在胸腺的鼠标采用双光子显微镜的原位成像

我们目前新生儿嵌合体的产生，以及编制胸腺体外成像双光子显微镜和解剖一步一步的指示。

双光子成像对免疫学很有用，因为它使我们能够跟踪单个细胞在遇到环境时的迁移。通过跟踪胸腺部位迁移。使用双光子显微镜，我们可以表征正选择和负选择的机制。

大家好，我是来自加州大学伯克利分校 Ellen Roby 博士实验室的 Ina Lottie。我是 Paul Herzmark，也来自 Ellen Robbie 的实验室。今天，我们将向您展示我们如何对胸腺组织进行原位成像，我将向您展示如何使用双光子显微镜对胸腺进行成像。

我将向您展示实现双光子成像的步骤。这包括以下程序，从骨髓中分离造血干细胞，将骨髓细胞过继转移到新生儿中，解剖和剖分胸腺，准备组织通过双光子激光扫描显微镜成像。那么让我们开始吧。

在我们准备胸腺成像之前，我们必须首先将骨髓细胞过继转移到新生小鼠中。这些骨髓细胞是从普遍表达 GFP 的转基因小鼠的后腿中分离出来的。这是一个装有 50 微升骨髓的胰岛素注射器。

我们对 3 到 7 天大的宿主进行 2 到 4 次注射，每注射一只幼犬使用一名供体的骨髓。在这里，我们有一只 5 天大的幼犬，将皮肤向后捏，以防止幼犬在注射过程中移动并保持皮肤顶部。瞄准位于肺和胸腔下方，但高于肠道和胃的注射部位。

注射时，松开对皮肤的抓握，使其膨胀。最后，慢慢取出注射器以限制骨髓的流失量。这些小鼠将被允许发育四到六周，然后可以切除胸腺进行成像。

四到六周后，可以切除胸腺。对于成像，我将使用一组大镊子和剪刀以及一组小镊子和剪刀。因此，已根据我们的动物使用方案处死了该质量，并用乙醇喷洒了下来。

我将使用大镊子捏住皮肤并在中线处做一个切口。现在我可以用剪刀剪掉中线，或者我可以从腹膜上撕下皮肤，然后固定皮肤以露出胸腔。我将用胸骨固定，同时切开腹膜，通过横膈膜进入胸腔，然后沿着胸腔的侧面切开。

你可以看到胸腺躺在心脏的正上方。我要把它们放回去。所以有胸腺。

我要避免碰它。您使用较小的镊子，仍然抓住胸腺周围的组织。好了，现在我要用一些 PBS 喷洒它，然后开始去除一些多余的组织。

所以我要用胸腺周围的组织来固定。当我清理胸腺时，我要去除多余的组织，小心翼翼地把它剪掉。现在胸腺中有两个叶，我们也必须在清理时将其分开。

但首先，我要去除胸腺表面的所有这些多余血管。我非常小心，不要打扰我们将要成像的胸腺结构。所以我只从表面的纸巾上拉下来。

现在我要慢慢地开始分离两个叶。这是我们将要分离的腹叶和背叶，轻轻地切割组织，将它们分开。我们不想让组织变干，所以我们要喷一点 PBS 到上面。

现在我已经将两个叶分开了。所以这是背叶，它具有独特的吉他形状。这就是这里的腹叶。

我将清除每个肺叶上多余的组织，以便成像区域没有多余的组织。但我只留下一点纸巾让我们抓住 thys。当我们成像时，我们将通过这些多余的组织进行成像，这真的没有必要，它会通过去除它来提高我们的图像质量。

所以现在我们已经有了两个一分为二的叶，它们已经准备好安装到盖玻片上进行成像。为了准备一分为二的胸腺进行成像，您需要一些兽用组织粘合剂和 18 x 18 的盖玻片。我喜欢用管子 petman 将一小部分微升的胶水涂在盖玻片上。

所以我要滴一滴胶水，大约是我们将要成像的胸腺长度。然后我喜欢把它传播开来。因此，如果这是胸腺的宽度，我再次将两个叶放在同一个盖玻片上。

所以我要在这里放另一个。所以我要从多余的组织中取出肺叶，把它放在盖玻片上，然后把它拖到胶水所在的区域。我将对另一个肺叶做同样的事情，再次触摸没有胶水来稳定我的手的盖玻片，然后将另一个胸腺球放在盖玻片上。

现在我们已经将两个胸腺球体都贴在了盖玻片上，我们要把它交给 Paul 进行成像。谢谢你，Ina。让我们取这个样本，并将其放入我们将用于成像的 DME 介质中。

这就是我们的双光子显微镜设置。双光子显微镜非常适合免疫细胞成像，因为您可以深入观察胸腺并看到荧光细胞的移动。它使用脉冲红外激光使细胞发出荧光。

我们的家用带式显微镜有四个不同的相机，使我们能够同时观察四种不同的颜色，并使用一个特殊的物镜，放大倍率为 20 倍。这是一个特殊的晶状体，浸入我们将其浸入胸腺的 DME 培养基中，使其具有 0.95 na，这非常好，将使我们的细胞非常明亮。为了保持组织健康，我们通过 DMEM 培养基中喷射 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳。

从那里，它被泵送到灌注室，在那里它被加热到 37 度，这就是胸腺叶被淹没的地方。有了这个系统，我们可以保持胸腺中的细胞健康，进行四个小时的成像。因此，我向您展示了如何设置双光子显微镜的成像。

现在让我们看看这个循环播放的电影中的一些结果。您可以在此处看到我们以四种不同颜色成像的胸腺。红色是来自胸腺的血管，黄色是来自宿主的树突状细胞，它们在树突状细胞特异性启动子的控制下表达黄色荧光蛋白。

您在这里看到的蓝色和绿色胸腺细胞来自两个不同的供体，我们使用 Ena 之前向您展示的过继转移技术来制造新生儿嵌合体。绿色细胞是表达绿色荧光蛋白的胸腺细胞，蓝色细胞是来自表达青色荧光蛋白的甜甜圈的胸腺细胞。这与我之前向您展示的循环电影相同，但我想向您展示我们为获取这些电影而收集的数据集的三维性。

我们聚焦在一个平面上，拍摄一张图像，然后聚焦得更深一点，拍摄另一张图像，再深入一点。然后对于这部电影，我们减小了大约 60 微米，然后我们大约每 30 秒重复一次该体积的图像，以获得移动的体积。而这部电影拍摄了大约 20 分钟。

因此，我们可以随着时间的推移通过三个维度跟踪细胞。我们刚刚向您展示了如何使用两台照片显微镜对胸腺进行成像。该程序最重要的方面是 1，为新生儿注射来自供体的骨髓。

二，解剖和 bi，在不损坏其结构的情况下解剖胸腺。三、将胸腺牢固地附着在盖玻片上 四 使用双光子显微镜成像。胸腺成像可以回答有关胸腺细胞发育和多样化 T 细胞库产生的许多问题。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。