Name: 使用纳米孔技术快速表征狂犬病病毒的全基因组测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 了解如何使用纳米孔技术对狂犬病病毒进行全基因组测序，以支持地方性流行地区的病毒监测和谱系鉴定。该方法为资源有限环境下的公共卫生决策提供了可扩展的基因组分析流程。

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本工作得到了以下资助：Wellcome 基金会 [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z]、英国医学研究理事会（MRC）的牛顿基金 [MR/R025649/1] 与菲律宾科学技术部（DOST）联合资助、英国研究与创新组织针对新冠疫情的全球努力项目 [MR/V035444/1]、格拉斯哥大学机构战略支持基金 [204820]、医学研究理事会新研究者奖（KB）[MR/X002047/1]、国际合作伙伴发展基金、DOST-英国文化协会-菲律宾奖学金（CB）、英国国家健康研究所 [17/63/82] GemVi 奖学金（GJ），以及来自格拉斯哥大学 MVLS DTP（KC）[125638-06]、EPSRC DTP（RD）[EP/T517896/1] 和 Wellcome IIB DTP（HF）[218518/Z/19/Z] 的博士生奖学金。我们感谢以下同事和合作者对本研究的支持：Daniel Streicker、Alice Broos、Elizabeth Miranda（兽医学博士）、Daria Manalo（兽医学博士）、Thumbi Mwangi、Kennedy Lushasi、Charles Kayuki、Jude Karlo Bolivar、Jeromir Bondoc、Esteven&#160;Balbin、Ronnel Tongohan、Agatha Ukande、Davis Kuchaka、Mumbua Mutunga、Lwitiko Sikana 和 Anna Czupryna。

A Nanopore-Based Genomic Approach to Control Rabies in Low-Income Countries

作者无任何利益冲突需要披露。

Brunker 等人基于纳米孔测序技术，利用 ARTIC 网络的资源，开发了一种易于获取的狂犬病病毒（RABV）全基因组测序流程6146。本文介绍了一种更新后的流程，涵盖从样本处理、测序到结果解读的完整步骤。该流程详细说明了用于全基因组测序的脑组织样本制备方法，提供了一个生物信息学分析流程以处理测序读长并生成一致性序列，并重点介绍了两种针对狂犬病的特异性工具，用于自动化进行谱系分配和确定系统发育背景。更新后的流程还提供了关于建立适当的计算环境和实验室工作空间的全面指导，并考虑了在不同环境（包括资源有限的地区）中的实施可行性。我们已在四个狂犬病病毒流行但基因组监测能力有限或缺乏的中低收入国家（LMICs）的学术机构和研究机构中成功实施了该流程。该流程已被证明适用于多种不同环境，且不同专业背景的使用者均能理解并操作。
该狂犬病病毒（RABV）测序工作流程是目前最全面且公开可用的方案（涵盖从样本到序列再到结果解读的完整步骤），并特别优化以降低启动成本和运行成本。相较于其他测序平台（如Illumina61），纳米孔测序技术在文库制备和测序过程中的时间和成本显著降低，且随着技术的持续发展，其序列质量和准确性已不断提升，可与Illumina平台相媲美62。
本方案旨在适应多种资源有限的环境。通过参考核心方案中提供的故障排除和修改建议，用户可据此调整工作流程以满足自身需求。在工作流程中加入用户友好的生物信息学工具，是对原始方案的一项重大改进，可为生物信息学经验有限的用户提供快速、标准化的方法，用于在本地环境中解读测序数据。然而，现场（in situ）进行此类分析的能力通常受限于对特定编程和系统发育分析技能的需求，这些技能需要投入大量时间和长期培训才能掌握。尽管这些技能对于全面解读测序数据至关重要，但同样迫切需要提供基础且易于获取的分析工具，以赋能本地“测序带头人”——其核心专长可能集中在湿实验方面——使其能够独立解读并有效掌控自身数据。
由于该方案已在多个国家实施多年，我们现在可以提供如何优化多重引物组合以提高覆盖度并应对累积多样性的指导。我们还努力帮助用户提高成本效益，或便于在特定地区采购试剂，这通常是分子检测方法可持续性面临的主要挑战63。例如，在非洲（坦桑尼亚、肯尼亚和尼日利亚），我们在接头连接步骤中选用平末端/TA连接酶预混液，这种试剂更容易从本地供应商获得，且比其他连接试剂更具成本优势。
根据经验，有多种方法可以降低每个样本和每次运行的成本。减少每次运行的样本数量（例如，从24个减少到12个样本）可以延长流通池在多次运行中的使用寿命，而增加每次运行的样本数量则能最大化利用时间和试剂。在我们的实验中，每三次测序运行中可清洗并重复使用一次流通池，从而额外完成了55个样本的测序。使用后立即清洗流通池，或在无法立即清洗时，每次运行后从废液通道中清除废液，似乎有助于保留可供第二次运行使用的孔数量。结合流通池初始可用孔数，还可优化单次运行方案，以规划在特定流通池中应运行的样本数量。
尽管本工作流程力求尽可能全面，并提供了详细的指导和指引性资源，但该程序仍然较为复杂，对新用户而言可能具有挑战性。建议用户寻求现场培训和支持，最好是在本地进行，或通过外部合作者获得帮助。例如，在菲律宾，已开展一项旨在通过使用牛津纳米孔技术（ONT）加强区域实验室SARS-CoV-2基因组监测能力的项目，该项目已在医疗诊断人员中建立起核心能力，这些能力可直接应用于RABV测序。一些关键步骤（如SPRI磁珠纯化）若无实际操作培训则难以掌握，而低效的纯化可能损坏流动槽并影响测序运行。当在实验室中处理扩增子时，样本污染始终是一个主要问题，且难以彻底消除。特别是样本间的交叉污染，在测序后的生物信息学分析中极难被发现。良好的实验室技术和规范操作至关重要，例如保持工作台面清洁、分离PCR前与PCR后操作区域，以及设置阴性对照，以确保质量控制。纳米孔测序技术的快速发展为常规RABV基因组监测既带来了优势也带来了挑战。纳米孔技术在准确性、可及性及实验方案种类方面的持续改进，拓展并提升了其应用范围。然而，同样的快速发展也使得标准操作程序和生物信息学分析流程难以保持稳定。在本方案中，我们提供了一份文件，以协助用户从较早版本过渡到当前的纳米孔文库制备试剂盒（材料表）。
在中低收入国家（LMICs）中，测序工作面临的一个常见障碍是可及性问题，这不仅包括成本，还涉及能否及时采购耗材（特别是测序试剂，对采购团队和供应商而言相对新颖）、计算资源，以及稳定电力和互联网的获取。本方案以便携式纳米孔测序技术为基础，有助于解决上述诸多可及性难题。我们已在多种环境下成功应用本方案，实现了在目标国家境内完成全部实验流程与数据分析。诚然，设备和测序耗材的及时采购仍具挑战性，在许多情况下，我们不得不从英国携带或运输试剂。然而，在某些地区，我们已能够完全依赖本地供应渠道获取试剂，这得益于对SARS-CoV-2测序工作的投入（例如菲律宾），此类投入已优化了采购流程，并逐步推动病原体基因组学应用的常态化。
通过一次性安装，对稳定互联网连接的需求被降至最低；例如，GitHub 代码仓库、软件下载以及纳米孔测序本身仅需在启动运行时接入互联网（而非全程需要），或在获得公司许可后可完全离线进行。若有移动数据可用，可将手机作为热点连接至笔记本电脑以启动测序运行，随后在运行期间断开网络连接。在常规处理样本时，数据存储需求可能迅速增长，理想情况下应将数据存储于服务器上。否则，固态硬盘（SSD）的价格相对低廉，易于采购。
尽管我们认识到，低收入和中等收入国家（LMICs）在基因组监测方面仍存在障碍，但不断增加对提升基因组可及性和专业能力的投资（例如非洲病原体基因组学倡议 [Africa PGI]）64 表明这一状况将得到改善。基因组监测对于大流行病的防范至关重要6，而通过将狂犬病病毒（RABV）等地方性病原体的基因组监测纳入常规工作，可逐步建立相应能力。在 SARS-CoV-2 大流行期间暴露出的全球测序能力差异，应成为推动变革的催化剂，以解决这些结构性不平等问题。
该RABV样本到序列再到解读的工作流程，包括易于使用的生物信息学工具，有望用于指导防控措施，以实现到2030年消除犬源性狂犬病导致的人类死亡的目标，并最终消除RABV变异株。结合相关元数据，本方案生成的基因组数据有助于在疫情调查期间快速表征RABV，并识别特定国家或地区内流行的谱系60,61,65。本文主要以犬源性狂犬病的实例来说明我们的分析流程；然而，该工作流程也可直接应用于野生动物狂犬病。这种可转移性和低成本特性最大限度地减少了常规测序普及应用的障碍，不仅适用于狂犬病，也适用于其他病原体46,66,67，从而改善疾病管理和防控。

狂犬病病毒（RABV）是Rhabdoviridae科中的一种丽沙病毒，可导致哺乳动物发生致命性神经系统疾病1。尽管通过疫苗接种可实现100%预防狂犬病，但在流行地区，该病仍是重要的公共卫生和经济问题。据估计，全球每年约有60,000人死于狂犬病，其中超过95%的病例发生在非洲和亚洲，而犬类是这些地区的主要病毒储存宿主2。相比之下，由于实施犬类疫苗接种，西欧、北美洲以及大部分拉丁美洲地区已成功消除由犬类传播的狂犬病。在这些地区，狂犬病的储存宿主现已局限于野生动物，例如蝙蝠、浣熊、臭鼬和野生犬科动物3。在整个拉丁美洲，普通吸血蝙蝠因在夜间吸血过程中频繁将病毒溢出传播给人类和家畜，已成为狂犬病的重要来源4。全球每年因狂犬病造成的经济损失估计达86亿美元，其中家畜损失约占6%5。
病毒病原体的序列数据结合感染发生的时间和来源信息，可提供有力的流行病学见解6。对于狂犬病病毒（RABV），测序技术已被用于调查疫情暴发的来源7,8，识别与野生动物或家犬相关的宿主关系8,9,10,11,12，以及追踪人类病例的来源13,14。利用系统发育分析开展的疫情调查表明，狂犬病通过一次从加里曼丹或苏拉威西等邻近地方性流行区的引入事件，传入了此前无狂犬病的印度尼西亚巴厘省15。与此同时，在菲律宾，罗马布隆省塔布拉斯岛的疫情被证实源自吕宋主岛的传入16。病毒基因组数据还被用于更深入地理解病原体传播动态，从而为地理上精准实施防控措施提供依据。例如，RABV的基因组特征分析揭示了进化枝的地理聚类现象17,18,19、谱系的共循环20,21,22、人类活动介导的病毒迁移17,23,24以及集合种群动态25,26。
疾病监测是基因组监测的一项重要功能，随着全球为应对 SARS-CoV-2 大流行而大幅提升测序能力，该功能已得到加强。基因组监测已支持对 SARS-CoV-2 关注变异株27,28 及相关应对措施的实时追踪6。测序技术的普及化进展，例如纳米孔测序技术，已推动了更高效且成本更低的人类29,30,31,32 和动物33,34,35 病原体快速测序方案的发展。然而，在许多狂犬病流行国家，病原体基因组监测的实施仍面临障碍，这一点在全球 SARS-CoV-2 测序能力分布不均中已有体现36。实验室基础设施、供应链和技术知识的局限性，使得基因组监测的建立和常规化实施面临挑战。本文中，我们展示了如何在资源有限的环境中部署一种经过优化的、快速且经济的全基因组测序工作流程，用于狂犬病病毒（RABV）的监测。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;品牌名称&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序软件&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;MinKnow&lt;/em&gt;)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/downloads</td><td></td></tr><tr><td>生物信息学工具包&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;孔雀鱼&lt;/em&gt;)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热循环仪&lt;br/&gt; &lt;em&gt;miniPCR&amp;trade; mini16 梯度PCR仪&lt;/em&gt;</td><td>Cambio</td><td>MP-QP-1016-01</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Precellys Evolution Touch 均质器&lt;/em&gt;)</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ02520-300</td><td></td></tr><tr><td>冷藏架（0.2–0.5 mL）&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;带透明盖的PCR小型冷却器&lt;/em&gt;)</td><td>BRAND&amp;nbsp;</td><td>781260</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式移液器 F1000L，1000 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>货号：FA10030</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式移液器，100 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>货号：FA10024</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式 F10L，10 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>货号：FA10020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式 F1L，1 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>SKU: FA10025</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式 F20L，20 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>SKU: FA10021</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Pipetman L 固定式 F250L，250 μL）&lt;/em&gt;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>货号：FA10026</td><td></td></tr><tr><td>荧光计&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Qubit&amp;nbsp; 4 荧光计&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>笔记本电脑&amp;nbsp;&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;任何品牌，约 2 GB 驱动空间，最低 512 GB 存储空间，msi 安装程序 [GPU]&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心机&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;冷藏离心机&lt;/em&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>75004081</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;基础型漩涡混合器&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>88882011</td><td></td></tr><tr><td>磁力架&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;DynaMag-2 磁力架&lt;/em&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科学</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>测序仪&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;MinION&lt;/em&gt;)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MinION Mk1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA提取&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Qiagen RNEasy Mini Kit 250&lt;/em&gt;)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RNA稳定试剂&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（RNA later）&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（DNA/RNA保护剂）&lt;/em&gt;</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;无核酸酶水 [不&amp;nbsp; DEPC 处理的&lt;/em&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>第一链cDNA合成用预混液&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;LunaScript RT SuperMix 试剂盒&lt;/em&gt;)</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td></td></tr><tr><td>DNA扩增预混液&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Q5&amp;reg; 热启动高保真2X预混液 [NEB]&lt;/em&gt;)</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>引物（方案）&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;定制DNA寡核苷酸&lt;/em&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SPRI 磁珠纯化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI 磁珠&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Aline Biosciences PCR Clean DX&lt;/em&gt; )</td><td>Cambio</td><td>AL-AC1003-50</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯度绝对 &gt;99.8%（气相色谱）[Riedel-De Haen]</td><td>默克</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>短片段缓冲液&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;SFB 扩展包&lt;/em&gt;)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-SFB001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DNA 定量&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA定量试剂盒&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;Qubit&amp;reg; dsDNA HS Assay 试剂盒&lt;/em&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>DNA 定量检测管&lt;br/&gt; &lt;em&gt;(Qubit&amp;trade; 检测管&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科学</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;末端修复与加接头&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;(Qubit&amp;trade; 检测管&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>末端修复主混合液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（NEBNext Ultra 末端修复/dA加尾模块）&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>条形码试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（天然条形码扩展 1-12）&lt;/em&gt;</td><td></td><td>EXP-NBD104&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（原生条形码扩展包 13-24）&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td>EXP-NBD114&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;(原生条形码扩展 96)&lt;/em&gt;</td><td></td><td>EXP-NBD196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（不兼容）&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&lt;em&gt;（不兼容）&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Native Barcoding Kit 24 V14）&lt;/em&gt;</td><td></td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（Native Barcoding Kit 96 V14）&lt;/em&gt;</td><td></td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>连接反应预混液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（平末端/TA连接酶预混液）&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;接头连接&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接接头预混液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（NEBNext&amp;nbsp; 快速连接模块&lt;/em&gt;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E6056S&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（NEBNext Ultra II 连接模块）&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（平末端/TA连接酶预混液）&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>接头混合物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 9&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; EXP-AMII001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（接头混合液 II [AMII]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; EXP-NBA114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（天然适配器 [NA]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;测序&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流动池预处理试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 9&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（冲洗缓冲液 [FB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（冲洗栓系 [FT]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; EXP-FLP004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（流动池冲洗 [FCF]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（流动池连接物 [FCT]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;连接测序试剂盒&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 9&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>接头混合物&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（接头混合液 [AMX]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（连接缓冲液 [LNB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>短片段缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（短片段缓冲液 [SFB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（测序缓冲液 [SQB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（洗脱缓冲液 [EB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加载珠子&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（上样缓冲液 [LB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序锚定&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（测序锚定序列 [SQT]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; SQK-LSK114</td><td></td></tr><tr><td>接头混合物&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（连接接头 [LA]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（连接缓冲液 [LNB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>短片段缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（短片段缓冲液 [SFB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（测序缓冲液 [SB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（洗脱缓冲液 [EB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加载珠子&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（加载珠 [LIB]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序锚定&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（流动池连接装置 [FCT]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>文库溶液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（文库溶液 [LIS]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冲洗缓冲液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（流动池冲洗 [FCF]）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流动池&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;化学 9&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 9&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（流动池&amp;nbsp; [R9.4.1]&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>&lt;em&gt;化学 14&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（流动池&amp;nbsp; [R10.4.1]&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流动池清洗&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流动池清洗试剂盒&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（流动池清洗试剂盒）&lt;/em&gt;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表面去污剂&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（DNA Away 表面去污染剂，挤压瓶装 [分子生物学级]）&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>7010PK</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;（RNase Away 表面去污剂，瓶装 [分子生物学级]）&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>7002PK</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8联管 0.2 ml，独立盖&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（PCR 8联管条，0.2 ml，带独立平盖，无菌，无DNA酶/RNA酶，无热原，天然色 [Greiner]）&lt;/em&gt;</td><td>Greiner</td><td>608281</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR管&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（PCR管，0.2 ml，无色[圆顶盖]，每袋500个，非无菌[Greiner]）&lt;/em&gt;</td><td>Greiner</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;micro;L型滤芯吸头（500个）&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（堆叠 1000&amp;micro;L滤器吸头［500］&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>11977724</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;micro;L型滤芯吸头（1000）</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科学</td><td>11947724</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;micro;L型滤芯吸头（1000）&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（堆叠100）&amp;micro;L滤芯吸头 [1000]&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>11907724</td><td></td></tr><tr><td>加强型管&amp;nbsp; 2 ml 离心管&amp;nbsp; 带螺旋盖和O形圈&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（Fisherbrand&amp;trade;&amp;nbsp;大量试管&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科学</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（1.5 ml 离心管 [500]）&lt;/em&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>1229888</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 离心管&amp;nbsp; (1.5 ml)&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（DNA LoBind 管）&lt;/em&gt;</td><td>赛默飞世尔科技/费舍尔科技</td><td>10051232</td><td></td></tr><tr><td>冷冻婴儿标签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套（S/M/L）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

基因组数据可用于追踪传染病的传播路径和地理扩散情况。然而，在许多中低收入国家（LMICs），用于基因组监测的测序能力仍然有限，而在这些地区，由犬类传播的狂犬病和/或野生动物（如吸血蝙蝠）传播的狂犬病对公共卫生和经济构成了重大威胁。本文介绍了一种基于纳米孔测序技术的快速且经济的“样本到序列到解读”全流程方案。文中简要描述了样本采集和狂犬病诊断的流程，随后详细介绍了优化后的全基因组测序工作流程，包括用于多重聚合酶链式反应（PCR）的引物设计与优化、一种改良的低成本测序文库制备方法、实时及离线碱基识别测序、遗传谱系鉴定以及系统发育分析。本文展示了该工作流程的实际应用，并强调了本地部署中的关键步骤，例如流程验证、引物优化、阴性对照的设置，以及利用公开可用的数据和基因组工具（GLUE、MADDog）进行分类，并将结果置于区域和全球系统发育树中进行比对。该工作流程的周转时间为2至3天，每样本成本在96样本批量运行时为25美元，12样本批量运行时为80美元。我们得出结论：在中低收入国家建立狂犬病毒基因组监测体系是可行的，这将有助于实现“到2030年消除犬传人狂犬病导致的人类死亡”这一全球目标，并加强对野生动物狂犬病传播的监测。此外，该平台还可适配用于其他病原体，有助于构建多功能的基因组监测能力，从而提升对流行病和大流行的应对准备水平。

本方案中所述的狂犬病病毒（RABV）从样本到测序再到结果解读的工作流程，已在中国台湾、坦桑尼亚、肯尼亚、尼日利亚和菲律宾等流行地区不同实验室条件下成功应用（图4）。该方案适用于多种样本类型和运输条件（表6）：新鲜和冷冻的脑组织、在冷链条件下长时间运输的脑组织cDNA和RNA提取物，以及含有脑组织涂片的FTA卡片。
使用 RAMPART 进行实时碱基识别（图 5）可近乎实时地显示生成的测序读长及每个样本的覆盖度百分比。这对于决定何时终止测序运行并保存流动池以供重复使用具有重要意义。运行时间存在差异，某些测序在 2 小时内即完成，而其他测序则可能需要超过 12 小时才能达到足够的测序深度（×100）。我们还可以观察扩增效果较差的区域；例如，图 6 展示了一次测序运行的快照，其中覆盖度分布显示部分扩增子的扩增水平极低，提示引物可能存在潜在问题。通过更深入地分析这些扩增效果不佳的区域，我们已能够识别出引物不匹配的情况，从而为重新设计和优化个别引物提供依据。不同引物组合所表现出的不匹配数量也有所不同。这一点在东非引物组合与菲律宾引物组合的比较中尤为明显，这与目标区域的遗传多样性一致：东非引物组合旨在捕获更广泛的遗传多样性。
RABV-GLUE42 是一个通用的 RABV 基因组数据管理资源，MADDOG60 是一种谱系分类与命名系统，本研究利用这两个工具对获得的 RABV 序列进行汇编和解读。表7展示了使用 RABV-GLUE 确定的各国流行的主要和次要分支，同时还展示了依据 MADDOG 分类系统对本地谱系进行的更高分辨率的分类。
<img alt="样本测序流程：样本采集、RNA提取、cDNA合成、PCR、测序。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：RABV样本测序与结果解读工作流程。图中总结了以下步骤：（A）样本制备，（B）PCR与文库制备，以及（C）测序和生物信息学分析直至结果分析与解读。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="参考基因组上重叠扩增子引物设计示意图，显示正向和反向引物的位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：引物方案示意图。 正向与反向引物对（半箭头）在“索引参考基因组”（深紫色）上的退火位置，这些引物被分配至两个独立的引物池：A（红色）和B（绿色）。引物对扩增产生长度为 400 bp 的重叠扩增子（蓝色），沿索引参考基因组按顺序编号，格式为“scheme_name_X_DIRECTION”，其中“X”为数字，代表由该引物对扩增的扩增子，“DIRECTION”为“LEFT”或“RIGHT”，分别表示正向或反向。X 为奇数或偶数决定其所属引物池（分别为 A 或 B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA测序流动池示意图，显示废液口、SpotON、样品加样口、传感器阵列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：纳米孔流动池48。 蓝色标签标示了流动池的不同组成部分，包括覆盖引液口的引液口盖，引液溶液由此处加入；覆盖样品加样口的SpotON样品加样口盖，样品以逐滴方式由此处加入；废液口1和2，以及流动池ID。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="全球序列分布图，2021-2022年；按序列数量和颜色编码频率显示各位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：显示2021年和2022年使用优化流程进行RABV测序的地理位置示意图。 气泡的大小和颜色对应每个地点的序列数量，气泡越小、颜色越深表示数量越少，气泡越大、颜色越浅表示数量越多。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="实时比对分析；柱状图与折线图；数据可视化；RAMPART 软件界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：RAMPART 在网页浏览器中的可视化界面截图。 根据生物信息学设置，条形码名称已替换为样本名称。上方三个面板显示整个测序运行的汇总图：每个条形码在参考基因组索引上的每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度（左上，按条形码着色）、所有条形码随时间累计的比对读段总数（中上）以及每个条形码的比对读段数（右上，按条形码着色）。下方面板显示每个带条形码样本的多行图表，从左至右分别为：参考基因组索引上每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度（左）、比对读段的长度分布（中）、以及随时间推移在参考基因组索引上达到 10x、100x 和 1,000x 覆盖深度的核苷酸位置所占比例（右）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示基因组各位置测序读长深度的基因组测序分析图；对变异检测至关重要。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：采用本实验方案对中国台湾分离的狂犬病病毒样本进行全基因组测序所得的读长覆盖度示例。 图中显示了基因组中每个核苷酸位置的读长覆盖度，以及用于构建文库的重叠扩增子（1-41）的位置。覆盖深度的峰值对应于扩增子重叠区域。覆盖深度较低的扩增子以红色标出，提示这些区域可能存在技术问题，需进一步优化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
表1：cDNA制备的主混合液及热循环仪条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：多重PCR的主混合液及PCR仪循环条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：末端修复反应的主混合液及热循环仪条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：条形码测序的主混合液及PCR仪循环条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：用于测序的接头连接主混合液及文库终浓度稀释方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table-5_revised.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表6：使用样本到序列到解读的工作流程，不同国家生成的狂犬病病毒全基因组序列数量及所用样本类型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%206.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表7：通过本工作流程生成的序列，经RABV-GLUE分析所得的主要与次要进化枝分类，以及经MADDOG分析所得的谱系分类。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%207.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件1：引物方案设计与优化，以及扩增子测序深度分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：计算设置 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：狂犬病病毒全基因组测序方案工作表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%203-%20Worksheet.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。

基因组数据可用于追踪传染病的传播路径和地理扩散。然而，开展基因组测序所需的测序能力……

我们的研究利用先进的基因组学技术，加强中低收入国家的病原体监测。这有助于赋能当地研究人员，回答五个关键问题：谁、什么、何地、为何以及何时。这些问题的答案可为实地工作提供切实可行的解决方案。我们采用纳米孔技术实现测序的去中心化。该技术操作简便、便于携带，且相较于其他平台成本更低，非常适合资源有限的环境。此外，能够在样本来源地快速进行测序，使我们得以在动物-人类-环境交界面开展监测工作。我们在从质量各异的样本中获取全基因组方面面临挑战。通常，来自偏远地区的样本会在储存条件不佳的情况下运输。此外，我们在购买有助于解读数据的生物信息学工具方面也缺乏足够的专业知识。因此，这些工具可能包括MADDG和RABV-GLUE。它们可用于以通用方式解读数据，从而帮助启动控制措施。好的，我们正试图演示如何优化狂犬病全基因组序列的快速测序方案，并探讨该方案如何在低收入国家中进行调整和应用，以实现狂犬病的测序工作。为了回答有关病毒实际传播情况、传播的病毒类型以及传播时间等不同问题，这些信息对于狂犬病消除策略至关重要。目前，病毒基因组监测已变得更加可行。然而，针对地方防控工作中的数据分析与解释的指导仍较为有限。本方案提供了一条完整的端到端流程，使地方科研人员具备一线监测能力。病毒基因组数据及其解读方法的可及性不断提高，使研究人员能够将流行病学洞察转化为政府卫生部门或疾病控制项目可操作的信息，并为决策过程提供指导。取两个2毫升的PCR管，分别加入约200微升含有1.4毫米陶瓷珠的管，制备成陶瓷珠管，并在转移至无菌操作台前相应标记。向已标记的PCR管中加入RNA提取试剂盒中提供的适量裂解缓冲液。使用木制取样棒从经确诊为感染狂犬病的脑组织样本中获取一个约3毫米见方的组织块，放入带有样本编号标记的管中；另取100微升无核酸酶水加入标记为阴性对照的管中。使用木制涂布棒手动破坏脑组织，然后以最大速度涡旋震荡，直至组织完全均质化。接着，将均质化的裂解液离心。用移液器将上清液转移至新标记的微量离心管中，用于后续的RNA提取、cDNA制备及PCR扩增步骤。使用引物池A和B完成cDNA制备和PCR扩增后，在PCR后处理区域进行PCR纯化和定量。从主瓶中将SPRI磁珠分装至微量离心管中。这些步骤也可预先完成。将试管置于 4 摄氏度保存，或放置在冷架或冰上。接下来，将 SPRI 磁珠分装物在约 20 摄氏度下预热，并充分涡旋振荡，使磁珠在整份溶液中重新悬浮。然后，在 1.5 毫升离心管中，分别将每个样本的引物池 A 和引物池 B 的 PCR 产物混合。如有需要，在向每份混合产物中加入 25 µL SPRI 磁珠并混匀前，加水将体积调至 25 µL。室温孵育 10 分钟，期间偶尔颠倒或轻弹离心管。接着，将离心管置于磁力架上，直至磁珠与溶液完全分离。完成后，弃去上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。随后，用新配制的200 µL 80%乙醇洗涤两次，每次30秒，并弃去乙醇。第二次洗涤后，使用10 µL移液枪头彻底去除残留的乙醇痕迹。将沉淀物空气干燥，直至微量乙醇挥发，沉淀由光亮状变为哑光状。用15 µL无核酸酶水重悬磁珠，以回收纯化的DNA产物，并在室温下孵育10分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。将上清液转移至新的1.5毫升离心管后，用无核酸酶水对每个样品进行1:10稀释。按照制造商说明书，使用高灵敏度和特异性的荧光计测定每个稀释样品的DNA浓度。通过翻转测序仪盖板并顺时针滑动引物添加口盖板，暴露引物添加口，开始对质量合格的流动池进行引物添加和上样。为去除气泡，将P1000移液器调至200微升，将吸头垂直插入引流通路中。旋转旋钮，直至观察到少量液体进入吸头。通过引流通路向流动池中加入800微升预先配制好的流动池引物混合液，以避免引入气泡。打开样品口盖，通过引物混合孔将200微升剩余的引物混合液加入流动池中。为确保加载珠子充分混匀，用移液器吹打重悬文库主混合液，然后逐滴通过样品口向流动池中加入75微升。轻轻盖上样品口盖，确保塞子插入样品口中。关闭引物端口并重新安装测序装置的盖子。对于实时碱基识别，请使用 RAMPART。采用 artic-rabv 环境，并在为 Rampart_Output 创建的目录中进行操作。然后，输入 RAMPART 命令以导航至所需路径。首先输入 RAMPART 特定的方案协议，接着输入 basecalledPath，即 MinKNOW fastq_pass 输出文件夹的运行路径。打开浏览器窗口，并在地址栏中导航至 localhost:3000。等待足够的数据完成碱基识别后，结果才会显示在屏幕上。上方三个面板显示整个测序运行的汇总图。第一个图显示每个条形码在索引参考基因组上每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度。图二显示了随时间变化的所有条形码的比对读段。图三显示了每个条形码的比对读段数。下方面板展示了每个条形码对应的多行图表。左侧显示了比对到参考基因组上每个核苷酸位置的测序深度。中间为比对上测序读段的长度分布。右下角展示了随时间推移，参考基因组上达到 10X、100X 和 1,000X 测序深度的核苷酸位置所占比例。对于一致性序列的谱系分配，请使用 MADDOG。从 GitHub 拉取 MADDOG 仓库以确保使用最新版本。在先前创建的本地 MADDOG 仓库中新建一个文件夹。在文件夹内，添加包含一致性序列的 FASTA 文件。同时，将元数据文件添加到该文件夹中。确保该文件为 CSV 格式，并包含四个名为 ID、country、year 和 assignment 的列。从 GitHub 拉取 MADDOG 仓库，以确保使用最新版本。在命令行界面中，使用 conda activate MADDOG 命令激活 conda 环境。在命令行界面中，导航至 MADDOG 仓库文件夹。首先，对序列进行谱系分配，以检查潜在的异常情况，并通过运行 sh assignment.sh 命令判断是否需要执行更长的谱系指定步骤。当系统提示时，输入 Y 以确认已拉取代码仓库并正在使用 MADDOG 的最新版本。当系统提示时，请输入 MADDOG 仓库中包含 FASTA 文件的文件夹名称。谱系分配完成后，检查该文件夹中的输出文件。如果输出结果符合预期，且多条序列被分配至同一谱系，则运行谱系命名程序。运行谱系指定时，删除刚刚创建的分配输出文件。在终端中，进入 MADDOG 仓库文件夹，运行命令 sh designation.sh。当提示时，输入 Y 以表明仓库已拉取，且正在使用 MADDOG 的最新版本进行工作。当系统提示时，输入 MADDOG 仓库文件夹中包含 FASTA 文件和元数据的文件夹名称。狂犬病病毒（RABV）从样本到序列再到分析解释的工作流程已在坦桑尼亚、肯尼亚、尼日利亚和菲律宾等流行国家的不同实验室条件下成功应用。使用 RAMPART 进行实时碱基识别，可实时生成测序读长及每个样本的覆盖百分比。 采用命名系统 MADDOG 进行谱系分类，用于汇编和解读获得的 RABV 序列，根据 MADDOG 分类方案实现了对本地谱系的更高分辨率分类。

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