取这个样品，并将其放入我们将用于成像的 DME 培养基中。这是我们的双光子显微镜装置。双光子显微镜非常适用于免疫细胞成像，因为可以深入胸腺内部，观察荧光标记的细胞运动。该技术利用脉冲红外激光激发细胞产生荧光。我们在家用腰带式显微镜上配备了四种不同的相机，可同时观察四种不同的荧光颜色，并使用一种特殊的物镜，放大倍数为 20 倍。这种物镜可浸入我们已将胸腺组织浸没其中的 DMEM 培养基中，使其具有 0.95 的数值孔径（na），这一性能非常出色，可使我们的细胞呈现明亮的成像效果。为了维持组织的健康状态，我们向 DMEM 培养基中通入 95% 氧气和 5% CO2 的混合气体进行鼓泡供气。随后，灌注液被泵送至灌流室，在其中加热至37摄氏度，胸腺叶即浸没于此环境中。利用该系统，我们可使胸腺内的细胞在成像过程中保持健康状态长达四小时。至此，我已向您展示了如何为双光子显微镜设置成像系统。现在让我们观看这段循环播放的影片中的一些结果。您可以看到我们以四种不同颜色成像的胸腺组织。其中红色显示的是胸腺中的血管，黄色则是表达黄色荧光蛋白的宿主来源树突状细胞，该蛋白在树突状细胞特异性启动子的调控下表达。您在此处看到的蓝色和绿色胸腺细胞来自两个不同的供体，我们使用过继转移技术将它们制备成新生嵌合体，该技术此前由Ena向您展示过。绿色细胞是表达绿色荧光蛋白的胸腺细胞，而蓝色细胞则是来自表达青色荧光蛋白的供体的胸腺细胞。这是此前我向您展示过的同一段循环视频，但我想向您展示我们为生成这些视频所采集数据集的三维特性。我们首先聚焦于一个平面并拍摄一张图像，然后稍微加深焦距再拍摄另一张图像，继续略微加深焦距拍摄下一张图像。在制作这段视频时，我们总共向下扫描了约60微米，并且每隔约30秒重复采集一次该体积的图像序列，以获得动态的三维图像序列。这段视频的拍摄持续了大约20分钟。这样我们就可以随时间推移在三维空间中追踪细胞。我们刚刚向您展示了如何使用双光子显微镜对胸腺进行成像。该实验操作最关键的步骤有两点：第一，向新生小鼠注射供体的骨髓细胞。第一步，解剖并分离胸腺，注意不要破坏其结构；第二步，将胸腺牢固地附着在盖玻片上；第三步，使用双光子显微镜进行成像。通过对胸腺进行成像，可以解答有关胸腺细胞发育以及多样性T细胞受体库生成的诸多科学问题。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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