Name: 小鼠真皮淋巴内皮细胞分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学习磁珠分选法分离小鼠真皮淋巴内皮细胞，用于体外生理学研究。该方法无需流式细胞仪即可获得高纯度LYVE1阳性细胞，为内皮细胞功能研究提供可靠替代方案。

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本工作由希腊研究与创新基金会（00376）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、美国国家癌症研究所（NCI）[资助号 R15CA231339]、德克萨斯理工大学健康科学中心（TTUHSC）药学院科学事务办公室拨款（授予 C.M.M.）、路易斯安那门罗大学药学院启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）通过国家普通医学科学研究所[资助号 P20 GM103424-21]以及路易斯安那州立大学理事会研究竞争力子项目（RCS）通过理事会支持基金（LEQSF(2021-24)-RD-A-23）（授予 G.M.）资助。共同使用的TTUHSC设备由德克萨斯癌症预防研究所（CPRIT）资助项目RP190524和RP200572提供。资助方未参与研究设计、撰写决定或稿件准备。图 1A 中的图形摘要由 BioRender.com 制作。

动物实验根据德克萨斯理工大学健康科学中心（TTUHSC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案在TTUHSC进行，以及根据第2010/63号指令由西希腊州兽医管理局批准的方案在帕特雷大学进行。处理动物废弃物时，应严格遵守废弃物处置规定。
1. 小鼠真皮组织的分离
<ol>
	<li>第1天 
	注意：第1天；准备好以下材料和设备：麻醉室、动物毛发剪刀、异氟烷、精细镊子、0.2 µm注射器滤器。
	<ol>
		<li>在DMEM中配制含1×抗生素-抗真菌溶液的2 mg/mL Dispase溶液，并进行过滤除菌。 
		注意：可使用HBSS替代培养基或PBS，因其已在其他报道中成功应用&#160;实验方案121x 抗生素-抗真菌素溶液可用青霉素（100 I.U./mL）、链霉素（100 µg/mL）和两性霉素（2.5 µg/mL）替代。</li>
		<li>将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉（异氟烷浓度：0.5–2%，气流速度：1 L/min）。待小鼠停止活动后，将其移出笼具，通过鼻罩继续维持麻醉，异氟烷气流速度保持相近。通过夹趾反应检测以确认麻醉深度，并持续监测小鼠状态，确保维持深度麻醉（无运动反应）。剪除约9 cm2 沿中线使用毛发修剪器纵向剃除小鼠背部和腹部的背侧与腹侧毛发。让小鼠从麻醉中恢复后放回笼中。 
		注意：可改用脱毛膏。确保在保持皮肤完整性的前提下，彻底清除待分离区域皮肤上的毛发。尽量剪除更广泛的毛发&#160;尽可能扩大皮肤区域。为确保脱毛可能引起的炎症完全消退，细胞分离必须在第二天进行。为增加分离细胞的数量，每组 pooling 2 至 4 只小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天 
	注意：请准备好以下材料和设备：安乐死舱、生物安全柜、CO₂2 培养箱，乙醇，精细剪刀，精细镊子，钝头镊子，100 mm 组织培养皿，Dispase，DMEM，1× 抗生素-抗真菌溶液。
	<ol>
		<li>通过 CO 处死小鼠2 给药后将其置于仰卧位，暴露已剪毛区域。喷洒70%乙醇进行消毒。 
		注意：从这一步开始，所有步骤都必须在无菌条件下（在生物安全柜中）进行。</li>
		<li>将一个无菌的100 mm组织培养皿置于冰上。</li>
		<li>在腹部做一个0.5英寸的浅表切口，沿中线纵向切至颈部和下腹部。做横向切口，以便将皮肤掀开。 
		注意：切口大小和分离的皮肤区域面积取决于小鼠的体型。</li>
		<li>使用钝头镊子，小心地将皮肤与周围组织分离。操作时围绕小鼠整个躯干进行，在颈部和下腹部侧面横向剪开皮肤。</li>
		<li>将皮肤小心放入100 mm组织培养皿中，确保真皮面朝下，并尽可能保持皮肤伸展。盖好培养皿，置于冰上。完成该组所有小鼠皮肤的分离操作。</li>
		<li>从小鼠中取出皮肤后，将培养板在室温下孵育10分钟，以使外植体展平。</li>
		<li>加入6 mL Dispase溶液至培养皿中，确保皮肤完全浸没，于4 °C轻微振荡孵育过夜。 
		注意：除了使用Dispase，也可进行胰蛋白酶消化12，随后用Liberase替代胶原酶II型处理（如下所述）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从真皮中分离细胞
<ol>
	<li>第3天 
	注意：提前准备好以下材料和设备：离心机、CO2 培养箱、生物安全柜、剪刀、DMEM、1× 抗生素-抗真菌溶液、II型胶原酶、PBS、50 mL 圆锥形离心管、100 mm 和 60 mm 组织培养皿、DNA酶I溶液、I型胶原蛋白、70 µm 和 40 µm 细胞筛网、0.2 µm 注射器滤器、LEC 培养基。
	<ol>
		<li>配制500 mL 1× PBS（1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na2HPO4、18 mM KH2PO4，pH 7.4），在15 psi条件下高压灭菌20分钟，或通过过滤除菌。也可使用市售的无菌PBS。</li>
		<li>在含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM中配制10 mL浓度为2 mg/mL的II型胶原酶溶液，并进行过滤除菌。 
		注意：后续步骤应在无菌操作台中进行，以降低样品污染风险。</li>
		<li>使用移液器从培养皿中移除液体。</li>
		<li>使用镊子将真皮层（皮肤底部）与表皮层（顶部）分离，并去除明显的脂肪组织。将真皮层转移至洁净的组织培养皿中。</li>
		<li>在洁净的组织培养皿中加入1 mL含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM，并倾斜培养皿使液体聚集于一侧。</li>
		<li>将真皮组织剪切成1–2 mm2大小的碎片，并转移至新的50 mL圆锥形离心管中。 
		注意：此步骤理想情况下应在4–5分钟内完成，因处理时间过长不会显著提高细胞得率或存活率。</li>
		<li>加入10 mL II型胶原酶溶液。</li>
		<li>加入50 µL DNA酶I溶液（终浓度25单位/mL，用于减少细胞聚集），在37 °C下以持续振荡（使用转速为30–50 rpm的旋转/摇床培养箱）消化2小时。 
		注意：应定期检查，确认大部分真皮组织是否已被消化。若未充分消化，可酌情延长消化时间（最多额外1小时）并提高振荡速度。</li>
		<li>用2 mL浓度为10 µg/mL的I型胶原蛋白（溶于0.02 M乙酸）包被60 mm组织培养皿，37 °C孵育&#62;20分钟。用无菌PBS洗涤2次。</li>
		<li>使用70 µm细胞筛网过滤细胞悬液，在250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用10 mL含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用40 µm细胞筛网再次过滤细胞悬液，在250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL完全LEC培养基（内皮细胞生长基础培养基加补充剂）重悬细胞。</li>
		<li>将细胞接种至胶原蛋白包被的60 mm组织培养皿中，使用完全LEC培养基培养。此为细胞培养的第0天。</li>
		<li>每隔2天更换一次培养基，先用1× PBS洗涤细胞两次，再加入新鲜的LEC培养基。</li>
		<li>重复步骤2.1.15，直至细胞融合度达到80–90%。 
		&#8203;注意：若在细胞融合度未达80–90%前进行纯化，所获得的淋巴管内皮细胞数量将减少。该过程通常需要7至10天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用LYVE-1抗体包被磁珠
注意：纯化步骤前一天，请准备好以下材料和设备：4 °C 冰箱、转子、磁力分离器、PBS、抗兔 IgG 磁珠、微量离心管、0.2 µm 注射器滤器、磁珠包被溶液、LYVE-1 抗体。
<ol>
	<li>配制磁珠包被液：将20 mL PBS中加入0.1% BSA和2 mM EDTA，过滤除菌。储存于4 °C。
	 
	注意：不建议储存超过数天；使用前需检查是否有沉淀或污染。</li>
	<li>用移液器将500 µL抗兔IgG磁珠加入微量离心管中，并加入1 mL预冷的磁珠包被液。</li>
	<li>使用磁力分离器清洗磁珠。</li>
	<li>用1 mL预冷的磁珠包被液重复洗涤2次。</li>
	<li>将磁珠重悬于500 µL磁珠包被液中，并分装至微量离心管中，每管150 µL。</li>
	<li>向每管中加入15 µg LYVE-1抗体（取自1 mg/mL抗体储备液的15 µL）。</li>
	<li>在4 °C下孵育过夜&#160;，持续振荡。</li>
</ol>
4. 淋巴管内皮细胞纯化
注意：准备好以下材料和设备：CO2 培养箱、摇床、计时器、封口膜、DMEM、1× 抗生素-抗真菌溶液、BSA、PBS、磁珠包被溶液、胰蛋白酶-EDTA、100 mm 或 60 mm 组织培养皿、0.2 µm 注射器滤器、I 型胶原蛋白、乙酸、LEC 培养基。
<ol>
	<li>准备 50 mL DMEM，添加 1× 抗生素-抗真菌溶液和 0.1% BSA，并进行过滤除菌。</li>
	<li>用含有 10 µg/mL I 型胶原的 0.02 M 乙酸溶液在 37 °C 下对 60 mm 组织培养板包被 &#62;20 分钟，然后用无菌 PBS 洗涤 2 次。</li>
	<li>使用磁力分离器，用 1 mL 磁珠包被溶液洗涤预包被的磁珠。</li>
	<li>将磁珠重悬于 150 µL 含 0.1% BSA 的 DMEM 中。 
	注意：磁珠可在 4 °C 下保存长达 1 个月。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>向细胞中加入 3 mL 含 0.1% BSA 的 DMEM（适用于 60 mm 组织培养板）以及 50 µL 抗体偶联磁珠。 
	注意：若合并来自两只或更多小鼠的细胞，则使用 100 mm 组织培养板，并加入 6 mL 含 0.1% BSA 的 DMEM。</li>
	<li>用封口膜密封培养皿。</li>
	<li>将培养皿置于摇床上，在室温下以 10 RPM 振荡，准确孵育 10 分钟。 
	注意：孵育时间过长会导致非特异性结合。为确保磁珠与整个培养板表面充分接触，应在振荡过程中每隔几分钟手动旋转培养板一次。</li>
	<li>弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。快速检查细胞，确认培养板上存在淋巴管内皮细胞（LEC）克隆。</li>
	<li>胰酶消化细胞：加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 3 分钟，观察细胞是否成功脱落。</li>
	<li>加入 2 mL 完全 LEC 培养基中和反应，将细胞悬液转移至 5 mL 无菌聚丙烯管中。</li>
	<li>使用磁力分离器，用含 0.1% BSA 的 DMEM 洗涤细胞 4 次，每次 3 mL，以去除未结合的细胞。</li>
	<li>将剩余的磁珠结合细胞重悬于完全 LEC 培养基中，并接种至先前经胶原包被的 60 mm 组织培养板中。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育细胞，每次用 PBS 洗涤两次后，每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>继续培养细胞直至达到汇合状态（通常需要 7 至 10 天）。</li>
	<li>此时，在显微镜下检查细胞的汇合程度，并进行流式细胞术前的细胞准备。若检测到较高比例的 F4/80+ 细胞，则应重复使用 LYVE-1（步骤 4：淋巴管内皮细胞纯化）再次进行纯化，或理想情况下使用其他淋巴管标志物（如 podoplanin14）。 
	&#8203;注意：已有研究证实，磁珠纯化后的细胞群体中，抗体所靶向蛋白的表达水平较高15,16。然而，对于 LYVE-1，进行流式细胞术对照以确定其他 LYVE-1+ 细胞（主要是巨噬细胞）的比例非常重要。LYVE-1 仅在与肿瘤和伤口相关的巨噬细胞亚群中表达，而在健康皮肤中，LYVE-1 的表达更局限于淋巴管内皮细胞17。因此，F4/80 筛查并非必需，而是取决于具体的实验背景。用于演示的小鼠未携带肿瘤或伤口，仅可能存在因脱毛引起的潜在炎症，但我们仍进行了 F4/80 染色，以作为 LYVE-1+ 巨噬细胞比例的基线参考。</li>
</ol>
5. 流式细胞术
注意：准备好以下材料和设备：离心机、CO2 培养箱、计时器、血细胞计数板、EDTA 溶液、1× 抗生素-抗真菌素溶液、BSA、PBS、胰蛋白酶-EDTA、聚丙烯管、0.2 µm 注射器滤器、70% 乙醇、F4/80 FITC 标记抗体。
<ol>
	<li>配制含有 0.1% BSA 的 PBS，并通过滤膜除菌。</li>
	<li>在 PBS 中配制 1 mM EDTA 溶液。</li>
	<li>消化细胞：将细胞与 1 mL 1 mM EDTA 溶液在 37 °C 下孵育 5 分钟。 
	注意：EDTA 溶液孵育是一种较温和的细胞解离方法，可更好地保留跨膜蛋白，因此更优，但需要较长的孵育时间。也可选用胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 1 分钟，但可能影响流式细胞术应用中抗体的结合亲和力。</li>
	<li>用 2 mL 完全 LEC 培养基中和溶液，并将溶液转移至 5 mL 无菌聚丙烯管中。</li>
	<li>在 250 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>重复一次离心和 PBS 洗涤步骤。</li>
	<li>将细胞重悬于含 0.1% BSA 的 PBS 中，使用血细胞计数板或其它方法进行计数。将约 1 × 106 个细胞分装至聚丙烯管中，终体积为 100 µl。从该步骤开始，所有操作均在 4 °C 下进行。 
	注意：细胞可在染色前固定，也可在活细胞状态下染色。固定可能对流式细胞术不理想，因为某些抗体在固定后可能无法识别抗原；因此，建议在上一步完成后立即进行流式细胞术检测，并跳过固定步骤。若无法实现，则可在流式细胞术实验前进行固定，以延迟检测步骤。如需固定，应预先评估抗体在固定细胞条件下的性能表现。</li>
	<li>进行固定（可选步骤；若不进行固定，则直接进行免疫染色）：将细胞重悬于预冷的 70% 乙醇中，在冰上轻轻混匀 10 分钟。 
	注意：乙醇固定可使细胞通透，导致 GFP 释放；而基于多聚甲醛的固定可能破坏流式细胞术所用的染料，理想情况下应避免使用。</li>
	<li>在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 以 250 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。</li>
	<li>继续下一步操作，或将细胞重悬于 0.5–1 mL 1× PBS 中，于 4 °C 保存。</li>
</ol>
6. 免疫染色
注意：尽量轻柔操作细胞，避免过度吹打，以维持细胞膜完整性并减少细胞死亡，确保细胞不形成团块。从分离的内皮细胞中制备以下各组：未染色细胞，以及用其他内皮细胞标志物（如 VEGFR3、podoplanin）、F4/80 分别染色的细胞和同时用两者染色的细胞。如有条件，可包括市售的小鼠淋巴管内皮细胞和巨噬细胞作为阳性对照。出于演示目的，并由于存在内源性 tdTomato 荧光（PE+），我们采用了 FITC 标记的 F4/80 染色。
<ol>
	<li>根据推荐或优化的稀释比例，将一抗用含0.1% BSA的PBS稀释。向100 µL细胞悬液中加入0.5 µg（1 µL抗体溶液）F4/80 FITC标记抗体。</li>
	<li>加入稀释后的荧光标记抗体后，重悬细胞。通过轻弹聚丙烯管混匀，确保无细胞团块且所有细胞均被充分包被。</li>
	<li>避光孵育：固定细胞在室温下孵育1小时，活细胞在冰上孵育30分钟。</li>
	<li>用含0.1% BSA的PBS在避光条件下洗涤细胞两次，每次以250 × g 离心5分钟，活细胞在4 °C下进行，固定细胞在室温下进行。</li>
	<li>对于非荧光标记的一抗：
	<ol>
		<li>将荧光染料标记的二抗用孵育缓冲液稀释。对于Alexa Fluor抗体，使用1:500的稀释比例。</li>
		<li>将二抗加入100 µL细胞悬液中。</li>
		<li>避光孵育30分钟，固定细胞在室温下进行，活细胞在冰上进行。</li>
		<li>用孵育缓冲液洗涤两次，每次以250 × g 离心5分钟，活细胞在4 °C下进行，固定细胞在室温下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于0.5 mL 1× PBS中，并使用流式细胞仪进行分析。</li>
	<li>按照以下设门策略步骤，在LYVE-1表达细胞中鉴定巨噬细胞群体：
	<ol>
		<li>利用前向散射光和侧向散射光区分细胞群体。</li>
		<li>利用前向散射光的面积和高度参数区分单个细胞（单细胞群体，Singlets）。</li>
		<li>结合F4/80（FITC）表达和RFP（PE）表达，在tdTomato（PE）表达的分离小鼠细胞中鉴定巨噬细胞（F4/80+）（由于特定小鼠品系中含有荧光tdTomato报告基因，详见下文描述）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Isolating Endothelial Cells from Murine Dermal Lymphatic Capillaries

<ol><li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+vasculature+in+the+21%28st%29+century%3A+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li>
<li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li>
<li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis%3A+molecular+mechanisms+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li>
<li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lymphangiogenesis+in+cardiovascular+diseases+and+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation.</a> Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).</li>
<li>Patnam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+guidance+mechanisms+and+therapeutic+implications+in+pathological+states+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea.</a> Cells. 12 (2), 319(2023).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).</li>
<li>Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+lymphatic+marker+LYVE-1+and+applications+in+research+into+lymphatic+trafficking+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).</li>
<li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).</li>
<li>Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenase+in+rat+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation.</a> Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).</li>
<li>Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+preparation+and+microscopic+analysis+of+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis.</a> Current Protocols. 2 (7), e464(2022).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+expression+is+negatively+regulated+by+miR-181+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells.</a> Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Choi, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Del-1%2C+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor%2C+limits+inflammatory+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li>
<li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725(2015).</li>
<li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1%2B%2C+F4%2F80%2B%2C+CD11b%2B+macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro%3A+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063(2020).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li>
<li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+dysfunction%2C+not+aplasia%2C+underlies+Milroy+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li>
<li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li>
<li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposiform+lymphangiomatosis%3A+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatris%22%5BJournal%5D)">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li>
<li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).</li>
<li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification%2C+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li>
<li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497(2012).</li>
<li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li>
<li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li>
<li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence%3A+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li>
<li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+sprouting%2C+proliferation%2C+or+senescence%3A+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

淋巴系统是机体稳态功能的重要调节者，其最重要的功能包括维持血浆液体平衡、清除细胞代谢产物和有毒分子、脂质吸收以及免疫细胞的迁移1,19。特异性标志物的发现推动了淋巴系统研究领域新数据的大量涌现，揭示了淋巴脉管系统的一些新功能，例如其在某些器官修复和再生能力中的作用2,3。随着对淋巴系统认知的不断深入，其在多种病理状态中的作用日益明确，改变了以往对该系统的传统认识1。淋巴系统在多种疾病的进展中发挥着重要作用，例如癌症的生长与转移20、米尔罗伊病（一种原发性淋巴水肿）21,22，以及卡波西样淋巴管瘤病，后者是一种以淋巴管扩张和相互连接为特征的罕见疾病23</sup...

淋巴系统在人体生理学中发挥着关键作用。它被视为一种重要的稳态调节因子，参与维持组织-血浆液体平衡、免疫监视以及脂质吸收等重要功能1，同时也涉及一些新近发现的功能，例如心脏的修复能力2以及骨骼再生和造血功能3。尽管淋巴系统具有重要作用，但其在某些生理参数和反应中的具体作用及其调控的分子机制仍不明确。此外，淋巴管系统的结构或功能缺陷是某些病理生理状况的诱发或恶化因素。典型的例子包括原发性和继发性淋巴水肿，分别取决于疾病的遗传性或非遗传性病因；而淋巴系统在原发性肿瘤生长及转移扩散中的作用尤为关键，因其既可作为转移的通道，也可调节免疫功能1。
与血管系统相比，淋巴系统在研究和认知上的滞后，主要归因于淋巴系统的发现时间晚于血液循环系统，以及特异性淋巴分子标志物的鉴定存在延迟。近几十年来，这一状况已得到显著改善，从而改变了人们对稳态及疾病状态下淋巴系统的传统认知1。与血管生成类似，淋巴管生成是指由已有淋巴管形成新淋巴管的过程，在多种疾病的发生发展中发挥关键作用4,5,6。然而，与血管生成不同的是，目前对淋巴管生成的研究主要局限于关注发育过程中血管形成及病理模型中结构缺陷的in vivo模型。分离淋巴内皮细胞对于开展in vitro研究至关重要，本方案将提供实现该目标的具体方法。
已开发出多种从小鼠中分离淋巴管内皮细胞的方案，这些方案需要使用荧光激活细胞分选技术7。当设备可用时，细胞分选仪的优势在于可获得更高纯度的细胞，而基于磁珠的分离方法则产量更高。本方案利用淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）的表达，该分子是一种重要的淋巴管内皮标志物，在淋巴管内的细胞迁移过程中发挥关键作用4,8。由于LYVE-1仅在淋巴毛细管中表达，而在集合淋巴管中不表达，因此该技术适用于特异性分离淋巴毛细管来源的淋巴管内皮细胞，与其他在所有淋巴管内皮细胞中均一表达的淋巴管标志物（如podoplanin）不同9。在本方案中，排除了Prox1等非跨膜结构的其他重要淋巴管标志物。
由于生理结果是淋巴管生成，而淋巴管生成通常起始于淋巴毛细血管，因此选择LYVE-1作为靶标，因其在这些细胞中具有特异性，且所选抗体可获得较高的产量。所用酶包括II型胶原酶（通常认为其在胶原解离方面比I型更有效10）和dispase（一种广谱蛋白酶，常用于真皮与表皮的分离11）；然而，已有其他用于组织分离的酶被报道12,13，也可使用。本方案的目的是描述一种利用磁珠分选技术从成年小鼠淋巴毛细血管中高效分离真皮淋巴内皮细胞的方法，尤其适用于缺乏荧光激活细胞分选设备的实验室。该方法适用于对淋巴内皮细胞纯度要求不高、可接受一定杂质的下游应用。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>动物毛发剪毛器</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11992-20</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 40 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 70 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白，高浓度大鼠尾部来源</td><td>康宁</td><td>354249</td><td>用 H₂O 将 0.02 M 乙酸稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-995-073</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶I溶液（2,500 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-L 磁性颗粒浓缩仪</td><td>Invitrogen</td><td>120-21D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长基础培养基 &amp;和补充剂（LEC 培养基）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM027</td><td></td></tr><tr><td>安乐死舱</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀-锋利</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>Biolegend</td><td>123107</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG 磁珠</td><td>New England Biolabs</td><td>S1432S</td><td></td></tr><tr><td>LARC-A E-Z 麻醉诱导室</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnaBind 山羊抗兔 IgG 珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21356</td><td></td></tr><tr><td>4% PBS 甲醛溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠LYVE-1抗体</td><td>ReliaTech GmbH</td><td>103-PA50</td><td></td></tr><tr><td>旋转/振荡培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>圆底聚丙烯管</td><td>康宁</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>带 0.2 微米滤膜的注射器滤器 &amp;mu;微孔</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

淋巴系统参与免疫监视、脂质吸收以及组织液平衡的调节。小鼠淋巴管内皮细胞的分离是淋巴系统研究中的重要步骤，因为它能够实现后续的 体外 以及对分离细胞进行的生化实验。此外，Cre-lox 技术的发展使得针对无法进行全身性靶向的基因实现组织特异性缺失成为可能，从而精确确定这些基因在所研究组织中的作用。要解析特定基因在淋巴系统生理学和病理生理学中的功能，需要使用淋巴系统特异性启动子，因此必须通过实验验证靶基因的表达水平。
从野生型或转基因小鼠中高效分离淋巴管内皮细胞的方法，使得能够利用离体（ex vivo）和体外（in vitro）实验体系来研究调控淋巴系统功能的机制，并检测目标蛋白的表达水平。我们已开发、标准化并提出了一种基于LYVE-1表达，通过磁珠分选技术高效分离小鼠皮肤来源的淋巴管内皮细胞（DLECs）的实验方案。该方案旨在为研究人员提供一种实用工具，以进一步理解并阐明淋巴管内皮细胞功能中的关键作用分子，尤其适用于缺乏荧光激活细胞分选设备的研究机构。

该方法旨在鉴定一种小GTP酶RhoA的蛋白表达，其编码基因在两个等位基因上均被floxed，并在他莫昔芬诱导的淋巴内皮特异性启动子Prox1-CreERT2 18作用下被删除。分离得到的LEC最多可培养至第四代，之后细胞进入衰老状态。这些细胞已被成功冻存、复苏，并用血管生成素-2进行有效刺激。由于细胞传代次数有限，我们未尝试多次冻融循环。从小鼠分离一次所获得的典型细胞产量可使60 mm培养皿达到40–50%的融合度（约1.5 × 106个细胞），且细胞增殖缓慢，在进行基于LYVE-1的纯化时，培养皿需5天才达到完全融合。
首次纯化后，LYVE-1+ 细胞在 60 mm 培养皿中的汇合度约为 15%（约 4 × 105 个细胞）。第二次纯化为可选步骤，本文所提供的数据和图像均基于仅进行一轮纯化的结果。存在一些未被筛选出的细胞，这些细胞携带磁珠，似乎所结合的磁珠数量不足以实现有效筛选。如前所述，建议在使用 dispase 消化的同时并行添加 DNAse，尽...

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析

淋巴系统参与免疫监视、脂质吸收和组织液平衡的调节。小鼠淋巴管的分离……

本课题组的研究重点是阐明调控内皮细胞生理功能的分子机制。本实验方案介绍了一种基于磁珠分离的方法，用于从缺乏荧光激活细胞分选设备的实验室中获取肾脏内皮细胞，特别是来源于肾内淋巴毛细血管的内皮细胞。该方法可从转基因小鼠中分离出淋巴管内皮细胞，以便在体外研究其生理特性。当后续应用对淋巴内皮细胞纯度要求不高时，该方法尤为适用。此方法可高效获取来源于淋巴毛细血管而非其他收集管的淋巴内皮细胞。此外，在缺乏细胞分选设备的情况下，该方法也是一种理想的替代方案。在生物安全柜内对已安乐死并用70%乙醇适当剃毛和消毒的小鼠进行操作。使用剪刀在动物腹部做一处0.5英寸的浅表切口。沿中线纵向剪开，分别向颈部和下腹部延伸。此外，进行横向切口以掀开皮肤。使用钝头镊子，沿动物躯干周围轻轻将皮肤与周围组织分离，同时在颈部和下腹部横向剪开皮肤。小心地将皮肤放置于100毫米组织培养皿中，使真皮面朝下，并确保皮肤尽可能充分伸展。向培养皿中加入6毫升dispase溶液，确保皮肤完全被覆盖，然后盖上培养皿。用Parafilm封口膜包裹培养皿。在室温下孵育10分钟，以使外植块展平。第二天，使用移液器将含有分离皮肤的培养板中的液体吸出。然后借助镊子将真皮与表皮分离，同时去除其上可见的脂肪组织，并将分离出的真皮放入干净的组织培养板中。向培养板中的真皮加入1毫升含1×抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基。倾斜培养皿，使液体聚集在培养皿的一侧。然后将真皮组织切成 1 至 2 平方毫米大小的片段，并转移至一个新的 50 毫升锥形管中。向管中加入 10 毫升 II 型胶原酶溶液。在37摄氏度下孵育两小时，同时以30至50 RPM持续振荡，以消化真皮组织。将细胞悬液通过70微米细胞筛过滤，并在250 ×g下离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于10毫升含有抗生素-抗真菌溶液的DMEM中。按照先前所述方法，将细胞悬液通过40微米细胞滤网过滤，然后离心。将所得的细胞沉淀重悬于1毫升完全LEC培养基中。随后将细胞接种至经胶原蛋白包被的60毫米组织培养皿中，加入完全LEC培养基进行培养。每两天更换一次培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入新鲜的 LEC 培养基。从鼠类真皮分离的细胞在低倍镜下的图像显示为混合细胞群体。为纯化鼠类淋巴管内皮细胞，需在从鼠类真皮分离的细胞达到约 80% 至 90% 汇合度后使用。首先，使用一毫升磁珠包被液在磁力架中洗涤预先包被的磁性微珠。将微珠重悬于150微升含0.1% BSA的DMEM中。接着，用PBS洗涤60毫米组织培养皿中的细胞两次。将50微升抗体偶联磁珠与含有0.1% BSA的3毫升DMEM混合，加入细胞中。用Parafilm封口膜密封培养皿，然后在摇床中于室温下以10 RPM振荡孵育，精确孵育10分钟。弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。快速检查培养板，确认存在 LEC 克隆。向细胞中加入 1 mL 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 3 分钟以消化细胞。观察细胞以确认是否成功脱离。用两毫升完全LEC培养基中和溶液后，将细胞悬液转移至一个五毫升无菌聚丙烯管中。使用磁力分离器，用含有0.1% BSA的三毫升DMEM洗涤细胞，以去除未结合的细胞。将剩余的珠子结合的细胞重悬于完全LEC培养基中，并接种至胶原包被的60毫米组织培养皿中。纯化后，通过明场和荧光成像可轻松识别出LYVE1阳性的淋巴内皮细胞，并显示有多个珠子附着在细胞上。纯化后24小时，细胞汇合度较低，而纯化七天后则呈现高度汇合状态。

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科研

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Biology

生物学

小鼠真皮淋巴内皮细胞分离

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。...

小鼠肺树突状细胞的分离

本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。...

从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

分离淋巴结基质细胞是一个多步骤过程，包括酶消化和机械解离，以获得纤维状网状细胞、淋巴管和血管内皮细胞。在本描述的方法中，采用短时间消化结合自动化的机械解离，以最大程度减少活的淋巴结基质细胞表面标志物的降解。...

小鼠淋巴结基质细胞的分离

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离人淋巴管畸形囊样血管和包皮中衬覆的淋巴内皮细胞。对这些细胞进行后续培养与扩增，可为基因组学、蛋白质组学、功能研究及细胞分化研究提供更高水平的实验条件。...

通过多参数荧光激活细胞分选法分离人类淋巴管内皮细胞

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

本方案描述了在营养丰富的培养基中对小鼠皮肤进行酶消化，随后通过梯度分离来纯化白细胞。由此获得的细胞可用于多种下游应用。该方法是一种高效、经济且改进的替代方案，可取代组织解离仪以及更剧烈的胰蛋白酶和中性蛋白酶介导的组织消化方案。...

利用酶解法和梯度分离法从小鼠皮肤中分离浸润性白细胞

本文介绍了一种从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞的实验方案，该方法适用于在皮肤内注射疟原虫（Plasmodium）子孢子后的情况。对所获取细胞进行流式细胞术分析，可可靠地检测皮肤及引流淋巴结对寄生虫引发的炎症反应特征。...

小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。...

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

骨骼肌微血管内皮细胞（MMEC）构成肌毛细血管的内壁，调控肌肉组织与血液之间液体/分子的交换以及（免疫）细胞的迁移。本文所述原代小鼠MMEC的分离方法，可实现对"肌血管单元"的全面体外研究。...

分离原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）是一种近期发现的颅内细胞类型，其功能尚不明确。本研究提供了一种可重复的小鼠LLEC分离与培养方案 体外...

软脑膜淋巴管内皮细胞的获取与原代培养

学习磁珠分选法分离小鼠真皮淋巴内皮细胞，用于体外生理学研究。该方法无需流式细胞仪即可获得高纯度LYVE1阳性细胞，为内皮细胞功能研究提供可靠替代方案。

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

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