磁珠分选法从鼠类分离血管壁定居的CD34⁺干细胞

血管壁定居的CD34阳性干细胞在调控损伤后血管重塑中的关键作用正日益受到重视。建立一种稳定且高效的功能性CD34阳性细胞鉴定方法，对于进一步研究其在多种生理和病理条件下的参与机制至关重要。该技术结合磁性分选与流式细胞术，用于纯化原代培养的定居型CD34阳性干细胞。

然后可通过免疫荧光染色和钙成像对纯化的细胞进行功能鉴定。由于血管壁中驻留的CD34预测性干细胞具有表型和功能上的异质性，因此鉴定出与之相关的特定肌源性CD34活性细胞亚型将较为缓慢。本文提出了一种改进的方法，用于培养鉴定及功能评估血管壁驻留的CD34阳性干细胞。

这种新方法包括磁性分选光细胞计量免疫荧光银染和定制测量。通过采用这些技术，我们的研究为今后全面探究静息状态CD34阳性干细胞在生理和病理条件下的功能调控奠定了基础。首先，将麻醉后的小鼠置于手术台上。

使用无菌的眼科剪和镊子，切开胸腔和腹腔。这将暴露心脏和肠道。仔细分别解剖肠系膜动脉和主动脉。

用 PBS 冲洗肠系膜动脉，并将其转移至含有 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液的 10 厘米培养皿中。同样，冲洗主动脉并将其转移至另一含有相同溶液的培养皿中。迅速去除主动脉和肠系膜动脉周围的所有脂肪组织。

清洗两次后，将动脉置于组织培养罩内的体视显微镜下。沿动脉方向小心地做一纵向切口。然后用精细镊子剥离主动脉和肠系膜动脉第一分支的外层。

将外层组织置于含有 0.1 至 0.2 毫升培养基的 3.5 厘米培养皿中，并切成约 1 立方毫米的小块。将组织块转移至明胶包被的 T25 培养瓶中。将培养瓶垂直放入 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的培养箱中。

三小时后，向培养瓶中加入 5 毫升 DMEM 高糖培养基，以浸没所有组织块。首先，分离并培养来自麻醉小鼠的主动脉外层及肠系膜动脉第一分支。当细胞融合度达到 80% 时，在室温下以 300 ×g 离心 5 分钟，对解离的细胞悬液进行处理。

完全弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每1000万个总细胞98微升的分选缓冲液中。加入CD34抗体后，在4摄氏度避光孵育30分钟。洗涤细胞时，向细胞中加入2毫升分选缓冲液，然后在300 ×g离心10分钟。

弃去上清液后，将细胞重悬于 80 微升分选缓冲液中。然后向细胞悬液中加入 20 微升抗 FITC MicroBeads。按照先前演示的方法洗涤并离心细胞后，将细胞重悬于 1 毫升分选缓冲液中。

接下来，将磁性分离柱置于分离器的磁场中，并在柱下方放置一个收集管。用 500 µL 缓冲液冲洗后，将细胞悬液加载到柱中，并在收集管中收集流出的未标记细胞。从分离器上取下分离柱，将其放置在一个新的 15 mL 离心管上。

向柱中加入500微升分选缓冲液，并推动柱塞以冲洗出磁标记的细胞。为表征从小鼠主动脉和肠系膜动脉分离的CD34阳性干细胞，进行组织块培养，并通过磁性分离获取细胞。为检测分化后内皮细胞和成纤维细胞标志物的表达，使用488纳米激光激发，在40倍放大倍数下观察细胞。

消化细胞后，通过离心收集细胞沉淀，并重悬于100 µL分选缓冲液中。随后加入抗小鼠CD16、CD32单克隆抗体，在4°C孵育5分钟。然后每种所需的单克隆抗体各加入2 µL，用于免疫荧光染色，并再次于4°C孵育10分钟。

用一毫升缓冲液将细胞洗涤两次。按照演示方法离心细胞后，弃去上清液，并将细胞重悬于300微升缓冲液中。将细胞转移至流式管中，并置于冰盒中。

通过流式细胞术检测分化细胞的比例。流式细胞术分析证实，分离得到的CD34阳性血管壁干细胞具有高纯度。细胞免疫荧光染色显示，分离的CD34阳性干细胞主要表达干细胞标志物CD34、c-kit和Flk-1。

流式细胞术还证实，分离得到的 CD34 阳性干细胞在体外具有分化为内皮细胞以及成纤维细胞的能力。首先，从小鼠模型中分离出血管壁定居的 CD34 阳性干细胞。通过磁性激活细胞分选法获得纯化的细胞，并对其进行表征。

为了检测钙信号，取预先接种有细胞的盖玻片，用 PBS 洗涤一次。然后将细胞与 Fura-2 AM 和 Tyrode 溶液在避光条件下孵育 30 分钟。为去除染料，再将细胞用 Tyrode 溶液孵育 10 分钟。

然后将培养室安装在倒置荧光显微镜的载物台上。打开主窗口，进入图像采集设置对话框的相机页面。按下实时按钮以显示实时图像。

为获取图像，使用不同颜色的手绘线条圈选出细胞，并预先定义感兴趣区域。荧光显微镜结果显示，ATP处理可提高分离的血管壁CD34阳性干细胞中的细胞内钙水平。