人类胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在最佳阶段的冷冻保存

我们的实验室致力于深入理解视网膜疾病的分子机制，重点关注患者尚未满足的医疗需求。我们的目标是开发有效的治疗方法，例如基于干细胞的疗法。视网膜色素上皮细胞（RP细胞）的冷冻保存是RP替代治疗中的重要步骤。

目前，细胞在不同阶段被冷冻，导致播种后存活率差异较大。因此，有必要确定冷冻这些细胞的最佳细胞阶段。本方案通过确定RP细胞的对数生长期，提供了一种简单、高效且经济的RP细胞冷冻方法。

它对分化方法或细胞系的依赖性较低。首先，将一管解冻的冷基底膜基质用 12 毫升 DMEM/F12 稀释。充分混匀悬浮液。

向24孔板的每个孔中加入一个盖玻片。然后向每个孔中加入250 µL稀释的基质溶液。弃去培养的hESC来源的视网膜色素上皮细胞板中的培养基。

用预热的 PBS 每孔 1 毫升洗涤培养板两次。接着，向培养板的各孔中加入 0.5 毫升细胞解离试剂，在 37°C 下孵育 15 分钟以启动消化。孵育结束后，在显微镜下观察细胞，以确认消化完成。

现在，使用1毫升移液器轻轻吹打细胞悬液，上下吹打10次。加入预热的培养基以稀释悬液，然后在室温下以250×g离心3分钟。

将离心管中的上清液倒出。然后用 2 毫升培养基重悬细胞沉淀。使用移液器将细胞吹打混匀 10 至 15 次。

将细胞悬液通过40微米的细胞筛过滤。接着，计数视网膜色素上皮细胞。接种前吸除包被液。

然后向每个孔中加入一毫升培养基，并将细胞接种到盖玻片上。在 EdU 掺入和染色后，使用荧光显微镜拍摄五个随机视野的图像。计算 EdU 阳性细胞的百分比。

然后绘制相应的比例时间曲线以生成生长曲线。最后，确定每种细胞系对数生长期的冻存窗口期。视网膜色素上皮细胞在初期失去了其典型的六边形形态，但在生长的对数期重新恢复了该形态。

当细胞继续培养一周后，细胞增殖减少。EdU 增殖实验证实，P2 第五天的细胞增殖率较高，而 P2 第11天的细胞已进入增殖减缓期。首先，消化人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞。

制备细胞悬液，然后进行细胞计数。接下来，在室温下以250G离心力离心3分钟。倒去上清液。

然后将细胞沉淀重悬于冷冻保存液中。接着，取1 mL细胞悬液转移至1.2 mL冻存管中。将冻存管放入冻存盒中，在-80摄氏度条件下过夜冷冻。

将小瓶转移至液氮中进行长期保存。解冻冷冻小瓶时，先将培养基置于加热至37摄氏度的金属珠中预热。向15毫升离心管中预先加入10毫升预热的培养基。

现在，从液氮中取出冻存管，放入自动解冻系统中进行快速解冻。向冻存管中加入0.5至1毫升预热的培养基，以确保细胞逐步适应环境。然后将1.5至2毫升的细胞悬液用移液器转移至含有培养基的15毫升离心管中。

在室温下以250G离心细胞3分钟。然后弃去上清液。将沉淀重悬于2毫升预热的培养基中。

使用血细胞计数板对细胞进行加样并计数，以确定回收率和存活率。将冻存后解冻的细胞接种于基底膜包被的培养板中，在含有Y27632的培养基中进行培养。处于对数生长期第五天冷冻保存的视网膜色素上皮细胞，解冻后表现出更高的贴壁率。

与其他时间点冻存的细胞相比，具有典型六边形形态的细胞表现出成纤维细胞样表型。P2代培养第五天的细胞在解冻后28天显示出更高的细胞标志物表达水平以及更准确的定位。值得注意的是，不同冻存培养基在解冻后均能实现较高的细胞活力和贴壁能力，效果相当。