Name: 在 非洲爪蟾 蝌蚪中生成视网膜损伤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解非洲爪蟾蝌蚪视网膜损伤模型的建立方法，探索Muller胶质细胞在视网膜再生中的作用机制。该研究为开发人类视网膜神经退行性疾病的治疗策略提供重要理论基础。

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本研究获得了 Retina France 协会、法国基金会、罕见病基金会（FMR）、Bardet-Biedl 综合征协会（BBS）以及盲人与视觉障碍者国家联盟（UNADEV）向 M.P. 提供的资助，上述资助由多机构专题研究所（ITMO NNP，神经科学、认知科学、神经病学与精神病学）/生命科学与健康联盟（AVIESAN）合作支持。

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

不同视网膜损伤模型的优缺点 非洲爪蟾 蝌蚪
机械性视网膜损伤 
已在非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪中建立多种神经视网膜的手术损伤模型。神经视网膜可被完全移除15,16，也可仅部分切除16,17。本文所介绍的机械性损伤不涉及任何视网膜切除操作，而是采用我们先前在Xenopus蝌蚪中建立的一种简单的眼部穿刺方法6。由于该机械性视网膜损伤模型依赖手工操作，其表型在不同蝌蚪之间可能存在显著差异。此外，损伤的可重复性及损伤程度也可能因操作者不同而有所变化。因此，我们建议由同一人完成全部损伤操作。
利用 NTR-M...

全球数百万人患有各种导致失明的视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性（AMD）。迄今为止，这些疾病在很大程度上仍无法治愈。目前正在评估的治疗方法包括基因治疗、细胞或组织移植、神经保护治疗、光遗传学以及假体装置。另一种新兴策略是通过激活具有干细胞潜能的内源性细胞来实现自我再生。在此背景下，穆勒胶质细胞——视网膜主要的胶质细胞类型——成为备受关注的细胞来源之一。在损伤发生后，它们能够去分化、增殖并生成神经元1,2,3。尽管这一过程在斑马鱼或Xenopus中非常有效，但在哺乳动物中却效率极低。
尽管如此，已有研究表明，使用适当的有丝分裂原蛋白处理或过表达多种因子可诱导哺乳动物穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并在某些情况下进一步触发其后续的增殖与分化&#160;神经发生承诺1,2,3,4,5然而，这在治疗应用上仍然远远不足。因此，深入理解再生过程中的分子机制十分必要，以鉴定出能够有效将穆勒细胞的干细胞样特性转化为新型细胞治疗策略的分子。
为此，我们建立了多种损伤模型 非洲爪蟾 引发视网膜细胞变性的因素。本文介绍了（1）一种非细胞类型特异性的机械性视网膜损伤模型，（2）一种利用NTR-MTZ系统靶向视杆细胞的条件性且可逆的细胞消融模型，（3）一种CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除，一种视网膜色素变性的模型，可引发进行性视杆细胞退化, 以及（4）CoCl2-诱导的细胞毒性模型，该模型可根据剂量特异性地靶向视锥细胞或导致更广泛的视网膜细胞变性。我们重点阐述了每种范式的特性、优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>1,2-丙二醇（丙基）&amp;egrave;乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇 &amp;ge;99.8%</td><td>VWR 化学品</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>抗活化型半胱天冬酶3抗体（兔）</td><td>细胞信号传导</td><td>9661S</td><td>稀释比例 1/300</td></tr><tr><td>抗GFP抗体（鸡）</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>抗M-视蛋白抗体（兔）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>抗小鼠二抗，Alexa Fluor 594（山羊）</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>稀释比例 1/1,000</td></tr><tr><td>抗Otx2抗体（兔）</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>稀释比例 1/100</td></tr><tr><td>抗兔二抗，Alexa Fluor 488（山羊）</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>稀释比例 1/1,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>稀释比例 1/1,000</td></tr><tr><td>抗视网素抗体（兔）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>抗视紫红质抗体（小鼠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>稀释比例 1/1,000</td></tr><tr><td>抗S-视蛋白抗体（兔）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>细胞凋亡检测试剂盒（Dead End 荧光素 TUNEL 系统）</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>苯佐卡因&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>10% 储备液</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258（Hoechst）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>储存液 10 mg/mL</td></tr><tr><td>正丁醇 &amp;ge;99.5%</td><td>VWR 化学品</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich（Supelco）</td><td>1.02382</td><td>以 0.1 M 使用</td></tr><tr><td>Cas9（EnGen Spy Cas9 NLS）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark 毛细玻璃管型号 GC100TF-10</td><td>华纳仪器公司（哈佛仪器公司）</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化钴(II)（CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>100 mM 储存液</td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL 抗体稀释液&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>电子旋转切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Microm HM 340E&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1% 水溶性伊红</td><td>RAL 诊断</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>荧光素赖氨酸葡聚糖&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>甘油明胶（Mallory 法）</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>以3%的比例溶于水中使用</td></tr><tr><td>苏木精（Mayer's Hemalun）</td><td>RAL 诊断</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 钾盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素激素</td><td>MSD动物健康</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸烟雾，37%（HCl）</td><td>Sigma-Aldrich（SAFC）</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>在0.1x MBS（pH 7.8 - 8.0）中以2%浓度使用</td></tr><tr><td>七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich（Supelco）</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>甲硝唑&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich（Supelco）</td><td>M3761</td><td>使用浓度为 10 mM</td></tr><tr><td>显微操作加样头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪（P-97 Flaming/Brown）</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>程序：加热 700 / 拉制 100 / 速度 75 / 时间 90 / 解锁 p = 500</td></tr><tr><td>用于保存荧光的封片介质，FluorSave 试剂</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>封片剂，Eukitt</td><td>化学实验室</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 超薄切片机刀片</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>25 G × 5/8″ 针头</td><td>泰尔茂</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>镀镍针夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>尼龙过滤织物（筛分织物）NITEX，孔径 1,000 &amp;micro;m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>不含DMSO的石蜡组织包埋蜡</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>EM-15714-S</td><td>在 pH 7.4 的 1×PBS 中使用，浓度为 4%</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 一次性包埋模具</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>研钵杵</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100 mm</td><td>康宁高赛尔</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>55 mm 培养皿</td><td>康宁高赛尔</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>PicoSpritzer 微注射系统</td><td>Parker 仪器产品</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>针&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>聚蔗糖（Ficoll PM 400）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>在0.1x MBS中以3%使用</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>微粒鱼苗饲料：sera Micron Nature</td><td>血清</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>剪刀解剖</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;KNITTEL 玻璃</td><td>VS11171076FKA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>载玻片加热板</td><td>孔兹仪器</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠三钠盐二水合物（C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;，2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR 化学品</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich（Supelco）</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>30% 氢氧化钠水溶液 (NaOH)</td><td>VWR 化学品</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>注射器 Omnifix-F Solo 一次性注射器 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>反式激活crRNA（tracrRNA）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072533</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC 荧光光源</td><td>X-Cite&amp;nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯 &amp;ge;98.5%&amp;nbsp;</td><td>VWR 化学品</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

构建视网膜损伤模型 非洲爪蟾 蝌蚪

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在众多正在探索的治疗策略中，激活自我修复机制近年来尤为引人关注。在视网膜修复的细胞来源中，穆勒胶质细胞（Müller glial cell）备受重视，因其在无羊膜动物中具有干细胞潜能和极强的再生能力。然而，这种潜能在哺乳动物中极为有限。研究具有再生能力的动物模型中视网膜再生的分子机制，有助于揭示如何激活哺乳动物穆勒胶质细胞中潜在的视网膜再生能力。这是再生医学领域发展治疗策略的关键步骤。为此，我们建立了多种视网膜损伤模型 非洲爪蟾：一种机械性视网膜损伤，一种可实现硝基还原酶介导的光感受器条件性消融的转基因品系，一种基于CRISPR/Cas9介导的视网膜色素变性模型 视紫红质 敲除，以及由眼内CoCl驱动的细胞毒性模型2 注射。本文重点介绍这一系列可诱导多种退行性病变并用于研究视网膜再生的实验方案，同时阐述其优势与局限性。 非洲爪蟾.

机械性视网膜损伤 
经受协议第1部分所述机械性损伤的蝌蚪视网膜切片显示，视网膜损伤累及组织的所有层，但局限在穿刺部位（图 2A、B）。
利用 NTR-MTZ 系统进行条件性视杆细胞消融 
根据方案第 2 节所述，经 MTZ 处理的麻醉状态下的 Tg(rho:GFP-NTR) 转基因蝌蚪眼球在体视显微镜下进行观察分析（图 3A、B）。与对照组相比，GFP 荧光信号的减弱表明视杆细胞被逐步特异性消融（图 3B），该结果通过视网膜切片的 GFP 免疫染色进一步确认，如方案第 5 节所述（图 3C）。
通过 CRISPR...

我们已开发出多种在Xenopus laevis蝌蚪中诱导视网膜损伤或视网膜变性的实验方案。这些模型为研究视网膜再生机制提供了可能。

视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在当前探索的多种治疗策略中，刺激自身修复……

我们的实验室致力于视网膜再生研究。我们以非洲爪蟾（Xenopus）作为模型系统。这种两栖动物非常引人注目，因为与我们人类等哺乳动物不同，它在视网膜受损后能够非常高效地实现再生。我们正在研究其潜在机制，因为未来这一机制可能有助于触发患有视网膜神经退行性疾病的人类患者的视网膜再生。我们最近发现，除了视网膜周边区域的干细胞和视网膜色素上皮细胞外，米勒胶质细胞（Muller glia cells）在视网膜损伤时也可被招募参与视网膜再生。因此，我们目前正在研究神经炎症与这些细胞再生能力之间的关联。事实上，神经炎症微环境似乎是调控视网膜再生的关键因素。为了研究视网膜再生过程中涉及的相似及分子机制，我们在非洲爪蟾（Xenopus）中建立了多种视网膜损伤模型。第一种是机械性视网膜损伤。第二种是转基因品系，可实现硝基还原酶介导的光感受器条件性消融。第三种是基于CRISPR-Cas9介导的视紫红质基因敲除的视网膜色素变性模型。最后一种是通过眼内注射氯化钴（CoCl₂）诱导的细胞毒性模型。我的宿主实验室已发现，尽管非洲爪蟾能够再生视网膜，但其再生效率具有高度变异性，且依赖于蝌蚪的发育阶段以及物种类型（非洲爪蟾或热带爪蟾）。这使得非洲爪蟾成为揭示触发或限制视网膜再生分子机制的理想模型。首先使用捞网从养殖缸中捕获蝌蚪，并将其转移至盛有0.005%苯佐卡因溶液的新鲜容器中以进行麻醉。然后等待几分钟，使蝌蚪停止对刺激的反应。现在用勺子捕获已麻醉的蝌蚪，小心地将其背侧朝上放置在铺有湿润滤纸的小型培养皿中央。随后将标本置于体视显微镜下进行观察。使用固定在针持器上的直径为0.2毫米的针头，从右眼背侧小心插入工具，刺穿视网膜并完全穿透。然后将培养皿旋转180度，穿刺左眼。将含有损伤蝌蚪的培养皿小心浸入盛有1升饲养用水的大水箱中。持续观察蝌蚪直至其完全苏醒。经机械损伤的蝌蚪视网膜切片显示，组织各层均出现视网膜病灶，但病灶局限于穿刺部位。首先，使用一种转基因品系，该品系在视杆光感受器特异性启动子驱动下表达GFP和硝基还原酶（NTR）。NTR 可将前体药物甲硝唑（metronidazole，MTZ）转化为细胞毒性物质，从而选择性消融表达 NTR 的感光细胞。进行 GFP 检测时，使用勺子轻轻捞起一只已麻醉的蝌蚪，小心地将其放置于小培养皿内湿润的组织上。在荧光体视显微镜下观察 GFP 荧光，并拍摄眼睛的荧光图像。将含有蝌蚪的培养皿小心浸入盛有饲养用水的大水箱中，直至蝌蚪完全苏醒。为单独监测视网膜变性情况，将每只蝌蚪置于一个小容器中，容器内含 30 毫升 10 毫摩尔的 MTZ 溶液，或将其转基因同胞置于对照溶液中。进行批量处理时，将转基因蝌蚪放入较大的容器中，容器内含 1 升 MTZ 溶液或对照溶液。在20摄氏度避光条件下培养蝌蚪一周，以避免MTZ降解。七天后，在荧光体视显微镜下观察GFP，并拍摄眼睛的荧光图像。若荧光强度降低，甚至几乎无荧光信号，则表明视杆细胞已发生退化。与对照组相比，经MTZ处理的转基因蝌蚪的眼睛显示出GFP荧光减弱，这一结果通过视网膜切片的GFP免疫染色进一步证实。首先，取一根锋利的毛细管，使用微量上样吸头加入2至10微升的CRISPR Cas9核糖核蛋白复合物或对照溶液。随后，将装有液体的毛细管放入显微注射仪的手持装置中。使用精细镊子折断毛细管尖端，以调节喷出体积至10纳升。将1细胞期胚胎置于已用3%多蔗糖溶液粘附在100毫米培养皿底部的网格上。在体视显微镜下，利用显微注射仪将10纳升溶液注射至皮质区域，具体位置为细胞质膜下方的动物极水平。24 小时后，在荧光体视显微镜下观察荧光素、赖氨酸和糊精，并挑选注射良好的 rho 基因编辑胚胎。对 rho 基因编辑蝌蚪视网膜进行 Caspase 3 标记显示，部分视杆细胞发生凋亡。组织学染色揭示核层整体得以保留，但感光细胞外段显著缩短。使用感光细胞标记物进行进一步的免疫染色分析，结果显示视杆细胞外节发生退化。使用捞网从蝌蚪的饲养罐中捕获蝌蚪，并将其转移至含有50毫升0.005%苯佐卡因溶液的容器中。让蝌蚪在该溶液中静置，直至其不再对刺激产生反应。用勺子轻轻捞起一只蝌蚪，将其背侧朝上放入含有湿润滤纸的小培养皿中。然后将标本置于体视显微镜下。首先取一根拉细的毛细管，使用微量加样器吸头吸取10 µL氯化钴溶液。随后，将装有液体的毛细管放入显微注射仪的操作手柄中，折断毛细管尖端，以调节排出体积至约 30 纳升。使用显微注射仪和体视显微镜，将装有氯化钴的毛细管经晶状体上方插入眼内。当毛细管尖端到达眼内后，每眼注射两滴，每滴约 30 纳升。注射完右眼后，将培养皿旋转180度以注射左眼。将已注射的蝌蚪连同培养皿一起转移至含有1升饲养用水的大水箱中。持续观察蝌蚪，直至其完全苏醒。注射10毫摩尔氯化钴导致视锥光感受器特异性细胞死亡，而25毫摩尔氯化钴则引起广泛的视网膜细胞死亡。免疫染色显示，注射10毫摩尔氯化钴的视网膜中视锥细胞缺失，而视杆细胞基本得以保留。注射25毫摩尔氯化钴后，光感受器细胞和双极细胞均受到严重损伤。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在 非洲爪蟾 蝌蚪中生成视网膜损伤模型

本文介绍了一种在成年斑马鱼视网膜中条件性敲低目标蛋白表达的方法，该方法包括将反义吗啉环寡核苷酸（morpholinos）玻璃体内注射并电穿孔导入视网膜。该方法可使目标蛋白表达在数天内被敲低，从而可用于研究该蛋白在再生或完整视网膜中的功能。...

体内电穿孔法将吗啉代寡核苷酸导入成年斑马鱼视网膜

Xenopus laevis 为研究视网膜细胞在原代细胞培养中的细胞命运决定及单个视网膜细胞的生理功能提供了一个理想的模型系统。本文介绍了一种分离视网膜组织并建立原代细胞培养的方法，该培养物可用于钙活性成像及后续分析 原位...

Xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

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从斑马鱼胚胎中建立原代视网膜神经节细胞培养

本视频演示了使用激光损伤在成年斑马鱼中诱导视网膜变性的操作步骤。激光靶向视网膜中的感光细胞，引发细胞死亡及退行性过程。该损伤可激活穆勒胶质细胞（MG），促使其去分化为干细胞前体细胞，从而促进视网膜再生。...

利用局灶性激光损伤建立斑马鱼视网膜变性与再生模型

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一种用于检测非洲爪蟾（Xenopus laevis）视觉功能的简单行为学实验方法

本实验方案描述了一种从鸡胚中分离、实验性操作及培养完整视网膜外植体的方法。当需要高成功率、高效性和可重复性以检测用于电穿孔和/或试剂物质的质粒效果时，此类外植体培养具有重要应用价值。 即，...

鸡胚全视网膜外植体用于电穿孔及化学试剂处理

斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。...

成年转基因斑马鱼视网膜外植体的培养及其通过多光子显微镜进行的活细胞成像

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本方案旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物显微注射到一天龄Xenopus...

Xenopus laevis 胚胎眼芽中DNA的显微注射及完整活体Xenopus蝌蚪中表达GFP的视神经轴突丛的成像

本方案描述了利用转基因斑马鱼模型遗传消融视网膜色素上皮（RPE）的方法。文中详细阐述了对该方案的改进，以结合使用药理学化合物调控信号通路。此外，开发并介绍了基于色素沉着定量分析RPE再生的MATLAB平台，并对此进行了讨论。...

硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的MATLAB平台（RpEGEN）

了解非洲爪蟾蝌蚪视网膜损伤模型的建立方法，探索Muller胶质细胞在视网膜再生中的作用机制。该研究为开发人类视网膜神经退行性疾病的治疗策略提供重要理论基础。

构建视网膜损伤模型非洲爪蟾蝌蚪

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构建视网膜损伤模型 非洲爪蟾 蝌蚪

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