角膜缘微环境细胞的分离与鉴定

我们的研究聚焦于重建角膜缘，以治疗角膜缘干细胞缺乏症并恢复患者的视力。我们正试图回答角膜缘干细胞是否是支持角膜缘功能的关键细胞，如果是，其作用机制是什么。近期研究报道，移植来自骨髓的间充质干细胞可预防烧伤眼发生的角膜缘干细胞缺乏症。

目前用于推动技术研究的技术之一是单细胞测序，该技术可在单细胞水平上分析角膜缘干细胞特征的关键信号通路活性。尽管RNC有望成为未来重要的临床工具，但其生长特性尚未被深入研究。鉴于其在科学和临床应用方面的广阔前景，有必要系统总结RNC的分离、纯化、鉴定及其特性。

在超净工作台的无菌条件下进行角膜缘微环境细胞（LNCs）的分离。从中期角膜保存液中取出角膜缘组织。使用无菌外科圆刃刀刮除并去除角膜周围的虹膜和内皮。

接下来，使用无菌手术圆刃刀将角膜缘组织切成12等份，每份在角膜和巩膜两侧各保留1毫米的组织。随后，将这12份角膜缘组织转移至一个35毫米的培养皿中，并加入1毫升胶原酶A，使组织完全浸没于溶液中。将培养皿置于37°C细胞培养箱中孵育18小时，以消化组织。

将基质凝胶或基底膜基质置于设置为 4 摄氏度的冰箱中解冻。准备一个无菌袋，内含 200 微升和 1 毫升枪头、一个 15 毫升离心管以及一个六孔板，并将该袋子置于 -20 或 -80 摄氏度环境中冷冻 20 分钟。从冷藏设备中取出枪头、离心管和六孔板后，立即在超净工作台中进行后续操作。

使用预冷的 200 微升枪头，将 50 微升解冻的基底膜基质转移至 1 毫升 MESCM 中，并轻轻混匀。使用预装在移液器上的预冷 1 毫升枪头，将所得的 5% 基底膜基质转移至预冷的六孔培养板中的单个孔内。轻轻水平振荡六孔板，然后将其置于 37°C 培养箱中孵育约 1 小时，以制备 5% Matrigel 包被的培养板。

经过18小时消化后，取出经胶原酶A消化的角膜缘组织，其中主要含有微小的可见细胞簇。在体视显微镜下操作，使用200微升移液枪头将细胞簇从未消化的巩膜组织上分离下来。将分离的细胞簇浸入含有0.25%胰蛋白酶-EDTA的35毫米培养皿中，并将培养皿孵育15分钟。

然后，向培养板中加入1 mL含10% knockout血清的MESCM以终止细胞消化。用1 mL移液枪头轻轻吹打悬液上下混合，使细胞团解离为单细胞。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。

小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后加入1毫升MESCM重悬细胞。使用1毫升移液枪头，将液体上下吹打2至3次，确保整个细胞沉淀完全重悬于MESCM中，从中取出20微升用于细胞计数。接着，使用1毫升移液器将细胞悬液转移至预先涂有5%基底膜基质的6孔板中，再加入MESCM使每孔总体积达到2.5毫升，轻轻水平摇动6孔板，以确保细胞均匀分布。

成像细胞后，将其转移至37摄氏度的细胞培养孵育箱中。本实验所展示的方案成功消化了角膜巩膜缘组织，产生了可在显微镜下观察到的细胞簇。与预期一致，这些细胞簇呈现出类似毛虫的形态。

原代LNCs生长缓慢，培养约需12天。第1至第8代LNCs传代约需3天，但第9代以后LNCs的生长速度显著下降。形态学上，第0代LNCs呈纺锤形和圆形。

传代三次后，细胞呈纺锤形且大小均一。细胞倍增次数（NCD）代表LNCs的生长速率。NCD及累积NCD曲线显示，LNCs在传代三次至五次期间生长速度最快。

为了通过免疫荧光染色鉴定角膜缘微环境细胞（LNCs），向培养于经5% Matrigel包被的六孔板中的LNCs每孔加入1毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育5分钟以消化细胞。加入1毫升含MESCM的无血清培养基终止消化反应。将细胞悬液转移至离心管中，在200×g条件下离心5分钟，随后小心吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升MESCM中。

接下来，使用细胞离心涂片机，按照制造商的说明，将80微升细胞悬液等量沉积在四张显微镜载玻片上。用4%多聚甲醛固定细胞约10分钟。然后，使用0.2%Triton X-100和PBS对载玻片上的细胞进行透化处理，持续15分钟。

在4摄氏度下于摇床上用一抗孵育细胞过夜之前，先用2%牛血清白蛋白封闭细胞一小时。孵育后，用PBST洗涤载玻片三次，每次五分钟，以去除未结合的抗体。接着，在37摄氏度下用合适的二抗孵育样本一小时，然后按照前述方法洗涤去除未结合的抗体。

用浓度为每毫升五微克的 DAPI 对细胞核进行复染。封片后，使用荧光显微镜进行成像。根据试剂盒制造商的说明，使用 RNA 提取试剂盒从 LNCs 中提取总 RNA。

然后，使用高容量的互补DNA（cDNA）转录试剂盒，将一到两微克的RNA进行逆转录。配制一个20微升的反应体系，其中包含2.5微升cDNA、0.8微升相应的基因引物、10微升通用PCR预混液以及6.7微升双蒸水。随后，在适当的条件下进行定量聚合酶链式反应。

最后，采用比较 CT 法分析相对基因表达水平。对第4代LNCs进行双重免疫染色，结果明确显示这些细胞始终呈panCK阴性、Vim阳性、CD90阳性、CD105阳性、SCF阳性以及PDGFR阳性。