Name: 在胸腺的鼠标采用双光子显微镜的原位成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学习使用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像技术，观察T细胞迁移与选择机制。该方法可实时追踪单细胞动态，为免疫学研究提供高分辨率活体成像方案。

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感谢 Matt Paul 和 Jimmy Wu 提供的技术支持。

过继性转移
在出生后前3至7天内，使用胰岛素注射器对新生小鼠进行2至4次骨髓注射，每次50-100 µL，最终达到供体与受体比例为1:1。注射部位应位于胸骨和肋骨下方，但高于肠道和胃部。进针深度应足以穿透腹膜，注意避免刺破膈肌。注射过程中部分骨髓流失是常见现象。注射时可适当放松对幼鼠的抓握，使皮肤得以伸展，从而减少流失，并在注射完成后缓慢拔出针头。
胸腺的解剖
沿中线做切口，剪开或撕开皮肤以暴露肋骨。抓住胸骨，切开腹膜和膈肌。沿肋骨两侧向上剪开，以暴露胸腔。胸腺位于心脏上方。为保持胸腺结构完整，在分离胸腺时应握住周围组织。用PBS冲洗胸腺，防止其在解剖过程中干燥。轻轻剥离胸腺被膜表面的多余组织，并将两个叶分开。
准备组织以进行成像
使用兽用组织粘合剂将胸腺粘附到方形盖玻片上。用移液器滴加微量粘合剂，将胶水涂抹至与胸腺大致相同的长度和宽度。固定胸腺位置，使其紧贴盖玻片，并将其拖动至合适位置。
双光子成像
将组织浸没在不含酚红的DMEM中，用95%氧气和5%二氧化碳灌流，并加热至37°C。双光子激发采用调谐至900 nm的Spectra-Physics MaiTai激光器实现，CFP、GFP、YFP和Texas Red的发射光通过495、515、560二向色镜分离，并使用PMT检测器收集。

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过胸腺中的双光子成像，我们能够在活体、完整的器官中观察胸腺内选择事件所依赖的细胞相互作用与迁移过程。

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

双光子显微镜（TPM）使我们能够深入胸腺内部成像，记录对胸腺细胞发育至关重要的事件。为了在大量胸腺细胞中追踪单个细胞的迁移行为，我们构建了新生期嵌合体，其中少于百分之一的胸腺细胞来源于一种转基因供体，该供体普遍表达一种荧光蛋白。为了生成这类部分造血嵌合体，我们在新生受体出生后3至7天内向其注射骨髓细胞。4至6周后，处死小鼠，小心解剖并沿中线切开胸腺，以保持待成像组织的原有结构。将胸腺组织用胶固定在盖玻片上，为TPM的离体成像做准备。成像过程中，胸腺组织被置于不含酚红的DMEM培养基中，并持续灌流含95%氧气和5%二氧化碳的气体，同时将温度维持在37°C。利用该方法，我们可以研究生成多样化T细胞受体库所需的关键事件。

我们提供了生成新生嵌合体的逐步操作说明，以及为进行双光子显微镜离体成像而进行的胸腺解剖与制备方法。

双光子显微镜（TPM）使我们能够对胸腺深层进行成像，并记录对胸腺细胞发育至关重要的事件。为了追踪……

双光子成像在免疫学中具有重要价值，因为它使我们能够追踪单个细胞在与其微环境相互作用过程中的迁移行为。通过观察胸腺内细胞的迁移位点，利用双光子显微镜，我们可以解析阳性选择和阴性选择的机制。大家好，我是来自加州大学伯克利分校 Ellen Roby 博士实验室的 Ina Lottie。这位是同样来自 Ellen Roby 实验室的 Paul Herzmark。今天我们将向您展示如何对胸腺组织进行原位成像，我将介绍如何使用双光子显微镜对胸腺进行成像。接下来，我将为您展示进行双光子成像前的各个步骤。这些步骤包括：从骨髓中分离造血干细胞、将骨髓细胞过继转移至新生小鼠、胸腺的解剖与切半处理，以及为双光子激光扫描显微镜成像准备组织样本。现在我们开始吧。在准备胸腺进行成像之前，我们必须首先将骨髓细胞过继转移至新生小鼠体内。这些骨髓细胞来源于全身性表达GFP的转基因小鼠的后肢。这是一支含有50 µL骨髓的胰岛素注射器。我们对3至7日龄的宿主进行2到4次注射，每只幼鼠注射均使用来自同一供体的骨髓。此处为一只5日龄幼鼠，需捏住背部皮肤以防止注射过程中幼鼠移动，并使皮肤保持紧绷。注射部位应选择在肺和肋骨下方，但位于肠道和胃部上方的位置。注射时，应逐渐放松对皮肤的抓握，使其得以伸展。最后，缓慢拔出注射器，以尽量减少骨髓的流失。这些小鼠将被饲养4至6周，随后可取出胸腺进行成像。经过四到六周后，可以移除胸腺。用于成像时，我将使用一套大型镊子和剪刀，以及一套小型镊子和剪刀。该组织已根据我们的动物使用规程处死，并用乙醇喷洒消毒。我将使用大号镊子夹住皮肤，并在正中线处做一切口。现在我可以使用剪刀沿正中线剪开，也可以将皮肤从腹膜上撕开，然后用针固定皮肤以暴露胸腔。我将抓住胸骨，在切开腹膜时作为支点，通过膈肌进入胸腔，然后沿肋骨 cage 的两侧剪开。你可以看到胸腺就位于心脏的上方。我要把它们放回原位。这就是胸腺。我将避免触碰它。你使用较小的镊子，仍然夹住胸腺周围的组织。好的，现在我将用一些 PBS 喷洒，并开始去除部分多余的组织。因此，我将使用胸腺周围的组织进行抓握。在清理胸腺时，我会小心地剪除多余的组织。现在，在清理过程中，我们还需要将胸腺的两个叶分离。但首先，我要清除附着在胸腺表面的所有这些额外血管。我需要非常小心，以免破坏我们将要成像的胸腺结构，因此我仅移除位于表面的组织。现在我将开始轻轻分离这两个叶。这是腹侧叶和背侧叶，我们将要将其分开，并轻轻切割组织，小心地分离。我们不希望组织变干，因此会滴加少量 PBS 液体到组织上。现在我已经将两个叶分离。这是背侧叶，具有特征性的吉他形状。而这里是腹侧叶。我将清理掉每个叶上的多余组织，以确保成像区域没有多余的组织遮挡。但在清理时会保留少量组织，以便我们能够抓握甲状腺。在成像过程中，如果存在这些不必要的多余组织，将会降低成像质量；因此，将其去除可以显著

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科研

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生物学

在胸腺的鼠标采用双光子显微镜的原位成像

双光子成像已揭示了在基础状态及免疫应答过程中淋巴结内淋巴细胞的运动性及细胞间相互作用1。本文中，我们展示了T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及离体淋巴结中CD4+...

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实时 体内 通过激光扫描显微镜追踪眼前房中的胸腺细胞

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