利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

我们的研究利用先进的基因组学技术，加强中低收入国家的病原体监测。这有助于赋能当地研究人员，回答五个关键问题：谁、什么、何地、为何以及何时。这些问题的答案可为实地工作提供切实可行的解决方案。

我们采用纳米孔技术实现测序的去中心化。该技术操作简便、便于携带，且相较于其他平台成本更低，非常适合资源有限的环境。此外，能够在样本来源地快速进行测序，使我们得以在动物-人类-环境交界面开展监测工作。

我们在从质量各异的样本中获取全基因组方面面临挑战。通常，来自偏远地区的样本会在储存条件不佳的情况下运输。此外，我们在购买有助于解读数据的生物信息学工具方面也缺乏足够的专业知识。

因此，这些工具可能包括MADDG和RABV-GLUE。它们可用于以通用方式解读数据，从而帮助启动控制措施。好的，我们正试图演示如何优化狂犬病全基因组序列的快速测序方案，并探讨该方案如何在低收入国家中进行调整和应用，以实现狂犬病的测序工作。

为了回答有关病毒实际传播情况、传播的病毒类型以及传播时间等不同问题，这些信息对于狂犬病消除策略至关重要。目前，病毒基因组监测已变得更加可行。

然而，针对地方防控工作中的数据分析与解释的指导仍较为有限。本方案提供了一条完整的端到端流程，使地方科研人员具备一线监测能力。病毒基因组数据及其解读方法的可及性不断提高，使研究人员能够将流行病学洞察转化为政府卫生部门或疾病控制项目可操作的信息，并为决策过程提供指导。

取两个2毫升的PCR管，分别加入约200微升含有1.4毫米陶瓷珠的管，制备成陶瓷珠管，并在转移至无菌操作台前相应标记。向已标记的PCR管中加入RNA提取试剂盒中提供的适量裂解缓冲液。使用木制取样棒从经确诊为感染狂犬病的脑组织样本中获取一个约3毫米见方的组织块，放入带有样本编号标记的管中；另取100微升无核酸酶水加入标记为阴性对照的管中。

使用木制涂布棒手动破坏脑组织，然后以最大速度涡旋震荡，直至组织完全均质化。接着，将均质化的裂解液离心。用移液器将上清液转移至新标记的微量离心管中，用于后续的RNA提取、cDNA制备及PCR扩增步骤。

使用引物池A和B完成cDNA制备和PCR扩增后，在PCR后处理区域进行PCR纯化和定量。从主瓶中将SPRI磁珠分装至微量离心管中。这些步骤也可预先完成。

将试管置于 4 摄氏度保存，或放置在冷架或冰上。接下来，将 SPRI 磁珠分装物在约 20 摄氏度下预热，并充分涡旋振荡，使磁珠在整份溶液中重新悬浮。然后，在 1.5 毫升离心管中，分别将每个样本的引物池 A 和引物池 B 的 PCR 产物混合。

如有需要，在向每份混合产物中加入 25 µL SPRI 磁珠并混匀前，加水将体积调至 25 µL。室温孵育 10 分钟，期间偶尔颠倒或轻弹离心管。接着，将离心管置于磁力架上，直至磁珠与溶液完全分离。

完成后，弃去上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。随后，用新配制的200 µL 80%乙醇洗涤两次，每次30秒，并弃去乙醇。第二次洗涤后，使用10 µL移液枪头彻底去除残留的乙醇痕迹。

将沉淀物空气干燥，直至微量乙醇挥发，沉淀由光亮状变为哑光状。用15 µL无核酸酶水重悬磁珠，以回收纯化的DNA产物，并在室温下孵育10分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。

将上清液转移至新的1.5毫升离心管后，用无核酸酶水对每个样品进行1:10稀释。按照制造商说明书，使用高灵敏度和特异性的荧光计测定每个稀释样品的DNA浓度。通过翻转测序仪盖板并顺时针滑动引物添加口盖板，暴露引物添加口，开始对质量合格的流动池进行引物添加和上样。

为去除气泡，将P1000移液器调至200微升，将吸头垂直插入引流通路中。旋转旋钮，直至观察到少量液体进入吸头。通过引流通路向流动池中加入800微升预先配制好的流动池引物混合液，以避免引入气泡。

打开样品口盖，通过引物混合孔将200微升剩余的引物混合液加入流动池中。为确保加载珠子充分混匀，用移液器吹打重悬文库主混合液，然后逐滴通过样品口向流动池中加入75微升。轻轻盖上样品口盖，确保塞子插入样品口中。

关闭引物端口并重新安装测序装置的盖子。对于实时碱基识别，请使用 RAMPART。采用 artic-rabv 环境，并在为 Rampart_Output 创建的目录中进行操作。

然后，输入 RAMPART 命令以导航至所需路径。首先输入 RAMPART 特定的方案协议，接着输入 basecalledPath，即 MinKNOW fastq_pass 输出文件夹的运行路径。打开浏览器窗口，并在地址栏中导航至 localhost:3000。

等待足够的数据完成碱基识别后，结果才会显示在屏幕上。上方三个面板显示整个测序运行的汇总图。第一个图显示每个条形码在索引参考基因组上每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度。

图二显示了随时间变化的所有条形码的比对读段。图三显示了每个条形码的比对读段数。下方面板展示了每个条形码对应的多行图表。

左侧显示了比对到参考基因组上每个核苷酸位置的测序深度。中间为比对上测序读段的长度分布。右下角展示了随时间推移，参考基因组上达到 10X、100X 和 1,000X 测序深度的核苷酸位置所占比例。

对于一致性序列的谱系分配，请使用 MADDOG。从 GitHub 拉取 MADDOG 仓库以确保使用最新版本。在先前创建的本地 MADDOG 仓库中新建一个文件夹。

在文件夹内，添加包含一致性序列的 FASTA 文件。同时，将元数据文件添加到该文件夹中。确保该文件为 CSV 格式，并包含四个名为 ID、country、year 和 assignment 的列。

从 GitHub 拉取 MADDOG 仓库，以确保使用最新版本。在命令行界面中，使用 conda activate MADDOG 命令激活 conda 环境。在命令行界面中，导航至 MADDOG 仓库文件夹。

首先，对序列进行谱系分配，以检查潜在的异常情况，并通过运行 sh assignment.sh 命令判断是否需要执行更长的谱系指定步骤。当系统提示时，输入 Y 以确认已拉取代码仓库并正在使用 MADDOG 的最新版本。

当系统提示时，请输入 MADDOG 仓库中包含 FASTA 文件的文件夹名称。谱系分配完成后，检查该文件夹中的输出文件。如果输出结果符合预期，且多条序列被分配至同一谱系，则运行谱系命名程序。

运行谱系指定时，删除刚刚创建的分配输出文件。在终端中，进入 MADDOG 仓库文件夹，运行命令 sh designation.sh。当提示时，输入 Y 以表明仓库已拉取，且正在使用 MADDOG 的最新版本进行工作。

当系统提示时，输入 MADDOG 仓库文件夹中包含 FASTA 文件和元数据的文件夹名称。狂犬病病毒（RABV）从样本到序列再到分析解释的工作流程已在坦桑尼亚、肯尼亚、尼日利亚和菲律宾等流行国家的不同实验室条件下成功应用。使用 RAMPART 进行实时碱基识别，可实时生成测序读长及每个样本的覆盖百分比。

采用命名系统 MADDOG 进行谱系分类，用于汇编和解读获得的 RABV 序列，根据 MADDOG 分类方案实现了对本地谱系的更高分辨率分类。