Name: 多重活细胞成像在患者来源的癌症类器官模型中用于药物反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习多重荧光活细胞成像技术评估患者来源肿瘤类器官的药物反应。该方法可同步监测多种细胞表型，识别与疗效相关的分子特征，为临床试验筛选最佳治疗方案。

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我们感谢爱荷华大学组织采集核心实验室及Kristen Coleman博士提供患者肿瘤标本，同时感谢妇产科的Sofia Gabrilovich博士在PDO模型构建过程中提供的协助。我们还感谢Agilent公司（美国）的Valerie Salvatico博士对本文稿的审阅与关键性分析。本研究得到以下基金支持：NIH/NCI CA263783和DOD CDMRP CA220729P1（资助KWT）；癌症研究英国（Cancer Research UK）、前列腺癌英国（Prostate Cancer UK）、前列腺癌基金会（Prostate Cancer Foundation）以及医学研究理事会（Medical Research Council）（资助JSdB）。资助方未参与实验设计、数据分析或发表决定。

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

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<li>Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+DNA+topoisomerase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors.</a> Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).</li>
<li>Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+depletion+during+mitotic+arrest+induces+mitotic+slippage+and+APC%2FC%28Cdh1%29-dependent+cyclin+B1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation.</a> Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).</li>
<li>Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+image-based+phenotypic+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Organoids in image-based phenotypic chemical screens.</a> Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Ramm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live+and+fixed+cell+imaging+method+to+screen+matrigel-embedded+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Organoids%22%5BJournal%5D)">High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids.</a> Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Van Hemelryk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+analysis+and+high-content+live-cell+imaging+for+drug+testing+in+prostate+cancer+xenograft-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids.</a> Cells. 12 (10), 1377(2023).</li>
<li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+tyrosine+kinase+anti-angiogenic+cediranib+over+bevacizumab%3A+Cell+cycle+abrogation+and+synergy+with+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy.</a> Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).</li>
<li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+autophagy+overcomes+resistance+to+dual+histone+deacetylase+and+proteasome+inhibition+in+gynecologic+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer).</a> Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H3+as+a+Therapeutic+target+in+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer.</a> Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).</li>
<li>Gil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER3+is+an+actionable+target+in+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer.</a> Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).</li>
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KWT 是 Immortagen 公司的共同所有人。CJD 是安捷伦（Agilent）的员工。JSdB 曾在阿斯利康（Astra Zeneca）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、卫材（Eisai）、基因泰克/罗氏（Genentech/Roche）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、Harpoon、ImCheck Therapeutics、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（Merck Sharp &amp; Dohme）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、辉瑞（Pfizer）、凯杰（Qiagen）、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、泰尔茂（Terumo）和 Vertex Pharmaceuticals 的顾问委员会任职并收取费用；是英国癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）的员工，该机构已从阿斯利康（AZ）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、基因泰克（Genentech）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（MSD）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、辉瑞（Pfizer）和 Vertex 等公司获得其研究工作的资助或其他支持，且该机构在阿比特龙、DNA 修复缺陷型癌症中的 PARP 抑制以及 PI3K/AKT 信号通路抑制剂方面拥有商业利益（JSdB 本人无个人收入）；被列为强生公司提交的专利 8 822 438 的发明人之一，该专利涉及醋酸阿比特龙与皮质类固醇联合使用的方案，但本人无经济利益；曾担任多项由企业资助的临床试验的首席研究员（CI/PI）；同时是英国国家卫生研究所（National Institute for Health Research, NIHR）高级研究员。其他作者均无潜在利益冲突需披露。

由于能够反映细胞的响应和行为，PDO 培养物正成为一种日益流行的体外模型系统2。在 PDO 的生成、培养和扩增技术方面已取得显著进展，但针对治疗反应的分析方法却相对滞后。市面上可获得的三维细胞活力检测试剂盒均为裂解终点法检测，无法获取潜在的重要动力学响应数据，并且限制了后续采用其他方法进行的分析8。近期研究开始应用活细胞成像技术来评估 PDO 模型中的药物反应。本文中，我们提出一种利用多重荧光活细胞成像技术随时间评估 PDO 治疗反应的方法。通过荧光染料的多重标记，可同时定量多种不同的细胞反应。除了细胞凋亡和细胞毒性外，我们预计该方法在未来的研究中还可进一步拓展，用于检测 PDO 中的其他表型效应。
本方案旨在获取在96孔板中以穹顶状接种的PDO（类器官）的动力学明场和荧光图像。关键步骤包括：1）接种，2）加入染料和药物处理，3）设定成像参数，4）动力学图像采集完成后进行图像预处理与分析，以及5）将数据导出至其他统计软件进行进一步分析（图1）。完整的PDO以5 µL BME穹顶形式接种于96孔板中，BME与类器官培养基按预设比例混合（通常为1:1）。本方案采用UltiMatrix作为BME，因其批次间差异极小且成像光学性能优异。若使用其他BME（如Matrigel）培养的PDO，或对于成团且难以解离的模型，可能需要相应调整收获方法（参见示例 补充图4）。接下来，在接种时（第-1天），将荧光染料以2倍浓度加入100 µL类器官培养基中，随后过夜孵育，以确定基础细胞死亡水平。次日（第0天），将药物或其他处理物以2倍浓度加入100 µL类器官培养基中，再添加至各孔，最终体积为200 µL。200 µL的终体积有助于减少成像时的弯月面效应。动力学图像通过Cytation 5酶标仪与BioSpa台式培养箱联用系统获取。BioSpa培养箱可将实验板维持在恒定的37 °C温度和5% CO2环境中。BioSpa最多可容纳8块板，因此可同时开展8个实验。每块板的成像参数在Gen5软件中通过&#34;成像仪手动模式&#34;进行设置，并保存为一个协议。该协议随后载入调度软件（BioSpa OnDemand）。BioSpa OnDemand软件可自动执行动力学图像采集的工作流程，包括将板从BioSpa培养箱物理转移至Cytation 5，并指定Gen5中运行的数据采集协议。图像使用Gen5软件中的“细胞分析”功能进行分析（图2）。我们描述了具体分析荧光和明场图像Z投影的方法。有关分析单个Z平面和/或仅明场图像的具体方法，请参见 补充文件1。最后，用户可自定义导出特定数据特征，如PDO面积、数量和平均荧光强度，以Excel表格形式导出，用于后续药物效应的统计分析。
鉴于类器官（PDO）模型作为一种相对较新的用于研究药物效应的模型系统，针对其培养条件（特别是在基底膜提取物BME中生长）的实验方法仍在不断发展16。目前大多数评估PDO对药物处理反应的研究依赖于基于ATP的终点检测法，以细胞活力作为细胞健康状况的替代指标（CellTiter-Glo 3D）。该方法需要裂解细胞，因而无法进行后续的下游分析。其他替代性终点检测方法，如荧光染色、单时间点成像和形态学追踪，提供了可用于表征药物反应的多种指标，同时允许样本用于其他用途。例如，已建立的板内终点固定方案已被用于药物效应的高通量分析17,18。该方法的优势在于避免了常规免疫组织化学和免疫荧光成像所需的复杂处理步骤19，在样本量有限的情况下尤为适用，而这正是PDO模型的典型情况。该方法也适用于共聚焦显微镜的高分辨率成像。另一种无需细胞裂解的终点检测方法是使用碘化丙啶（propidium iodide）或吖啶橙（acridine orange）等试剂进行活细胞成像。我们对CellTiter-Glo 3D与AOPI（后者无需细胞裂解）在评估细胞活力与死亡方面的比较分析（图6C）突显了在PDO模型中使用活细胞成像染料的优势。该方法已被包括我们团队在内的多个研究组应用于实验结束时对表型效应的评估18,19,20。然而，无论是采用孔内固定还是终点活细胞成像方法获取动力学数据，均需要大量样本。通过无标记的形态学评估对PDO进行长期动态监测可在一定程度上克服这一限制，并可利用多种成像方式实现8,10,17,18，但形态学变化可能无法全面反映药物作用的全部谱系，例如细胞凋亡和细胞活力变化等。我们观察到不同PDO模型在药物刺激下形态学变化存在显著差异。例如，某些PDO在发生凋亡时面积增大，而其他模型则可能缩小。目前仅有少数研究将动力学形态学评估与固定或活细胞荧光终点检测方法联用18,20。本文所介绍的方法是首批在高通量系统中通过多重荧光染料同时评估多种细胞效应的方法之一。
活细胞动力学成像技术最重要的改进之一在于克服了终点检测方法所存在的关键局限性。例如，由于大多数自动细胞计数仪对小于60 µm的物体设有检测门限，因此在每个孔中接种相同数量的PDOs&#160;在技术上具有挑战性。活细胞成像技术可在0小时对每个孔中的PDOs数量或面积进行归一化处理，从而用于校正不同孔之间接种量的差异。目前PDOs的金标准终点检测方法是CellTiter-Glo 3D试剂盒，该方法通过检测ATP水平来间接反映细胞活力。我们在妇科肿瘤和前列腺癌PDOs的研究中已广泛使用该检测方法13,21,22,23,24。除了需要裂解细胞以检测ATP外，药物&#160;及其他治疗手段也可能改变ATP水平，从而可能导致对治疗反应的评估不准确。使用活细胞成像染料可量化更广泛的特异性细胞反应，例如细胞凋亡和细胞毒性。重要的是，这些试剂不会影响细胞活力或引起DNA损伤（与碘化丙啶不同），因此可实现对PDOs反应的多次连续评估。尽管我们尚未探索吖啶橙（AO）在动力学检测中的应用，但其作用机制并不排除未来将其用于此类检测的可能性。
肿瘤由多个具有不同基因组特征和形态的细胞群体组成。由于类器官（PDO）模型具有复杂的异质性，各个PDO&#160;的反应可能存在差异，追踪这些反应具有挑战性。我们的实验方案提供了一种以孔为单位评估多种PDO反应指标的方法。然而，活细胞成像仍需考虑若干技术因素。将类器官接种至96孔板所需的24孔板孔数，取决于每种PDO模型的密度和生长速率。由于细胞团块可能干扰图像分析（补充图4），PDO模型在接种前可能需要额外的处理步骤。如有必要，可在处理过程中使用非宽口的p200枪头剧烈吹打，以机械剪切类器官。接种前也可使用TrypLE Express进行酶消化，促进类器官解离并减少团块形成。根据我们的经验，TrypLE孵育时间因模型而异，差异较大。因此，应针对每种模型优化TrypLE的孵育条件，尤其是在研究人员希望获得单细胞悬液的情况下。对于特别敏感于酶消化的PDO模型，在开始处理前可能需要一定的恢复时间。
我们介绍了用于特异性活细胞成像试剂的方法。本方法广泛应用的一个限制因素是，目前可用于BME的试剂种类有限。对于尚未在PDO中优化使用的其他染料或试剂，可能需要进一步的故障排查，以确定最佳浓度并最小化溶剂效应。根据感兴趣的检测指标（例如细胞凋亡或细胞毒性），应使用已知可诱导细胞死亡的化合物（如staurosporine或daunorubicin13）进行处理，以优化试剂条件。另一个需要考虑的因素是染料整合入BME半球结构的最佳时间。在我们的实验中，我们在处理前进行过夜孵育，以确保染料完全被半球结构吸收，并评估细胞的基础健康状态。由于信号强度会随时间增强，研究人员应通过预实验确定实验结束时的理想曝光时间，以避免图像过度曝光。最后，所用试剂不应干扰细胞的正常生理过程。例如，能够插入DNA的染料不适用于动力学成像。然而，活细胞成像可用于终点检测中的数据归一化。事实上，我们提供了一种补充方法，利用AOPI定量细胞活力以及活细胞与死细胞的比例。在本实验中，每个孔的荧光信号均根据第0天（处理当天）活细胞成像所确定的PDO数量进行归一化（图6）。
本方法学论文的另一个局限性在于实验依赖手动移液操作，这可能导致技术重复之间的变异性增大。通过将自动化技术引入实验流程的其他步骤，例如使用自动化液体处理系统进行铺板和药物分配，可进一步提高数据的可重复性，已有其他研究对此进行了验证8,10。然而，这一改进需要额外的研究基础设施投入，并非所有研究人员均可获得。鉴于每个模型中PDO面积存在异质性，在自动化接种条件下，仍将结果标准化至0小时初始PDO数量或面积，仍是一种有效的处理方法。
与其它活细胞成像平台相比，Cytation 5 的一个关键优势在于能够自定义图像采集和分析功能。然而，Cytation 5/Gen5 软件的学习曲线较为陡峭，且默认用户已具备成像技术的基础知识。本方法学论文的目标之一是提供逐步操作指南，以降低其他研究人员在其类器官（PDO）研究项目中引入复杂活细胞成像技术的门槛。尽管本文所展示的具体分析步骤针对某一特定系统，用户仍可将多重成像原理应用于其他平台，但需注意后续分析可能需要借助第三方软件（如 NIH ImageJ）来完成。
分析指标的选择应基于实验目标和铺板条件。例如，如果实验使用荧光染料来定量细胞死亡，则荧光强度是一种有效的检测信号。最合适的荧光指标（总荧光强度与对象平均荧光强度）取决于铺板条件（补充图4）。如果类器官（PDO）分布均匀且形态更接近圆形、结构紧密，则可在定义的PDO亚群中测定荧光信号。在Gen5软件中，该功能为“细胞分析”（Cellular Analysis），输出结果为“对象平均荧光强度”（Object Mean Intensity）。然而，如果PDO模型呈团块状或结构松散，则建议在图像层面定量荧光信号；该功能位于“图像统计”（Image Statistics）下，输出结果为“总荧光强度”（Total Fluorescence Intensity）。尽管该方法适用于观察单个孔在实验过程中的变化，但该指标并非特异性针对目标对象，若PDO在实验期间移出指定区域，则可能导致结果出现偏差。在存在大量碎片或死亡的单个细胞的情况下，建议使用“细胞分析”功能，以排除与PDO无关的荧光信号。使用“细胞分析”与“图像统计”所得结果差异的示例见于补充图5。
为了确定图像统计功能的最佳阈值，可以使用线条工具。通过线条工具，用户能够确定图像内荧光强度的范围。我们将图像中峰值强度的25%值设定为下限阈值。要查看包含在指定阈值范围内的荧光区域，请勾选&#34;阈值异常值&#34;复选框。可能需要进一步微调下限阈值数值。
活细胞成像中的一个重大挑战是存储每次实验产生的大量数据。这一点在类器官（PDO）培养中尤为突出，因为通常需要使用Z轴层扫技术对多个焦平面进行成像，并生成Z投影图像。有多种方法可以解决这一问题。首先，应确保具备充足的存储容量。我们安装了三块固态硬盘，总容量达17 TB。其他选择包括将实验文件传输至外接硬盘或网络存储设备。不建议直接将文件写入基于云的存储系统。若需分析存储在外接驱动器上的数据，只需将实验文件和图像文件传输至配备Gen5软件的计算机即可（注意：大文件可能需要较长时间才能完成传输）。在分析前，必须将图像重新链接到实验文件。打开实验文件后，点击工具栏中的“Protocol”，选择“Protocol Options”，然后点击“Image Save Options”，再点击“Select new image folder”。找到图像文件所在文件夹后，点击“Select Folder”以完成重新链接。
根据实验目的，也可考虑在Gen5软件中使用像素合并（binning）功能。像素合并通过降低像素数量来减小文件大小，但会降低图像分辨率（参见步骤3.5.3.2）。因此，若需要高分辨率图像，则不建议使用该功能。使用像素合并功能时，需调整曝光参数。创建实验文件后，双击“图像”部分，然后点击显微镜图标以重新打开成像仪手动模式。可根据需要使用自动曝光功能或手动调节曝光参数。
综上所述，我们介绍了评估类器官（PDO）在细胞毒性药物作用下发生凋亡及细胞健康状况的方法。未来的研究需要进一步优化这些方法，并开发针对类器官动力学成像的其他分析策略，例如针对其他表型或非细胞毒性而是细胞抑制性药物效应的分析。目前面临的主要障碍是市场上缺乏与基底膜提取物（BME）兼容的染料和试剂。要充分挖掘此类模型的动力学活细胞成像潜力并获取最丰富的数据，仍需开展更多研究工作。

患者来源的肿瘤类器官（PDOs）正迅速成为研究癌症发生发展及治疗反应的有力模型系统。PDOs 是一种三维（3D）细胞培养系统，能够重现原发肿瘤复杂的基因组特征和组织结构1,2。与传统的永生化癌细胞系二维（2D）培养相比，PDOs 能够捕捉并维持肿瘤内异质性3,4，使其成为机制研究和转化研究的重要工具。尽管 PDOs 正日益成为广受欢迎的模型系统，但目前可用于 PDO 培养体系、且与之兼容的商业化试剂和细胞效应分析方法仍十分有限。
目前缺乏用于分析治疗反应细微变化的可靠方法，这阻碍了临床转化。在三维培养中，细胞健康检测试剂的金标准——CellTiter-Glo 3D，利用ATP水平作为细胞活力的判断依据5,6。尽管该试剂适用于终点检测，但仍存在若干局限性，其中最显著的是检测完成后样本无法用于其他用途。
活细胞成像是一种复杂的动力学显微技术，当与荧光试剂结合使用时，能够在PDO模型中定量检测多种细胞健康指标，包括细胞凋亡7,8,9和细胞毒性10。事实上，活细胞成像在二维平台化合物高通量筛选中已发挥关键作用11,12。诸如Incucyte等系统使该技术成本降低，从而让各类研究团队均能获得使用机会。然而，将这些系统应用于分析三维培养物仍处于起步阶段。
本文介绍了一种利用多重活细胞成像技术评估癌症类器官（PDO）模型中药物反应的方法（图1）。通过分析明场图像，可对PDO&#160;的大小和形态变化进行动力学监测。此外，还可使用荧光试剂同时随时间定量细胞过程，例如采用Annexin V Red Dye检测细胞凋亡，Cytotox Green Dye检测细胞毒性。所述方法已针对Cytation 5活细胞成像系统进行优化，但本方案亦可适配于其他不同的活细胞成像平台。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>1008113</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>554 NM LED 模块</td><td>Agilent</td><td>1225012</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning Costar</td><td>3596</td><td>预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Agilent</td><td>204626-100</td><td>预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>终浓度为 500 nM（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>类器官培养基组分</td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>终浓度为 1x（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>BioTek BioSpa 8 自动化培养箱</td><td>Agilent</td><td>BIOSPAG-SN</td><td>台式培养箱；BioSpa OnDemand 调度软件与 Gen5 通信，用于在 BioSpa 与 Cytation 5 之间转移培养板以进行成像（本方案使用版本 1.01.10）</td></tr><tr><td>BioTek Cytation 5 细胞成像多功能读板仪</td><td>Agilent</td><td>CYT5PW-SN</td><td>读板仪；本设备使用 Gen5 软件（本方案使用版本 3.12.08）</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BME001-10</td><td></td></tr><tr><td>盐酸柔红霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3035</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>终浓度为 10 &amp;micro;M（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>终浓度为 1x（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>人 EGF，无动物源重组蛋白</td><td>Gibco</td><td>AF-100-15-1MG</td><td>终浓度为 0.5 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>人 FGF-10 重组蛋白</td><td>Gibco</td><td>100-26-1MG</td><td>终浓度为 10 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>人 R-Spondin 1 重组蛋白</td><td>Gibco</td><td>120-38-5UG</td><td>终浓度为 250 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>氢化可的松储备液</td><td>StemCell Technologies</td><td>7926</td><td>终浓度为 500 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>成像滤光模块 - GFP</td><td>Agilent</td><td>1225101</td><td></td></tr><tr><td>成像滤光模块 - TRITC</td><td>Agilent</td><td>1225125</td><td></td></tr><tr><td>成像 LED GFP/CFP</td><td>Agilent</td><td>1225001</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Annexin V 红色染料</td><td>Sartorius</td><td>4641</td><td>用类器官培养基重悬</td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox 绿色染料</td><td>Sartorius</td><td>4633</td><td>DMSO 溶液</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td>终浓度为 1.25 mM（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 染色液</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13366169</td><td>按 1:50 体积添加</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>6057-NG</td><td>终浓度为 100 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>终浓度为 10 单位/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>终浓度为 100 &amp;micro;g/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>重组人 Heregulin&amp;beta;-1</td><td>Pepro Tech</td><td>100-03</td><td>终浓度为 37.5 ng/mL（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>链霉菌来源的星形孢菌素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6942</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632，CAS 331752-47-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000</td><td>终浓度为 5 &amp;micro;M（类器官培养基组分）</td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>终浓度为 100 nM（类器官培养基组分）</td></tr></tbody></table>

用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

癌症患者来源类器官（PDO）模型是一种多功能研究体系，相较于癌细胞系，能更真实地模拟人类疾病。PDO模型可通过将患者肿瘤细胞在细胞外基底膜提取物（BME）中培养，并以三维半球状形式接种来建立。然而，市面上许多为单层培养中表型检测而优化的试剂通常与BME不兼容。本文介绍一种利用自动化活细胞成像系统接种PDO模型并评估药物效应的方法。此外，我们应用了适用于动力学检测的荧光染料，以同时定量细胞健康状态和细胞凋亡。图像采集可自定义为在数天内按固定时间间隔进行。用户可分析单个Z平面图像，或对多个焦平面连续图像生成的Z投影进行分析。通过掩膜（masking）技术，可计算特定感兴趣参数，如PDO数量、面积和荧光强度。我们提供了概念验证数据，展示了细胞毒性药物对细胞健康、凋亡及存活率的影响。该自动化动力学成像平台可进一步拓展至其他表型读出指标，以深入理解各类治疗手段在癌症PDO模型中的作用效果。

患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。

源自患者的肿瘤类器官（PDO）模型是一种多功能研究体系，相较于癌细胞系，能更真实地模拟人类疾病。

我们应用源自患者肿瘤标本的类器官模型，来研究肿瘤对药物的反应。我们还可以确定与治疗反应相关的分子特征。这些结果随后被用于优先筛选最有前景的新疗法，以推动未来进入临床试验。使用患者来源类器官模型的主要挑战之一在于其资源有限。此外，目前市面上可用于评估类器官模型药物反应的现成试剂盒极少，且缺乏能够以保留样本完整性、支持后续其他分析（如转录组学分析）的形式进行检测的方法。我们开发了一种多重方法，用于在类器官模型中对治疗反应进行基因水平的监测。我们使用针对不同细胞过程的特异性荧光染料，从而深入了解药物在每种类器官模型中的作用机制。在单次实验中，我们可同时获取功能性数据和时间过程数据，且样品还可用于其他检测。该方法可用于评估对多种治疗方式的反应，不仅限于小分子抑制剂，还包括辐射敏感性。我们还在持续创新，开发可用于动力学测量其他细胞表型（如衰老）的工具。首先，取一支含有患者来源类器官或类器官悬液（PDO）的试管，加入等体积的基底膜提取物（BME）。使用20微升移液器，将5微升液滴接种至预热的96孔板每个孔的中央。接种完所有孔后，盖上培养板盖并轻轻倒置。将倒置的培养板置于37°C的组织培养箱中孵育20分钟，使胶滴凝固。然后将培养板翻转，使盖子朝上，再次进行孵育。在将荧光染料和药物加入含 PDO 的孔板后，将孔板放入引文五中。启动 Gen5 软件，在任务管理器窗口中选择成像仪手动模式，然后点击立即捕获。在设置中，指定物镜：滤光片、微孔板格式和容器类型。选择使用盖玻片和较慢的载物台移动速度，然后点击“确定”。接着选择感兴趣的孔。选择明场通道，点击自动曝光，并根据需要调整设置。接下来，设置Z轴层扫：展开成像模式选项卡，选择Z轴层扫，使用粗调箭头调节焦距，直至所有PDO均处于失焦状态。将此点设为Z轴层扫的底部，然后反向重复操作以设定顶部。随后，通过打开“编辑成像步骤”来设置荧光通道。在“通道”下选择所需数量的通道，指定一个通道用于明场，其余每个荧光通道各分配一个额外通道。单击“确定”关闭窗口。将下拉菜单更改为GFP。要为第一个荧光通道设置曝光，请单击“自动曝光”，然后在“曝光”选项卡下调整曝光设置以降低背景信号。要将曝光设置复制到图像模式选项卡，请单击“复制”图标，然后单击“编辑成像步骤”以打开新窗口。在 GFP 通道中，单击曝光行中的剪贴板图标，将照明、积分时间与相机增益的设置添加到该通道。接着，单击相机图标，并在“添加处理步骤”下选择图像预处理。在明场选项卡中，取消勾选“应用图像预处理”选项。对于每个荧光通道标签，确保勾选“应用图像预处理”，取消选中“使用与通道一相同的选项”，然后点击“确定”关闭窗口。现在，在“添加处理步骤”下点击“Z 投影”。如有必要，调整切片范围，然后单击“确定”关闭窗口。要设置动力学成像的实验方案，请在工具栏中单击“图像集”，然后从下拉菜单中选择“从此图像集创建实验”。在其他类别下，单击“选项”，并勾选“非连续动力学过程”框。在“估计总时间”下，输入实验的运行时间。单击“确定”关闭窗口。同时，设置板布局和温度梯度。通过单击各个窗口验证数据处理步骤。然后在工具栏中导航至“文件”，并单击“将方案另存为”。选择保存位置。输入文件名，然后点击保存。要开始动力学成像，请将实验方案加载到 BioSpa 系统的按需排程软件中，并选择一个可用的时间段。在步骤信息选项卡中，从菜单中选择用户。在方案槽位旁，单击选择并选择“添加新条目”。然后单击方案槽位旁的选择按钮。单击“打开”以导航并导入方案至排程软件。输入该孔板所需的成像时间，然后单击“确定”关闭窗口。在“时间间隔”下，输入期望的成像频率。选择计划板或容器。要启动板验证程序，请点击“是”以接受此计划。首先，使用Citation Five活细胞成像系统对荧光标记的PDO进行成像。然后启动 Gen5 软件，进入实验界面，在任务管理器中点击“打开”。打开所需的实验，接着在工具栏中选择“板”（Plate），然后选择“查看”（View）。随后将数据下拉菜单切换至 Z 投影（Z projection）。双击选定的孔，选择“分析”，点击“我要设置一个新的图像分析数据缩减步骤”，然后点击“确定”。在分析设置中，将类型设为“细胞分析”，检测通道设为“Z 投影转换的 TSF 明场”。点击“选项”以打开主掩模和计数页面。在阈值框中勾选“自动”，然后点击“确定”关闭弹出窗口。在对象选择中，定义对象的最小和最大尺寸，以过滤掉细胞碎片或单个细胞，并根据需要选择其他特征。接下来，点击应用，被掩膜的对象将被高亮显示。要在细胞分析工具栏中设置亚群分析，请点击“计算指标”。然后单击右下角的“选择或创建感兴趣的对象级别指标”。在可用的对象指标中，选择所需的指标（例如圆形度），然后单击插入。单击“确定”以确认。接下来，在细胞分析工具栏中选择“亚群分析”，然后单击“添加”以创建新的亚群。为该亚群输入名称。在对象参数中，单击“添加条件”以添加选定的参数。在编辑条件窗口中输入所需的参数，然后点击“确定”。在窗口底部的表格中选择所需的结果，点击“确定”，然后点击“应用”。在对象详细信息中，选择指定的亚群以查看掩膜效果。如果满意，在细胞分析窗口中点击“确定”，然后点击“添加步骤”以将分析应用于所有孔。

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癌症研究

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