小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

本课题组的研究重点是阐明调控内皮细胞生理功能的分子机制。本实验方案介绍了一种基于磁珠分离的方法，用于从缺乏荧光激活细胞分选设备的实验室中获取肾脏内皮细胞，特别是来源于肾内淋巴毛细血管的内皮细胞。该方法可从转基因小鼠中分离出淋巴管内皮细胞，以便在体外研究其生理特性。

当后续应用对淋巴内皮细胞纯度要求不高时，该方法尤为适用。此方法可高效获取来源于淋巴毛细血管而非其他收集管的淋巴内皮细胞。此外，在缺乏细胞分选设备的情况下，该方法也是一种理想的替代方案。

在生物安全柜内对已安乐死并用70%乙醇适当剃毛和消毒的小鼠进行操作。使用剪刀在动物腹部做一处0.5英寸的浅表切口。沿中线纵向剪开，分别向颈部和下腹部延伸。

此外，进行横向切口以掀开皮肤。使用钝头镊子，沿动物躯干周围轻轻将皮肤与周围组织分离，同时在颈部和下腹部横向剪开皮肤。小心地将皮肤放置于100毫米组织培养皿中，使真皮面朝下，并确保皮肤尽可能充分伸展。

向培养皿中加入6毫升dispase溶液，确保皮肤完全被覆盖，然后盖上培养皿。用Parafilm封口膜包裹培养皿。在室温下孵育10分钟，以使外植块展平。

第二天，使用移液器将含有分离皮肤的培养板中的液体吸出。然后借助镊子将真皮与表皮分离，同时去除其上可见的脂肪组织，并将分离出的真皮放入干净的组织培养板中。向培养板中的真皮加入1毫升含1×抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基。

倾斜培养皿，使液体聚集在培养皿的一侧。然后将真皮组织切成 1 至 2 平方毫米大小的片段，并转移至一个新的 50 毫升锥形管中。向管中加入 10 毫升 II 型胶原酶溶液。

在37摄氏度下孵育两小时，同时以30至50 RPM持续振荡，以消化真皮组织。将细胞悬液通过70微米细胞筛过滤，并在250 ×g下离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于10毫升含有抗生素-抗真菌溶液的DMEM中。

按照先前所述方法，将细胞悬液通过40微米细胞滤网过滤，然后离心。将所得的细胞沉淀重悬于1毫升完全LEC培养基中。随后将细胞接种至经胶原蛋白包被的60毫米组织培养皿中，加入完全LEC培养基进行培养。

每两天更换一次培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入新鲜的 LEC 培养基。从鼠类真皮分离的细胞在低倍镜下的图像显示为混合细胞群体。为纯化鼠类淋巴管内皮细胞，需在从鼠类真皮分离的细胞达到约 80% 至 90% 汇合度后使用。

首先，使用一毫升磁珠包被液在磁力架中洗涤预先包被的磁性微珠。将微珠重悬于150微升含0.1% BSA的DMEM中。接着，用PBS洗涤60毫米组织培养皿中的细胞两次。

将50微升抗体偶联磁珠与含有0.1% BSA的3毫升DMEM混合，加入细胞中。用Parafilm封口膜密封培养皿，然后在摇床中于室温下以10 RPM振荡孵育，精确孵育10分钟。

弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。快速检查培养板，确认存在 LEC 克隆。向细胞中加入 1 mL 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 3 分钟以消化细胞。

观察细胞以确认是否成功脱离。用两毫升完全LEC培养基中和溶液后，将细胞悬液转移至一个五毫升无菌聚丙烯管中。使用磁力分离器，用含有0.1% BSA的三毫升DMEM洗涤细胞，以去除未结合的细胞。

将剩余的珠子结合的细胞重悬于完全LEC培养基中，并接种至胶原包被的60毫米组织培养皿中。纯化后，通过明场和荧光成像可轻松识别出LYVE1阳性的淋巴内皮细胞，并显示有多个珠子附着在细胞上。纯化后24小时，细胞汇合度较低，而纯化七天后则呈现高度汇合状态。