Name: 从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要中枢神经系统驻留细胞类型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 了解从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等主要中枢神经系统驻留细胞类型的新方法。该技术可减少实验动物使用数量，提高神经免疫学研究的数据质量。

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图示使用 Adobe Illustrator（版本 2023）和 Servier Medical Art （https://smart.servier.com）制作。Antonia Henes 得到 Jürgen Manchot Stiftung 的支持。

Isolating All CNS Resident Cell Types Simultaneously from Autoimmune Mice

所有作者声明无利益冲突。

目前，通过结合质谱和RNA测序技术对中枢神经系统（CNS）驻留细胞进行体外（ex vivo）定位的方法，能够在健康与疾病状态下实现极为精确的细胞图谱绘制，但该方法需要研究者具备较高的专业技术知识和相关领域经验50,51。此外，这些方法无法进行功能分析，且成本高昂。另一方面，微流控脑芯片系统可快速、经济地用于疾病机制研究和新治疗策略的筛选，但其在细胞生长和迁移方面存在限制52,53,54,55。未来，中枢神经系统类器官也可能成为研究细胞建模、细胞间连接以及疾病进程中相互作用的等效替代方案56,57,58,59。然而，目前荧光激活细胞分选和磁激活细胞分选仍是体外（ex vivo）制备高纯度且具活性的单细胞悬液最有效的方法35,60,61。尽管其他已建立的针对CNS驻留细胞类型分离的制备方案在磁分离及前期细胞解离步骤上与本方法相似，但这些方案通常要求针对每种细胞类型单独进行操作。相比之下，本方案将针对不同CNS驻留细胞类型的多种分离方法整合于一个逻辑框架中，使其能够从同一份CNS单细胞悬液中一次性同时完成各类细胞的分离（表1、表2）。因此，该方法支持从单一CNS细胞悬液中开展多组学分析，并最终有助于复杂神经网络的探索。尽管本方案并不要求必须合并来自多个动物的组织样本，但合并样本可确保获得足够数量的分离细胞以进行后续下游分析。若使用不同小鼠分别分离各类细胞，则将无法分析潜在的细胞间相互作用。此外，将针对不同CNS细胞类型的独立分离方法整合于同一CNS解离步骤之后，可通过使用同一份解离后的CNS细胞悬液完成所有后续磁分离步骤，从而节约材料成本。同时，也最大限度地减少了因使用不同小鼠而可能引入的技术偏差。
该方案的一个局限性可能是几乎 exclusively 使用雌性 C57BL/6J 小鼠。EAE 免疫方案最初是为雌性小鼠设计并建立的，因此本细胞分离方案也应用于雌性 C57BL/6J 小鼠。然而，在本方案的开发过程中也使用了未经处理的雄性小鼠，并未观察到对最终获得的细胞数量或纯度有任何影响。另一个限制涉及神经元的磁性细胞分离，因为目前尚无可用于神经元阳性筛选的特异性微珠。因此，本方案假设通过生物素标记并去除所有非神经元细胞，可以获得高纯度的单细胞悬液（表 2）。该假设通过使用 NeuN 作为神经元特异性核标记物，并将其纳入上述流式细胞术纯度检测方案中得以验证。另一项局限性涉及 EAE 小鼠中小胶质细胞的分离。在此情况下，与其他细胞类型相比，最终获得的细胞产量较低，这是由于在 MACS 方案之后增加了分选步骤。此外，有人认为，与其它细胞群体相比，分选过程可能增加了小胶质细胞所受的机械应力。不同的分选策略可能导致细胞得率存在差异。如果获得的细胞数量低于预期或需求，建议调整设门策略和/或优化活/死细胞的区分。
该实验方案中的一个关键步骤是去除碎片。必须非常缓慢且轻柔地铺加梯度液，以形成所需的三个独立相（图2A）。只有当最上两层中的髓鞘及其他碎片残留物被完全去除后（图2E），才能获得高纯度的单细胞悬液，并进一步减少污染。如果最终获得的细胞悬液纯度不足，除确保所有微珠正确使用外，该步骤通常是首先需要优化的部分。
在此类实验中，获得高纯度和高活力的细胞可能具有挑战性。以下是一些故障排除建议：
- 必须在无菌条件下操作，以防止不同微珠被污染，并确保其可重复使用，尤其是用于后续培养时。 
- 强烈建议对每根试管进行标记，以避免混淆。 
- 避免使用未冷却的试剂或缓冲液。整个实验过程中，所有细胞悬液均应置于冰上保存，以确保细胞具有较高的存活率。 
- 应尽量缩短各操作步骤之间的时间间隔。本实验方案中未推荐任何可暂停实验的特定步骤。 
- 严格遵守规定的孵育时间至关重要。
总之，本方案通过单次中枢神经系统样本即可同时分离出所有主要的中枢神经系统常驻细胞类型，从而能够从一份中枢神经系统细胞悬液中ex vivo分析复杂的神经元网络和神经炎症通路。因此，可在疾病进程的不同阶段（例如实验性自身免疫性脑脊髓炎中的神经炎症、神经退行性变和/或缓解期）对中枢神经系统常驻细胞进行研究。此外，还可对细胞间相互作用和生物化学通路进行单细胞水平的研究，并减少实验组内的个体差异。该方法还允许将分离得到的中枢神经系统细胞亚群进行单细胞培养，用于后续功能检测和验证。总体而言，本方案为临床前和临床研究方法提供了重要的技术进步。

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征为脱髓鞘、轴突损伤、胶质增生和神经退行性变。尽管该领域已有大量研究，MS 的病理生理机制仍未完全阐明1,2,3,4。目前研究 MS 最常用的动物模型是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55（MOG35-55）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），该模型在临床表现和病理生理特征上与 MS 具有诸多相似之处5,6,7,8,9。该模型基于免疫系统对中枢神经系统特异性抗原的反应，从而引发炎症、脱髓鞘以及神经轴突的退行性变。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究 MS 中神经炎症通路和信号级联反应的合适模型。
目前针对多发性硬化症（MS）的治疗方案仅部分有效，且主要针对疾病早期的炎症阶段。然而，MS的神经退行性病变成分似乎是长期治疗策略面临的主要挑战。因此，需要可重复且精确的细胞分离方案，以全面研究自身免疫性疾病中的分子和细胞机制。尽管目前已存在一些针对单一细胞类型分离的方案10,11,12,13,14,15，但仍缺乏能够同时分离多种中枢神经系统（CNS）常驻细胞群体的完善方法。以往的CNS常驻细胞分离方案在维持细胞功能性和纯度方面存在不足，导致与邻近细胞共培养16,17,18，或难以适用于对细胞内网络进行复杂的离体（ex vivo）分析19,20,21,22。
本实验方案旨在建立一种可重复且全面的方法，用于同时分离成年健康小鼠和EAE小鼠中枢神经系统中所有主要常驻细胞类型的纯度高、具有活性的单细胞悬液。不同细胞类型通过磁珠激活细胞分选技术（MACS）23进行分离。细胞分离可通过阳性选择实现，即对细胞类型特异性表面标志物进行磁性标记；也可通过阴性选择实现，即对所有非目标细胞进行生物素标记并清除。采用流式细胞术检测，确保所分离的单细胞悬液纯度高于90%，活性至少达到80%。
总之，主要目标是建立一种同时分离中枢神经系统所有主要常驻细胞类型的方案，作为一种多功能工具，用于研究神经炎症通路，从而在健康小鼠和EAE小鼠中对复杂的细胞网络及生化信号级联进行系统而精确的分析。

<table><tbody><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning, MA, USA</td><td>352350</td><td>中枢神经系统组织解离</td></tr><tr><td>ACSA-2 抗体，抗小鼠，PE-Vio 615（克隆 REA-969）</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-116-244</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>成年小鼠和大鼠脑组织解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-107-677</td><td>组织解离，包含碎片和红细胞去除溶液；收到后立即分装酶 A 和酶 P，并于 -20 &amp;deg;C 保存；其余试剂盒组分于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>抗 ACSA-2 MicroBead 试剂盒，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-097-678</td><td>星形胶质细胞磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32 抗体&amp;nbsp;</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>101301</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>抗 O4 MicroBeads，人、小鼠、大鼠</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-094-543</td><td>少突胶质细胞磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>AstroMACS 分离缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-091-221</td><td>星形胶质细胞磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>生物素抗体，PE（克隆 Bio3-18E7）</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-113-853</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>BRAND Neubauer 计数板</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10195580</td><td>细胞计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD45 抗体（克隆 30-F11）</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>103137</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads，人、小鼠</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-049-601</td><td>小胶质细胞磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>DNA酶 I，重组型，无RNase</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>4716728001</td><td>流式细胞术，-20&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>含钙、镁、葡萄糖和丙酮酸盐的 D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>14287080</td><td>缓冲液，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>不含钙、镁的 D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>14190250</td><td>缓冲液，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>65-0865-14</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>00-5523-00</td><td>流式细胞术，4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Falcon（15 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>11507411</td><td>细胞管</td></tr><tr><td>Falcon（50 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10788561</td><td>细胞管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;带细胞筛 snap cap 的 5 mL 圆底聚苯乙烯试管</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>08-771-23</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>FcR 封闭试剂，小鼠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-092-575</td><td>少突胶质细胞磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>雌性 C57BL/6J 小鼠</td><td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>F2442-50ML</td><td>流式细胞术，-5 至 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗 CD11b 抗体&amp;nbsp;（克隆 M1/70）</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>553310</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>弗氏完全佐剂（Freund&amp;rsquo;s Complete adjuvant）</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>AR001</td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>GentleMACS C 管</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-093-237</td><td>中枢神经系统组织解离</td></tr><tr><td>带加热模块的 GentleMACS Octo 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-096-427</td><td>中枢神经系统组织解离</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8.4.3</td><td>Graphpad by Dotmatics</td><td></td><td>图形分析</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>AbbVie, North Chicago, IL, USA</td><td></td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Kaluza 分析软件 V2.1.1</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-042-401</td><td>磁珠分选（MACS）</td></tr><tr><td>MACS BSA 储存液</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-091-376</td><td>PB 缓冲液</td></tr><tr><td>MACS 多柱支架</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-042-303</td><td>磁珠分选（MACS）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MOG&lt;sub&gt;35&amp;ndash;55&lt;/sub&gt; 肽段</td><td>Charit&amp;eacute;, Berlin, Germany；替代来源：Genosphere Biotechnologies（Paris, France）或 sb-Peptide（Saint Egr&amp;egrave;ve, France）</td><td></td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>结核分枝杆菌 H37 Ra 菌株</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>小鼠神经元分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-115-390</td><td>神经元磁珠分选（MACS），4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>O4 抗体，抗人/小鼠/大鼠，APC（克隆 REA-576）</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-119-897</td><td>流式细胞术，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>甘油中的百日咳毒素</td><td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td><td>BT-0105</td><td>主动诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）；-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td><td>43-10100-40</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>QuadroMACS 分选仪&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-090-976</td><td>磁珠分选（MACS）</td></tr><tr><td>重组 Alexa Fluor 647 标记抗 NeuN 抗体（克隆 EPR12763）</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>EPR12763</td><td>流式细胞术，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>不锈钢脑组织切片模具，1 mm</td><td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td><td>15067</td><td>中枢神经系统组织解剖</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>15250061</td><td>细胞计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5&amp;nbsp;M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>15575020</td><td>流式细胞术，室温保存</td></tr></tbody></table>

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化症（MS）最常用的小鼠模型，常用于进一步阐明MS尚未明确的病因，从而开发新的治疗策略。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）诱导的EAE模型可在免疫后10天内重现一种自限性单相病程，表现为进行性上升性瘫痪。小鼠每日通过临床评分系统进行评估。MS由多种具有特定时间模式的致病机制驱动，因此研究中枢神经系统（CNS）驻留细胞类型在疾病进展中的作用具有重要意义。本方案的独特之处在于可同时分离成年EAE小鼠和健康小鼠中所有主要的CNS驻留细胞类型（小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元）。首先分离成年小鼠的脑和脊髓组织，随后通过磁珠激活细胞分选（MACS）技术分离小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。采用流式细胞术对纯化后的单细胞悬液进行质量分析，确认细胞分离后的存活率，并显示每种细胞类型的纯度均约为90%。综上所述，该方案为分析健康和EAE小鼠中复杂的细胞网络提供了一种精确且全面的方法。此外，由于可从同一只小鼠中同时分离出四种细胞类型，所需小鼠数量可显著减少。

本方案提供了一种从单个中枢神经系统样本中同时分离所有主要的中枢神经系统常驻细胞（即小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元）的可能性。这对于减少此类实验所需的小鼠数量以及确保在细胞水平上进行分子和生化分析的可比性具有重要意义。如果不同细胞类型分别来自不同的中枢神经系统样本，则无法真实反映细胞间的相互作用，且分离过程中的潜在技术偏差可能影响后续分析结果。此外，由于各细胞类型的分子和生化研究结果并非来源于同一实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）背景，彼此之间也不具备可比性。本研究对已有的磁珠分选（MACS）方案进行了优化，采用商用系统/试剂盒，实现了上述多种细胞类型的同步分离。
小胶质细胞的分离采用抗CD11b微珠，少突胶质细胞通过抗O4微珠进行分离（表1），而星形胶质细胞的分离则使用抗ACSA-2微珠（表2）。相比之下，神经元的分离采用阴性筛选策略，通过生物素标记并磁性标记所有非神经元细胞来实现（表2）。除血细胞外，所有非神经元细胞（例如少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和成纤维细胞）均可利用与这些非神经元细胞表面抗原特异性结合的生物素偶联抗体进行磁性标记（表2）。通过去除这些磁性标记的非神经元细胞，可获得高纯度且具有活性的神经元细胞群体30,42,43。
设计了两个新的流式细胞术检测方案，用于分析所制备单细胞悬液的纯度。此处结合了细胞类型特异性表面标记物和核标记物，并进行了活细胞/死细胞区分。
每只小鼠获得的细胞产量及细胞类型（图3A）分析结果显示，每只未处理小鼠平均可获得 8.4 × 105 ± 3 × 104 个小胶质细胞、3.23 × 106 ± 1 × 105 个少突胶质细胞、8.6 × 105 ± 2 × 104 个星形胶质细胞和 4.5 × 105 ± 1 × 104 个神经元。
在研究神经炎症疾病模型的背景下，该方案还应用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型。小鼠在诱导EAE后第16天被实施安乐死，此时疾病程度达到峰值。在此EAE模型中，分离得到约 2.9 x 106 ± 6.7 x 105 个少突胶质细胞、5.2 x 105 ± 9 x 104 个星形胶质细胞以及 4.4 x 105 ± 4 x 104 个神经元。由于在MACS步骤后增加了细胞分选过程，每只EAE小鼠获得的微胶质细胞数量减少至约 1.7 x 105 ± 4 x 104 个（图3A）。
分离后，通过流式细胞术对不同细胞群进行表型表征，结果证明可获得存活的单细胞悬液，其中所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的纯度均约为90%（图3B）。小胶质细胞根据文献定义被设门为CD45intCD11bhigh44,45,46,47。
在EAE中，必须从所有CD11b+细胞中分选出小胶质细胞，以将其与其他在神经炎症期间侵入中枢神经系统的CD11b+免疫细胞（如单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和巨噬细胞）区分开来27,28,48。因此，从小鼠CD11b+细胞悬液中以CD45intCD11high表型对小胶质细胞进行分选。整个小胶质细胞分选策略如图4所示。在正常小鼠中，小胶质细胞占所有活单细胞的91.16%（占总CD11b+细胞群体的96%）（图4A）。在EAE小鼠中，小胶质细胞占所有活单细胞的46.85%（占总CD11b+细胞群体的55%）（图4B）。尽管磁珠分选（MACS）和流式分选（FACS）过程均会对单个细胞施加机械应力，但分选后纯化的小胶质细胞中仍有75.41% ± 8.63%保持存活（图3B）。
从初始的中枢神经系统细胞悬液中直接分离的星形胶质细胞和神经元显示出少突胶质细胞的显著污染，由此推测，在分离少突胶质细胞后的阴性流穿部分中同时分离神经元和星形胶质细胞可避免此类污染。流式细胞术分析证实，从少突胶质细胞阴性流穿部分分离的星形胶质细胞纯度为89.23% ± 2.78%，存活率为80.56% ± 1.41%。与这些结果类似，从O4-细胞组分中分离的神经元纯度为81.25% ± 3.31%，存活率为83.90% ± 2.61%（图3B）。这些结果也证实，在少突胶质细胞分离之后再同时分离这两种细胞类型，并不会影响有活性的功能性细胞的数量。
在EAE小鼠中分离获得的单细胞悬液的活力和纯度结果与正常小鼠中获得的结果非常相似，表明该方案不仅适用于健康小鼠，也适用于EAE疾病背景下的小鼠（图3B）。
<img alt="细胞表型分析图；naïve 与 EAE 条件下；小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：分离的中枢神经系统驻留细胞的细胞得率及基于流式细胞术的验证。(A) 在 naïve 小鼠和 EAE 小鼠中分离中枢神经系统驻留细胞后，每只小鼠每种细胞类型的细胞得率。柱状图展示了按照本方案操作后每只小鼠每种细胞类型的细胞得率。naïve 小鼠的数据来自五个生物学重复，EAE 小鼠的数据来自四个生物学重复。图中显示相应的均值 ± 标准误（SEM）。(B) 纯化后各细胞组分的纯度与活力分析。柱状图显示基于细胞类型特异性标志物表达水平所得的单细胞悬液的活力和纯度。NeuN 用作神经元的细胞类型特异性核标志物。每种细胞类型在健康小鼠和 EAE 小鼠中均采集并比较了五个生物学重复。图中显示相应的均值 ± 标准误（SEM）。缩写：Anti-ACSA-2 = 星形胶质细胞表面抗原-2；CD11b = 周期素依赖性激酶11B；CD45 = 受体型酪氨酸蛋白磷酸酶C；CNS = 中枢神经系统；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；MACS = 磁珠激活细胞分选；NeuN = RNA结合蛋白fox-1同源物3；O4 = 少突胶质细胞标志物O4；SEM = 均值标准误。本图改编自49。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术结果，散点图显示细胞分选、设门分析、SSC-A/FSC-A、CD45/CD11b 标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4分选小胶质细胞的设门策略（在分离CD11b+细胞后）。（A） 幼稚型小鼠和（B）EAE 小鼠中的门控策略。每个图面板的上排显示分选前的散点图，下排显示分选后的散点图。在选择活细胞（SSC-A / FSC-A）和单细胞（FSC-H / FSC-W）后，CD45阳性细胞群intCD11b+ 细胞被分选为小胶质细胞群体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化症（MS）最常用的小鼠模型，常用于进一步阐明……

为了研究多发性硬化等自身免疫性疾病的分子和细胞机制，目前迫切需要建立可重复且精密的细胞分离方案。现有的大多数用于分离和分析中枢神经系统驻留细胞的技术均存在严重缺陷，例如仅针对单一细胞类型或仅适用于出生后小鼠。本方案可从单个中枢神经系统样本中同时分离所有主要的中枢神经系统驻留细胞类型，从而能够在体外分析复杂的神经元网络以及新的炎症通路，所获得的单细胞悬液适用于健康小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型。此外，小鼠数量有所减少。我们建立的在健康和EAE小鼠中同时分离四种主要中枢神经系统常驻细胞类型的方案，可作为研究新型炎症通路的研究团队的有用工具，从而实现对复杂的生物分子机制和细胞网络进行更为精确的离体分析。借助本方案可回答的新科学问题包括在EAE疾病进程的不同阶段（如神经炎症、神经退行性变和缓解期）进行动态研究。此外，还可以在单细胞水平上研究细胞间的相互作用和生物化学通路。同样，可对培养的细胞进行功能检测。我们计划针对每个EAE时间点的单个中枢神经系统匀浆样本，开展多组学分析，重点关注EAE病程的动态研究。首先将小鼠置于仰卧位，并用针固定四肢。在动物体前部涂抹75%乙醇。沿腹部和胸部的皮肤及筋膜做纵向切口。沿胸骨旁剪断肋骨，向上翻起胸廓以充分暴露心脏。用针固定上翻的胸廓。用剪刀剪开右心房。使用套管，将20毫升的单倍磷酸盐缓冲液（PBS）注入左心室，通过剪开的右心房冲洗血液。沿小鼠头部顶端的皮肤做纵向切口，暴露颅骨，并用镊子将头部周围的皮肤移开。借助剪刀沿矢状缝剪开颅骨。沿切口线插入剪刀尖端，以打开颅盖。用镊子移除颅盖的剩余部分，使脑组织完全暴露。小心取出脑组织，并将其放入小鼠脑切片模具中。使用剃刀将脑组织切成一毫米厚的矢状切片。用剪刀在髂嵴上方剪断脊柱。将连接有20毫升PBS溶液的一次性20号针头插入脊髓腔内。从尾端向头端将脊髓从脊髓腔中冲洗出来。使用解剖刀将脊髓切成每段0.5厘米长的小段。将包含脑组织和相应脊髓的中枢神经系统细胞悬液置于含有3毫升冷DPBS的培养皿中保存。首先，解剖脑和脊髓组织，并将细胞悬液置于冰上保存。然后，配制适量的酶混合液一和酶混合液二。取1950微升酶混合液一加入C管中，再加入中枢神经系统细胞悬液的组织碎片。然后向 C 管中加入 30 µL 酶混合液二。将 C 管盖紧，并倒置固定在带加热器的细胞解离仪套筒上。运行相应的程序，并观察至少 5 分钟，以确保所有管子以相同的速度旋转。在此期间，将一个70微米的滤网置于50毫升离心管上，并用2毫升DPBS预湿滤网。程序结束后，从解离装置上取下C管，将样品在4摄氏度下以300 ×g离心1分钟。重新悬浮样品，然后将其加入预湿的滤网中。向空的 C 管中加入 10 毫升冷 DPBS，混匀，然后将悬液加入对应的滤筛中。弃去滤筛后，再次离心细胞悬液 10 分钟，然后小心吸除上清液以获得细胞沉淀。首先，在解离中枢神经系统组织后获得细胞沉淀，并将其用 3100 微升 DPBS 重悬于一个 15 毫升离心管中，切勿涡旋振荡。向两份合并的中枢神经系统细胞悬液中各加入1800微升成年动物脑组织解离试剂盒中的碎片去除液。轻轻颠倒离心管以混匀悬液，然后缓慢地在每份悬液上层铺加4毫升预冷的DPBS，观察形成清晰的梯度界面。将离心管在4°C条件下以3000 ×g离心10分钟，加速度设为最大，不启用刹车功能。离心后形成三层。完全吸除上层两相并弃去，确保无髓鞘残留。用预冷的DPBS加至14毫升，然后关闭管盖。用力将离心管倒置在实验台面上，直至细胞沉淀从管底脱离。离心样品并彻底吸除上清液。如需去除红细胞，请向细胞沉淀中加入1毫升红细胞去除溶液。重悬沉淀后，在4°C下孵育溶液10分钟。然后加入10毫升冷的PB缓冲液，离心样品，并彻底吸除上清液。细胞计数时，先用PB缓冲液将细胞悬液稀释50倍，再用0.4%台盼蓝溶液进行1:10稀释。然后使用改良的计数室测定细胞数量。首先，将纯化后的未稀释小鼠中枢神经系统细胞悬液分为两份，用于进一步分离小胶质细胞和少突胶质细胞。然后，向相应的细胞悬液中加入针对不同中枢神经系统细胞类型表面抗原的磁性标记微珠。将柱子置于磁场中，平衡柱子，然后将所得的细胞悬液加到柱子上。磁标记的细胞将被保留在柱子内，而未标记的细胞则会流过。将柱子从磁场中移开后，用缓冲液将磁标记的细胞从柱子中冲洗出来，收集到离心管中，作为正向筛选的细胞组分。将少突胶质细胞的阴性流过部分分为两份，用于进一步分离神经元和星形胶质细胞。利用细胞类型特异性标记物结合活/死细胞区分进行流式细胞术分析，获得小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。对不同细胞群体的表型鉴定证明，所有主要中枢神经系统常驻细胞类型均获得了纯度和活性均约为90%的单细胞悬液。

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从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要中枢神经系统驻留细胞类型

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。...

从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。...

确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。...

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。视网膜神经节细胞（RGCs）的轴突被完全横断（轴突切断术）后，90%的细胞在轴突切断术后14天内死亡。该模型易于进行实验操作，且具有高度可重复性。...

视神经横断：中枢神经系统中成年神经元凋亡的模型

了解从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等主要中枢神经系统驻留细胞类型的新方法。该技术可减少实验动物使用数量，提高神经免疫学研究的数据质量。

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

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