用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像
2024年1月5日
患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。
我们应用源自患者肿瘤标本的类器官模型，来研究肿瘤对药物的反应。我们还可以确定与治疗反应相关的分子特征。这些结果随后被用于优先筛选最有前景的新疗法，以推动未来进入临床试验。
使用患者来源类器官模型的主要挑战之一在于其资源有限。此外，目前市面上可用于评估类器官模型药物反应的现成试剂盒极少，且缺乏能够以保留样本完整性、支持后续其他分析（如转录组学分析）的形式进行检测的方法。我们开发了一种多重方法，用于在类器官模型中对治疗反应进行基因水平的监测。
我们使用针对不同细胞过程的特异性荧光染料，从而深入了解药物在每种类器官模型中的作用机制。在单次实验中，我们可同时获取功能性数据和时间过程数据，且样品还可用于其他检测。该方法可用于评估对多种治疗方式的反应，不仅限于小分子抑制剂，还包括辐射敏感性。
我们还在持续创新，开发可用于动力学测量其他细胞表型（如衰老）的工具。首先，取一支含有患者来源类器官或类器官悬液（PDO）的试管，加入等体积的基底膜提取物（BME）。使用20微升移液器，将5微升液滴接种至预热的96孔板每个孔的中央。
接种完所有孔后，盖上培养板盖并轻轻倒置。将倒置的培养板置于37°C的组织培养箱中孵育20分钟，使胶滴凝固。然后将培养板翻转，使盖子朝上，再次进行孵育。
在将荧光染料和药物加入含 PDO 的孔板后，将孔板放入引文五中。启动 Gen5 软件，在任务管理器窗口中选择成像仪手动模式，然后点击立即捕获。在设置中，指定物镜：滤光片、微孔板格式和容器类型。
选择使用盖玻片和较慢的载物台移动速度，然后点击“确定”。接着选择感兴趣的孔。选择明场通道，点击自动曝光，并根据需要调整设置。接下来，设置Z轴层扫：展开成像模式选项卡，选择Z轴层扫，使用粗调箭头调节焦距，直至所有PDO均处于失焦状态。
将此点设为Z轴层扫的底部，然后反向重复操作以设定顶部。随后，通过打开“编辑成像步骤”来设置荧光通道。在“通道”下选择所需数量的通道，指定一个通道用于明场，其余每个荧光通道各分配一个额外通道。
单击“确定”关闭窗口。将下拉菜单更改为GFP。要为第一个荧光通道设置曝光，请单击“自动曝光”，然后在“曝光”选项卡下调整曝光设置以降低背景信号。要将曝光设置复制到图像模式选项卡，请单击“复制”图标，然后单击“编辑成像步骤”以打开新窗口。
在 GFP 通道中，单击曝光行中的剪贴板图标，将照明、积分时间与相机增益的设置添加到该通道。接着，单击相机图标，并在“添加处理步骤”下选择图像预处理。在明场选项卡中，取消勾选“应用图像预处理”选项。
对于每个荧光通道标签，确保勾选“应用图像预处理”，取消选中“使用与通道一相同的选项”，然后点击“确定”关闭窗口。现在，在“添加处理步骤”下点击“Z 投影”。
如有必要，调整切片范围，然后单击“确定”关闭窗口。要设置动力学成像的实验方案，请在工具栏中单击“图像集”，然后从下拉菜单中选择“从此图像集创建实验”。在其他类别下，单击“选项”，并勾选“非连续动力学过程”框。在“估计总时间”下，输入实验的运行时间。
单击“确定”关闭窗口。同时，设置板布局和温度梯度。通过单击各个窗口验证数据处理步骤。然后在工具栏中导航至“文件”，并单击“将方案另存为”。
选择保存位置。输入文件名，然后点击保存。要开始动力学成像，请将实验方案加载到 BioSpa 系统的按需排程软件中，并选择一个可用的时间段。
在步骤信息选项卡中，从菜单中选择用户。在方案槽位旁，单击选择并选择“添加新条目”。然后单击方案槽位旁的选择按钮。
单击“打开”以导航并导入方案至排程软件。输入该孔板所需的成像时间，然后单击“确定”关闭窗口。在“时间间隔”下，输入期望的成像频率。
选择计划板或容器。要启动板验证程序，请点击“是”以接受此计划。首先，使用Citation Five活细胞成像系统对荧光标记的PDO进行成像。
然后启动 Gen5 软件，进入实验界面，在任务管理器中点击“打开”。打开所需的实验，接着在工具栏中选择“板”（Plate），然后选择“查看”（View）。随后将数据下拉菜单切换至 Z 投影（Z projection）。
双击选定的孔，选择“分析”，点击“我要设置一个新的图像分析数据缩减步骤”，然后点击“确定”。在分析设置中，将类型设为“细胞分析”，检测通道设为“Z 投影转换的 TSF 明场”。点击“选项”以打开主掩模和计数页面。在阈值框中勾选“自动”，然后点击“确定”关闭弹出窗口。
在对象选择中，定义对象的最小和最大尺寸，以过滤掉细胞碎片或单个细胞，并根据需要选择其他特征。接下来，点击应用，被掩膜的对象将被高亮显示。要在细胞分析工具栏中设置亚群分析，请点击“计算指标”。
然后单击右下角的“选择或创建感兴趣的对象级别指标”。在可用的对象指标中，选择所需的指标（例如圆形度），然后单击插入。单击“确定”以确认。
接下来，在细胞分析工具栏中选择“亚群分析”，然后单击“添加”以创建新的亚群。为该亚群输入名称。在对象参数中，单击“添加条件”以添加选定的参数。
在编辑条件窗口中输入所需的参数，然后点击“确定”。在窗口底部的表格中选择所需的结果，点击“确定”，然后点击“应用”。在对象详细信息中，选择指定的亚群以查看掩膜效果。如果满意，在细胞分析窗口中点击“确定”，然后点击“添加步骤”以将分析应用于所有孔。
概述
本文讨论了使用患者来源的肿瘤类器官作为药物反应评估的模型系统。重点介绍了一种用于评估类器官表型的多重荧光活细胞成像方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 转化研究
背景
- 类器官源自真实患者的肿瘤样本。
- 可用于研究肿瘤对各种治疗方案的反应。
- 面临的挑战包括资源有限以及需要匹配的药物反应评估试剂盒。
- 下游分析（如转录组学分析）对于全面研究至关重要。
研究目的
- 利用类器官模型评估肿瘤对药物的反应。
- 确定与治疗反应相关的分子特征。
- 基于类器官的反应，优先筛选可用于临床试验的新疗法。
使用的方法
- 多重荧光活细胞成像。
- 类器官模型中治疗反应的遗传学监测。
- 同时评估不同类器官表型。
- 将药物反应数据与分子谱型分析相结合。
主要结果
- 成功应用多重成像技术评估类器官的响应。
- 鉴定与药物疗效相关的分子特征。
- 建立用于优先筛选临床试验疗法的框架。
- 展示了类器官模型在转化研究中的潜力。
结论
- 源自患者的类器官对于理解药物反应具有重要价值。
- 多重分析方法可增强对类器官表型的评估能力。
- 研究结果可为未来临床试验设计和治疗策略提供参考。
常见问题
行业重要性概述
在患者来源类器官（PDO）癌症模型中进行多重活细胞成像，可在高度模拟人类疾病的系统中实现对药物反应的高通量、定量评估。该方法利用有限的患者样本提供机制性和表型数据，有效弥补了传统细胞系与临床结果之间的转化鸿沟。将动力学成像与多重读出技术相结合，有助于在关键的发现阶段和临床前转折点提升预测可信度，并为项目组合的筛选决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关且源自患者的系统中验证治疗假设。
- 通过量化候选药物作用下细胞健康状况和细胞凋亡，支持作用机制层面的风险评估。
- 通过多重表型输出实现功能性的靶点验证。
- 提供数据以优先筛选出值得进一步开发的靶点和化合物。
筛选与检测方法开发
- 为3D类器官模型中的高通量药物筛选提供标准化、可重复的实验流程。
- 生成定量、多重化的输出结果，如PDO数量、面积和荧光强度。
- 支持对药物效应进行动力学监测，有助于稳健的检测方法开发与优化。
- 为下游分子和表型分析准备经过验证的系统。
转化与临床前研究
- 利用类器官（PDOs）作为转化模型，使临床前测试与人类疾病生物学保持一致。
- 通过实现多参数药物反应谱型分析，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供机制性洞察，为基于风险评估的推进决策提供依据。
- 扩展至更多表型读出指标，提升转化相关性。
流程与工作流整合
该多重成像平台整合了从早期发现到先导物鉴定及临床前验证的全过程，利用患者来源的类器官（PDOs）实现转化研究的连续性。
- 发现生物学：在与患者相关的模型中支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可用于化合物评价的即用型、可重复且定量的检测结果。
- 分析：提供高内涵测量数据和统计输出，用于比较分析。
- 转化研究：通过与疾病相关的数据，连接发现阶段与临床前阶段。
- 企业级复用：建立可扩展、可重复使用的平台，适用于多种治疗方式和表型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高药物反应评估的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：实现成像与分析的标准化和自动化，提升可重复性与可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的项目组合管理。
- 项目组合影响：支持基于转化证据的风险调整后候选药物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养、活细胞成像和图像分析方面的专业知识。
- 需要使用自动化成像平台及兼容的分析软件。
- 要求跨团队在实验建立和数据分析方面实现标准化。
- 必须针对不同来源的患者来源类器官（PDO）和表型终点调整实验方案。
- 样本限制和试剂兼容性可能影响通量及后续分析。
