Name: 自闭症谱系障碍果 蝇 模型的行为评估范式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解利用黑腹果蝇模型评估自闭症谱系障碍的五种行为范式，包括攻击性、社交距离、求偶、理毛和习惯化实验。这些方法为研究ASD相关基因与行为缺陷的关系提供了标准化框架。

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我们非常感谢 Mani Ramaswami（NCBS，班加罗尔）和 Baskar Bakthavachalu（IIT Mandi）在适应性与气味选择实验装置方面的帮助，感谢 Pavan Agrawal（MAHE）对攻击行为实验提出的宝贵建议，感谢 Amitava Majumdar（NCCS，浦那）分享其求偶行为实验装置的原型， Fmr1 突变果蝇品系，以及感谢浦那国家细胞科学中心（NCCS）的 Gaurav Das 分享 MB247-GAL4 品系。我们感谢布卢明顿果蝇杂交中心（Bloomington） 果蝇 美国印第安纳大学布卢明顿分校果蝇资源中心（BDSC，美国印第安纳州）、日本京都大学遗传学研究所（NIG，日本京都）、印度瓦拉纳西贝拿勒斯印度教大学（BHU，印度瓦拉纳西）和印度班加罗尔国家生物科学中心（NCBS，印度班加罗尔）提供 果蝇 线条。实验室工作由AD获得的SERB-DST资助（ECR/2017/002963）、授予AD的DBT拉马林加斯瓦米研究员项目（BT/RLF/Re-entry/11/2016）以及印度理工学院克勒格布尔分校的机构支持提供经费。SD和SM获得CSIR高级研究奖学金资助的博士生奖学金；PM获得印度MHRD提供的博士生奖学金。

有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 攻击行为实验
<ol>
	<li>准备攻击行为实验场地
	<ol>
		<li>取一个标准的24孔板（图1A），将每个孔用作果蝇攻击行为的单个“场地”（图1B）。在每个孔中填充一半的常规果蝇食物，并过夜晾干。 
		注意：可选择在场地中加入攻击行为的焦点，例如一小点酵母糊或一只去头雌蝇，以确保雄蝇表现出攻击行为。</li>
		<li>取一块透明塑料或丙烯酸板，大小足以覆盖三到四个孔的表面。在板上打一个直径约2.5 mm的小孔，用于通过该孔将单个果蝇插入孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备果蝇吸移器
	<ol>
		<li>取一段30-50 cm长的橡胶或硅胶管（图1C1）。</li>
		<li>取一个200 µL（或1,000 µL）的移液枪头，从细端切下约1 cm。将切下的末端插入橡胶管的一端；此端为“口端”，用于口吸式吸取。</li>
		<li>取另一个移液枪头，将其细端剪开，形成一个足够让果蝇进入的开口。将该枪头的基部插入管子的尾端；此端为吸移器的“果蝇端”，果蝇将从此处被吸入（图1C2）。</li>
		<li>在管子的“果蝇端”——即管与枪头连接处——放置一小块网状布或薄层棉花。确保被吸入移液枪头的果蝇停留在网状物前方的枪头内，无法逃脱。</li>
		<li>使用Parafilm密封管与移液枪头之间的连接处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备单只饲养管和群体饲养瓶
	<ol>
		<li>单只饲养管的制备
		<ol>
			<li>向一个2 mL微量离心管中加入约500 µL新鲜配制的果蝇食物（图1D）。使用小型离心机将食物沉降至管底。</li>
			<li>打开管盖，于室温下静置过夜，使食物凝固。用细布覆盖管口，防止外来果蝇进入。</li>
			<li>用针在微量离心管盖上打孔以利于空气流通，待食物凝固后盖上管盖。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>群体饲养瓶的制备
		<ol>
			<li>取常规果蝇饲养瓶，加入极少量新鲜配制的食物（图1D）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验前果蝇的准备
	<ol>
		<li>将所需基因型的果蝇品系饲养在含有标准果蝇食物的常规玻璃或塑料瓶中，置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱内。</li>
		<li>收集新羽化（0至24小时）的所需基因型和性别的果蝇，在立体显微镜下使用二氧化碳麻醉进行性别分离。</li>
		<li>将一半雄蝇单独放入“单只饲养管”中。将另一半雄蝇与雌蝇以每组10只的方式共同饲养于常规“群体饲养瓶”中，以建立社交环境。将所有管和瓶在25 °C下储存5天。 
		注意：行为实验室内应维持24–25 °C的温度和约50%的湿度。所用果蝇品系包括：w1118 和 FMR 反式杂合突变果蝇（Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）57。Fmr1 果蝇若被隔离饲养5天，其对另一只雄蝇的攻击行为显著减少（图1E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行攻击行为实验
	<ol>
		<li>在ZT0–ZT3时间段内进行攻击行为实验，因为果蝇在此时间段内活动最为活跃。 
		注意：ZT = 标准12小时光照/黑暗循环中的授时时间；ZT0 = 光照开启，即光相开始；ZT3 = 光相开始后3小时，依此类推；ZT12 = 光照关闭。</li>
		<li>通过口吸法将两只来自单只或群体饲养环境的雄蝇经管盖上的小孔转移至攻击行为场地中；立即移开小孔位置，确保果蝇无法逃逸。</li>
		<li>让果蝇在场地内适应1–2分钟。启动计时器，持续20分钟。使用支架将摄像机或手机精确垂直置于场地正上方，全程录像20分钟。确保视频中可清晰观察到各类攻击行为。 
		注意：确保场地照明充足，并避免盖子反光或眩光直接投射到摄像机镜头上。</li>
		<li>对每种基因型和每种饲养条件，重复实验15–20对果蝇。 
		&#8203;注意：可通过对对照组和实验组果蝇以及多种基因型的视频文件进行双盲处理，以消除无意识偏倚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>攻击行为实验数据分析
	<ol>
		<li>将视频文件传输至配备足够大屏幕的计算机，以便清晰观察攻击行为。</li>
		<li>播放视频，统计20分钟内发生的攻击行为总次数58,59。</li>
		<li>在电子表格中整理并汇总每种基因型和每种饲养模式的数据，使用任意统计软件进行数据分析。进行双尾t-检验，并以箱线图形式呈现数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 社会空间实验
注意：此处描述的实验方案、实验区域和分析方法此前已有报道60,61。
<ol>
	<li>准备社交距离检测（SSA）实验场地
	<ol>
		<li>将两个三角形丙烯酸垫片（高度 = 8.9 cm，底边 = 6.7 cm，厚度 = 0.3 cm）平放在一块矩形玻璃板（13.5 cm × 10.4 cm，厚度 0.3 cm）上，使丙烯酸垫片的直角与玻璃板的角对齐（图 2A).</li>
		<li>将两个矩形丙烯酸垫片（6.7 厘米 × 1.5 厘米，厚度 = 0.3 厘米）平放在玻璃板上，使其与两个三角形垫片的底边对齐。完成此布局后，确认四个丙烯酸垫片围成一个三角形区域（约 2.16 平方厘米）61)&#160;在未被垫片覆盖的矩形玻璃板上（图 2A，B）。放置一把带有刻度的尺子贴纸（图 2C) 在其中一个三角形垫片上，并确保从顶部可见。</li>
		<li>将第二块矩形玻璃板（13.5 cm × 10.4 cm，厚度 0.3 cm）放置在亚克力垫片上方，使其与底部玻璃板对齐；亚克力垫片将被夹在两块玻璃板之间，使两块玻璃板中间形成一个三角形空间。使用四个小型长尾夹固定玻璃板和垫片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SSA 实验前的果蝇准备
	<ol>
		<li>收集所需基因型且新羽化（0至24小时）的果蝇，在冰上麻醉条件下使用体视显微镜按性别分离。 
		注意：将冷麻醉装置（可使用培养皿）置于 -20 ℃ 预冷 &#176;C 培养箱。将果蝇放入空的培养瓶中，将培养瓶浸入盛有冰块的冰桶中，直至果蝇不再活动，然后将其转移至冰冷的培养皿上，开始分选。</li>
		<li>将雄性和雌性果蝇分别置于培养管中的食物上，在25 ℃条件下单独饲养24小时。 &#730;C 恒温培养箱，设置12小时光照/12小时黑暗循环。 
		注意：本实验所使用的果蝇品系为 w1118 以及 FMR 反式杂合突变果蝇（Fmr1&#916;50M/Fmr1&#916;113M).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行SSA实验
	<ol>
		<li>保持与攻击行为实验相同的实验条件（温度：24-25&#730;C，湿度约50%）的条件下，在ZT0-ZT3时间窗口内进行实验。</li>
		<li>移除右下角的活页夹，并将该矩形垫片稍向外移动，使两个矩形垫片之间形成一个约0.5 cm的间隙。</li>
		<li>将前一天收集的果蝇从培养管转移至空管中。通过矩形垫片之间形成的空隙，用轻柔的抽吸法将果蝇转移至社交空间实验区（三角形区域）。立即滑动矩形垫片并用文件夹夹子将其固定回原位，封闭空隙，确保果蝇无法逃逸。</li>
		<li>将培养室保持直立，轻轻在软垫上敲击3次，以确保实验开始时所有果蝇均位于培养室底部。</li>
		<li>将SSA实验装置垂直夹紧并启动计时器。待果蝇在实验区域内就位且活动减少后，于20分钟时拍摄实验区域的清晰照片。拍摄时应避免反光和光照不均。</li>
		<li>对同一群体的果蝇重复实验3次，通过敲击果蝇并重复步骤2.3.5至2.3.7（内部重复）。使用相同基因型/条件的不同果蝇群体重复实验3次（独立重复）。 
		&#8203;注意：将检测室冷冻以清除其中的果蝇。每完成一组果蝇的实验后，用乙醇擦拭玻璃和塑料表面，以去除所有气味。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析社交距离实验数据
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中分析图像62 软件并列出蝇类之间的最近邻距离，方法如前所述61.</li>
		<li>使用统计软件进行统计分析并绘制图表。 
		注意：此处描述的社会空间分析（SSA）实验所使用的果蝇品系为 w1118 和 Fmr1 反式杂合突变果蝇（Fmr1&#916;50M/Fmr1&#916;113M)57. Fmr1 果蝇与最近邻个体之间的距离显著增加（图 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 求偶行为实验
<ol>
	<li>交配室的组装
	<ol>
		<li>按照图3B所示顺序，将交配室的四个部件组装在一起（图3A）。位于盖子和底座之间的中央圆盘上的每个穿孔即构成一个“交配室”（图3C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取已交配雌蝇
	<ol>
		<li>准备并维持多个装有约60–100只雄性和雌性果蝇的CS（Canton S，野生型）培养瓶，每瓶加入适量培养基。</li>
		<li>当成虫羽化后，弃去所有成虫，并将新羽化的果蝇每隔2–3小时转移至添加少量酵母糊的新培养管中。 
		&#8203;注意：避免培养管内果蝇过于拥挤。注意不要将老果蝇、幼虫或蛹转移至交配管中。</li>
		<li>将这些“交配管”在培养箱中孵育4天，以确保所有雌蝇均已交配。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雄蝇单只饲养管的制备
	<ol>
		<li>向每支2 mL离心管中加入约500 µL果蝇培养基，使用小型离心机将培养基甩至管底。</li>
		<li>静置过夜使培养基完全凝固，剪去离心管盖，用封口膜覆盖管口，并用针头在封口膜上刺若干小孔以保证通气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集与分离处女雄蝇
	<ol>
		<li>在不同的培养管中分别设置杂交组合，每管放入10–15只雄蝇和20–30只所需基因型的处女雌蝇。</li>
		<li>从子代中收集所需基因型的处女雄蝇，使用吸虫器将其单独转移至“单只饲养管”中。每隔5–6小时收集一次新羽化的雄蝇（每种基因型收集40–50只），并分别隔离于各自的单只饲养管中。</li>
		<li>用封口膜重新密封管盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行交配行为实验
	<ol>
		<li>在待测雄蝇隔离饲养5天后，于ZT0–ZT3时间段内进行交配行为实验。</li>
		<li>提前设置好视频记录设备，确保对准实验操作区域。</li>
		<li>使用吸虫器从交配管中取出一只已交配雌蝇（6–10日龄），放入交配室中。</li>
		<li>用吸虫器轻轻将一只雄蝇（对照组/实验组）从单只饲养管经转移孔移入含有单只已交配雌蝇的交配室中，迅速旋转盖子以关闭腔室。</li>
		<li>连续录像记录果蝇行为15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频数据分析与统计
	<ol>
		<li>将视频文件导入计算机，通过手动回放视频，记录雄蝇在15分钟内进行交配行为的总时长。</li>
		<li>计算每只雄蝇的交配指数（CI），即雄蝇在15分钟内与雌蝇交配行为所用时间的比例（或百分比）。</li>
		<li>统计15分钟内交配尝试的总次数。</li>
		<li>记录雄蝇首次尝试交配前的等待时间，作为交配潜伏期（CL）。 
		注意：建议每种条件/基因型分析40–60只雄蝇，以确保统计效力，并验证CI结果的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 梳理行为检测
<ol>
	<li>梳理行为检测装置
	<ol>
		<li>使用体积约为 0.4 cm3 的小型圆形腔室作为记录梳理行为的实验区域。 
		注：第 3 节中描述的同一求偶实验装置也可用于梳理行为检测。</li>
		<li>由于梳理行为涉及对腿等精细器官运动的记录，应采用高分辨率或高对比度的视频记录。按照本方案，使用覆盖漫射玻璃的 LED 面板作为尺寸为 20 cm × 20 cm 的均匀照明表面。将求偶实验腔室置于该面板上方，以确保光线从底部穿过腔室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验前果蝇的准备
	<ol>
		<li>将实验基因型的果蝇在 25 °C 条件下，以 12 小时光照/12 小时黑暗的周期饲养于培养瓶中。</li>
		<li>收集新羽化（0 至 24 小时）的目标基因型和性别的果蝇，在立体显微镜下使用低温麻醉进行性别分离，方法同社交距离实验所述。</li>
		<li>将雄性果蝇单独饲养于单只饲养管中（如攻击行为实验所用），静置 24 小时。 
		注：本实验所用果蝇品系为：W1118 和 FMR 反式杂合突变果蝇（Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行梳理行为检测
	<ol>
		<li>保持温度为 24–25 °C，湿度约为 50%；在 ZT0–ZT3 时间窗口内进行实验16。</li>
		<li>使用吸虫器将一只单独饲养的雄性果蝇从单只饲养管转移至梳理行为检测装置中。立即移开盖子上的孔洞，防止果蝇逃逸。</li>
		<li>将梳理行为检测装置放置在漫射 LED 面板上，让果蝇在装置内适应 1 分钟。将摄像机垂直置于装置正上方的支架上，连续录像 10 分钟。确保视频中可清晰观察并量化各类梳理行为片段。 
		注：梳理行为包括使用前足（第一对：T1）、中足（第二对：T2）或后足（第三对：T3）摩擦头部、眼睛、触角、喙、胸部、腹部、生殖器和翅膀。本研究中所考虑的梳理行为参数如 Andrew 等人41 所述，并在 图 4 中展示。</li>
		<li>对每种基因型重复上述实验。</li>
		<li>梳理行为数据的分析
		<ol>
			<li>分析视频并计算以下四个参数：梳理指数（用于梳理的时间百分比）；梳理潜伏期（首次开始梳理行为的时间）；梳理行为片段次数；以及 平均梳理行为片段持续时间（总片段持续时间 / 片段次数）。</li>
			<li>当果蝇停止表现出任何梳理动作并保持静止达 2 秒，或停止梳理并行走至少 4 步时，记为一个梳理行为片段结束。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 嗅觉习惯化实验
注意：如图5所示，最终组装需在Y迷宫实验当天进行54,56。
<ol>
	<li>准备用于习惯化实验的果蝇
	<ol>
		<li>将所有实验所需基因型的果蝇在25 oC、70%湿度、标准12小时光照：12小时黑暗循环（LD）的培养箱中培养。</li>
		<li>收集0–12小时龄的新生羽化果蝇，并将约30–40只果蝇转移至装有新鲜培养基、用紧密棉塞封口的培养瓶中。</li>
		<li>为每个培养瓶分配编码，使实验操作者对正在测试的基因型保持盲态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导嗅觉习惯化
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中加入1 mL用液体石蜡（轻质）稀释的偏好性气味剂。作为对照，仅在1.5 mL微量离心管中加入1 mL轻质液体石蜡。将管内内容物涡旋振荡10分钟以确保均匀混合，然后用均匀打孔的塑料薄膜封口。 
		注：在视频中将使用20%丁酸乙酯。</li>
		<li>使用金属丝将含有稀释气味剂或仅含稀释液的试管分别悬挂在装有果蝇的培养瓶内。</li>
		<li>用棉塞将培养瓶密封后，再用牛皮纸包裹，以防止气味蒸气扩散。将对照瓶和含气味剂的培养瓶分别标记为“未处理组”（naïve）和“气味暴露组”（习惯化组）。将这些诱导培养瓶在上述条件下置于培养箱中维持3天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇与Y型迷宫装置的准备
	<ol>
		<li>将果蝇从诱导培养瓶转移至仅含有浸水滤纸的小瓶中。</li>
		<li>在室温下饥饿处理约16–18小时，以增强其行为动机。</li>
		<li>确保Y型迷宫装置各部件清洁且无气味残留；将四个部分垂直组装。将攀爬室连接至Y型迷宫，再将Y型迷宫连接至适配器顶部。将Y型迷宫底部牢固连接至作为底部中央主干的入口小瓶，如图5所示。</li>
		<li>使用无气味硅胶管将每个攀爬室的锥形末端连接至含有气味剂（用蒸馏水稀释至10-3）的试剂瓶。</li>
		<li>借助真空泵，以相等流速（约120 mL/min）将气味剂从气瓶泵入Y型迷宫的两个臂，并持续通气15分钟以确保充分饱和，保证实验一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行经典的Y型迷宫实验
	<ol>
		<li>轻柔地将每小瓶中的饥饿果蝇引入Y型迷宫装置的入口小瓶中。</li>
		<li>让果蝇短暂适应环境；连接入口小瓶与Y型迷宫适配器以开始测试；允许果蝇攀爬Y型迷宫两臂并进入两个收集室。每次测试持续时间为1分钟。</li>
		<li>测试结束后，轻敲将果蝇震回入口小瓶底部，并交换Y型迷宫两臂的位置，以消除侧向偏好偏差。对同一组果蝇进行四次重复测量。</li>
		<li>记录在规定时间内攀爬Y型迷宫两个臂的果蝇数量。</li>
		<li>至少重复8批实验，以获得具有代表性的数据集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集数据的分析与解释
	<ol>
		<li>通过计算表现指数（Performance Index, PI）来量化实验结果，PI可表示为选择空气臂（A）的果蝇数与选择气味臂（O）的果蝇数之差，除以参与实验的果蝇总数所得的分数。</li>
		<li>使用统计学方法（非配对Student's t-检验）检验未处理组与气味暴露组果蝇的PI差异是否具有显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Drosophila Models for Genetic and Behavioral Traits of Autism Spectrum Disorder

作者声明无利益冲突。

Drosophila 因其基因序列在果蝇与人类疾病基因之间具有高度保守性，被广泛用作研究人类神经系统疾病的理想模式生物9。大量可靠的动物行为学范式使其成为研究模拟人类疾病表型突变体的有力模型。由于已有数百个基因被发现与自闭症谱系障碍（ASD）相关，目前在任何模式生物中均不存在通用的ASD模型。因此，研究人员在研究每一个突变体时，必须首先在果蝇中建立其是否具有类似ASD的表型。本文尝试通过提出联合使用五种果蝇行为学范式来简化这一评估流程。这些范式用于检测人类ASD患者中普遍存在且主要的行为缺陷：社交与沟通障碍、重复性行为增强以及习惯化缺陷。若某一果蝇基因突变在全部或大部分这五项行为范式中均表现出异常，则可能强烈提示其具有类似ASD的表型特征。
本文所述的大多数行为学实验范式在以往文献中已被多次用于解决不同的研究问题。不同研究之间在技术细节上存在差异是常见现象。这些技术上的调整旨在满足特定研究需求，并适应所要解决的具体科学问题。例如，在求偶行为实验中，可对测试果蝇（tester fly）的先天性及后天习得的求偶行为进行量化分析，而该测试果蝇可以是未成熟的雄性个体65，一只处女雌性66,67一只已交配的雌性个体68,69,70，一只冻死的处女雌性65，或一只被斩首的雌性个体19在本文所述方法中，使用野生型交配过的雌性果蝇作为测试者，以检测雄性ASD模型果蝇的求偶行为模式。 s已交配雌蝇的性接受性相对低于处女蝇71因此，雄性个体的数量 求偶行为周期 及其 持续时间 对交配过的雌性比对未交配的雌性更明显；同样地， 交配潜伏期 也长于未交配的测试雌蝇，此时早期交配会导致求偶指数降低，从而限制了不同基因型之间进行有效比较的范围。因此，使用已交配雌蝇作为测试对象，可更有效地对ASD果蝇与野生型果蝇的求偶行为进行比较分析。另一方面，使用未交配雌蝇可能提供一些在使用已交配雌蝇时被掩盖的额外信息。此外，使用已交配雌蝇也可能影响并改变雄性果蝇的求偶行为。综上所述，建议研究人员根据具体实验需求选择并明确其实验策略。
在将该技术应用于任何或全部与自闭症谱系障碍（ASD）相关基因的果蝇同源基因之前，需谨慎对待。所有这些行为范式均由特定且数量较少的神经元所调控。在开展特定行为范式研究之前，必须首先明确某个基因的表达情况。例如，如果某个与ASD相关的基因在果蝇中的同源基因不在蘑菇体神经元或谷氨酸能神经元中表达，那么其突变体可能不会表现出求偶行为或理毛行为的异常。
研究人员需要注意的另一个问题是，缺乏表型缺陷并不总是意味着该突变没有作用。例如，在针对 Fmr1 突变体的理毛行为实验中，突变体的总理毛行为次数与对照组相比并无显著降低，而其他参数（如理毛指数等）则显示出理毛行为的异常。这一现象可能归因于 Fmr1 突变体每次理毛行为的持续时间延长，导致尽管总持续时间明显增加，但总行为次数反而较低。这强调了对每种行为模式需进行多个参数定量分析的重要性。此外，必须认识到，自闭症谱系障碍（ASD）涵盖由数百个基因中任意一个发生变异所引起的多种疾病，导致不同个体间表现出异质性的表型以及不同程度的外显率。例如，习惯化缺陷仅出现在部分患者中，并非所有患者都存在该现象。在果蝇疾病模型中，同样应预期会出现类似的异质性表现。
在分析攻击行为时，本研究考虑了多种类型的攻击性参数：扑击、展翅威胁、扭打等（图1）30。每次攻击行为都需要被识别并计数，可按单次攻击类型分别记录，也可统计攻击总次数。首先应熟悉雄性果蝇的攻击行为模式，相关描述见文献59,72，并如图1所示。在统计攻击行为次数时，必须明确定义单次攻击事件的起始点和终止点；一次攻击过程中可能包含多种攻击行为模式，随后该次攻击结束。当果蝇停止表现出任何攻击行为或运动持续达2秒，或停止攻击并开始走开时，即视为一次攻击行为结束。
上述大多数行为学范式已有多个实验室描述了其多种变异形式和技术改进。每一种特定的修改都是为了满足特定目的的需求而设计的。同样，基于自动化和算法的定量或分析技术也使这些方法摆脱了人为误差的可能性。本文展示了所需材料最少的最基本技术，以期这些技术能够被尽可能多的研究人员轻松采用和使用。

自闭症谱系障碍（ASD）涵盖一组异质性的神经系统疾病，包括一系列复杂的神经发育障碍，其特征为在多种情境下持续存在社会交流与社会互动方面的缺陷，以及存在局限、重复的行为模式、活动方式和兴趣1。根据世界卫生组织（WHO）的数据，全球每100名儿童中就有1人被诊断为ASD，男女比例为4.2:12。该疾病通常在出生后的第二或第三年即显现。ASD儿童在社会情感互动、非语言交流以及建立和维持人际关系方面表现出明显兴趣缺乏。他们表现出重复性行为，如刻板的运动动作、僵化且仪式化的日常习惯，以及对特定兴趣的极度专注。ASD儿童对触觉、嗅觉、声音和味觉的反应程度较高，而对疼痛和温度的反应则相对较低1。不同ASD患者之间的疾病外显率也存在差异，因此临床表现的变异性较大。
目前，自闭症谱系障碍（ASD）的临床诊断主要基于个体的行为评估，尚无基于生物标志物的确认性检测方法，也缺乏能够涵盖所有类型ASD的通用基因检测手段3阐明遗传和神经生理学基础将有助于靶向治疗策略的制定。在过去十年中，大量研究已鉴定出数百个在自闭症谱系障碍（ASD）患者中发生缺失、突变或表达水平改变的基因。当前研究重点在于利用小鼠或果蝇等模式生物验证这些候选基因的功能贡献，通过敲除或敲低这些基因，检测类似ASD的行为缺陷，并揭示导致异常表型的遗传与分子通路。一种模拟人类16号染色体16p11.2区域拷贝数变异（CNVs）的小鼠模型表现出部分ASD相关的行为缺陷。4,5,6产前暴露于致畸药物丙戊酸（VPA）是另一种表现类似人类自闭症谱系障碍（ASD）特征的小鼠模型。7,8此外，还存在一系列表现出与遗传综合征相关自闭症的小鼠模型，例如由基因突变引起的单基因综合征模型 Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c 以及由诸如基因突变引起的单基因非综合征型模型 Cntnap2，Shank，Neurexin 或 神经连接蛋白 基因5.
果蝇（Drosophila melanogaster）是研究多种人类疾病（包括自闭症谱系障碍，ASD）的细胞、分子和遗传基础的另一种重要模式生物9。Drosophila 与人类在分子、细胞和突触水平上具有高度保守的生物学过程。果蝇已被成功应用于ASD相关研究10,11,12，用于鉴定与ASD相关的基因，并阐明这些基因在突触形成、突触功能与可塑性、神经回路组装及成熟过程中的确切作用；研究发现，ASD相关基因的果蝇同源基因在调控社会行为和/或重复性行为中发挥重要作用11,13,14,15,16,17,18,19,20,21。果蝇还被用作筛选ASD相关基因及其变异体的模型系统15,22,23。目前果蝇ASD研究面临的最大挑战是，与其他疾病模型不同，尚不存在单一的ASD果蝇模型。为了理解某一特定ASD基因的突变或敲低所造成的影响，研究人员需要首先验证其行为表型是否足以模拟ASD患者的临床症状，然后进一步探究这些表型背后的分子或生理机制。
因此，检测类似自闭症谱系障碍（ASD）的表型对于果蝇模型中的ASD研究至关重要。多年来已发展出一系列行为学技术，使我们能够检测社会行为/互动缺陷、交流障碍、重复性行为以及对刺激反应异常等表型异常。此外，不同实验室针对特定需求（如实验规模扩大、检测自动化、信号读取、定量分析和比较方法）对这些行为学技术进行了多项改进和优化。本视频文章展示了五种行为学范式的最基本版本，这些范式结合使用，可最为简便地检测出类似ASD的行为学表型结果。
攻击性是一种在进化上保守的先天行为，影响着生存与繁殖24。对同种个体的攻击性行为受到“社交动机”25,26以及“交流能力”27的影响，而这两者在自闭症谱系障碍（ASD）患者中均存在缺陷。果蝇（Drosophila）中的攻击性行为已有充分描述，其可通过稳定的攻击性行为检测方法进行量化28,29,30，且具有明确的遗传与神经生物学基础31，因此成为评估果蝇模型中ASD表型的合适行为范式32。社会环境的缺失所导致的社会隔离会影响攻击性行为，引发攻击性增强；当雄性果蝇被单独饲养数天后，同样可观察到此类现象33,34。另一种用于量化果蝇社交性的行为检测方法是社交距离检测（Social Space Assay）35，该方法通过测量小群体果蝇中个体间最近邻距离及果蝇间距离，非常适合用于研究ASD相关基因直系同源物在果蝇中的作用12,21,36,37，以及环境诱导的ASD果蝇模型38,39。
Drosophila 求偶行为实验是另一种常用于检测神经环路或遗传操作（包括与自闭症相关的基因）对社交和沟通能力影响的行为学范式18,19,21,40。重复性行为模式在自闭症谱系障碍（ASD）患者中普遍存在，而在果蝇中则可通过理毛行为——一系列为清洁和其他目的而执行的明确且刻板的动作——得以重现。该实验已成功用于检测ASD相关基因突变对果蝇的影响21,41，以及化学物质暴露的影响38,39。此前已有多种实验技术的改进和自动化方法被报道16,41,42,43；本文中我们展示的是最基础的实验流程，易于采用且便于量化。
已知自闭症谱系障碍（ASD）会影响部分患者的习惯化、学习和记忆能力44,45,46,47,48,49,50，在ASD模型生物中也观察到类似现象51,52，并且会导致多种嗅觉行为缺陷50。Drosophila 光关闭跳跃习惯化实验此前已被用于筛选ASD相关基因23。习惯化可通过一种简单的嗅觉习惯化检测方法进行测定53,54,55。本文描述了一种诱导嗅觉习惯化的方法，并利用经典的基于Y型迷宫的双选择嗅觉偏好实验56来检测结果，该方法可用于检测ASD相关基因突变或基因敲低条件下习惯化功能的缺陷。为了评估某种基因突变（或基因敲低）或药物处理对果蝇行为的影响是否构成类似ASD的表型，可结合使用此处描述的这5种检测方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;攻击行为实验 arena：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准24孔透明聚苯乙烯板</td><td></td><td></td><td>12 cm × 8 cm × 2 cm。单个孔的直径 = 18 cm。Sigma-Aldrich #Z707791；深度 = 1 cm</td></tr><tr><td>透明塑料/亚克力板</td><td></td><td></td><td>替代方案：细胞培养板的带孔盖子</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;社会空间实验：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>回形夹</td><td></td><td></td><td>19 mm</td></tr><tr><td>定制尺寸的玻璃片和丙烯酸片</td><td></td><td></td><td>厚度 = 5 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;求偶行为实验：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带螺纹的螺母和螺栓</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制形状的有机玻璃板</td><td></td><td></td><td>i) 盖子：一个定制的圆形透明有机玻璃圆盘（厚度2-3 mm，直径70 mm），在边缘区域有一个加样孔，中心有一个螺孔（直径均约为3 mm）； 
ii) 第二个透明较厚的有机玻璃圆盘（厚度3-4 mm，直径70 mm），具有6-8个直径为15 mm的穿孔，均匀分布在距中心等距的位置； 
iii) 底座：与盖子相同，但无加样孔</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;梳理行为检测：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>漫射玻璃覆盖的LED面板</td><td></td><td></td><td>10&amp;ndash;15瓦天花板安装式LED面板</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;习惯化与Y迷宫实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>攀爬室</td><td></td><td></td><td>x2，硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>连接Y迷宫与入口小瓶的适配器</td><td></td><td></td><td>有机玻璃，定制，尺寸为 &lt;strong&gt;图 5A&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>透明试剂瓶</td><td></td><td></td><td>Borosil #1500017</td></tr><tr><td>气体洗涤塞</td><td></td><td></td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td></td><td></td><td>OD = 25 mm × 高度 = 85 mm；硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>气味剂（丁酸乙酯）</td><td></td><td></td><td>默克 #E15701</td></tr><tr><td>石蜡（液体），轻质</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>滚轴夹</td><td></td><td></td><td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td></td><td></td><td>外径 = 0.6 cm，内径 = 0.3 cm；用于流量控制的滚轴夹</td></tr><tr><td>真空泵</td><td></td><td></td><td>Hana #HN-648（任何可通过手动反转流向的水族泵）</td></tr><tr><td>Y迷宫</td><td></td><td></td><td>硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>Y形玻璃管（硼硅酸盐玻璃）</td><td></td><td></td><td>定制制作，尺寸测量 &lt;strong&gt;图 5A&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;常用物品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>任何可用于视频播放的软件（例如：VLC 媒体播放器）</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>用于视频数据分析的计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养瓶</td><td></td><td></td><td>直径 = 60 毫米 × 高度 = 140 毫米；玻璃/聚丙烯</td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td></td><td></td><td>OD = 25 mm × 高度 = 85 mm；硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 软件</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备视频录制设置的摄像机</td><td></td><td></td><td>摄像机或手机摄像头均可使用</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于果蝇吸虫器：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉花</td><td></td><td></td><td>吸水性材料，经高压灭菌</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td>200 &amp;micro;L 或 1000 &amp;micro;L，根据硅胶管的外径选择</td></tr><tr><td>硅胶/橡胶管</td><td></td><td></td><td>长度= 30–50 cm。该管应无气味</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇食物的配制：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成分（配制1升食物所需用量）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂（8 g）</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661（CAS：9002-18-0）</td></tr><tr><td>玉米淀粉（80 g）</td><td></td><td></td><td>有机，本地采购</td></tr><tr><td>D-葡萄糖（20 g）</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758（CAS：50-99-7）</td></tr><tr><td>丙酸（4 g）</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883（CAS：79-09-4）</td></tr><tr><td>蔗糖（40 g）</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701（CAS：57-50-1）</td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯（Tego）（1.25 g）</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905（CAS：5026-62-0）</td></tr><tr><td>酵母粉（10 g）</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本研究中使用的果蝇品系：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>野生型（Canton S 或 CS）</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w[1118]; Fmr1[&amp;Delta;50M]/TM6B, Tb[+]&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w[*]; Fmr1[&amp;Delta;113M]/TM6B, Tb[1]&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;MB247-GAL4 &lt;/em&gt;（Gaurav Das，印度浦那国家细胞科学中心）</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;LN1-GAL4&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>NP1227，NP联盟，日本</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;row-shRNA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

自闭症谱系障碍的drosophila模型中的行为评估范式

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

自闭症谱系障碍（ASD）是一组异质性的神经发育障碍，具有共同的行为症状，包括社交互动和沟通能力缺陷、刻板或重复性行为增强，部分病例还伴有学习障碍和运动功能缺陷。Drosophila（果蝇）作为建模人类疾病的无与伦比的模式生物，已被广泛应用于多种人类疾病的研究。由于已有大量基因被发现与ASD相关，果蝇已成为检验这些疑似致病基因功能的强有力且高效的工具。鉴于参与ASD的数百个基因具有多样化的功能，建立单一的遗传性果蝇ASD模型并不可行；取而代之的是，通常通过构建个体基因突变体、基因敲低或过表达模型，研究ASD相关基因在果蝇中的同源基因，以揭示这些基因产物所涉及的分子通路。在Drosophila中已有多种行为学检测技术，可简便地反映特定行为组分的缺陷。果蝇的社会间距实验、攻击行为和求偶行为检测已被证明可用于评估社交互动或沟通能力的异常。果蝇的理毛行为是评估重复性行为的优良指标。习惯化实验则用于检测果蝇的习惯化学习能力，而这一能力在部分ASD患者中已被发现受损。结合使用这些行为学范式，可对果蝇中模拟的人类ASD样疾病状态进行全面评估。我们利用模拟人类脆性X综合征的Fmr1突变果蝇，以及在果蝇神经元中对POGZ同源基因row进行敲低的模型，已观察到社会间距、攻击行为、求偶行为、理毛行为及习惯化能力的可量化缺陷。本文以最简明直接的形式展示这些行为学范式，旨在促进其在果蝇模型中用于ASD及其他神经发育障碍研究的广泛应用。

攻击行为实验 
果蝇 Fmr1 突变体已被用作自闭症谱系障碍（ASD）的果蝇模型63,64。w1118 雄性果蝇作为对照组，Fmr1 反式杂合突变体 Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 雄性果蝇作为实验组；成年雄性果蝇在隔离管中单独饲养5天。将基因型相同、饲养条件相同的同型雄性果蝇配对放入攻击行为检测 arena 中，记录其20分钟内的行为表现。统计每种基因型果蝇在20分钟内的攻击行为发作总次数。结果显示，与对照组雄性果蝇相比，突变体雄性果蝇在20分钟内的攻击行为发作次数显著减少（图1E）。Fmr1 突变果蝇攻击性降低可能是由于其对与其他果蝇进行社会互动的兴趣减弱所致。相比之下，在群体或社会性饲养条件下，Fmr1 突变雄性果蝇的攻击行为发作次数与社会性饲养的 w1118 果蝇相当（数据未显示），这可能表明社会环境在促进社会行为方面具有积极作用。
社交距离实验 
在w1118和ASD模型（Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M）果蝇中进行了社交距离实验。计算每只果蝇与其最近邻个体之间的距离，每种基因型进行10次生物学重复实验。与对照组相比，突变体果蝇的最近邻距离显著增加（图2D），表明其更倾向于与其他果蝇保持较远距离。
求偶行为实验 
通过单只饲养的雄性果蝇进行求偶行为实验，以量化两种独立的自闭症谱系障碍（ASD）模型果蝇的先天求偶行为。首先，比较了Fmr1反式杂合果蝇与w1118果蝇的求偶行为；结果显示，Fmr1果蝇的求偶指数显著降低，且尝试交配的次数也明显减少（图3E1）。在第二项实验中，利用MB247-GAL4驱动系在蘑菇体神经元中表达针对row基因的短发夹微小RNA，从而敲低row——该基因为人类POGZ基因（一种高发ASD风险基因20）在Drosophila中的直系同源基因。随后检测这些row基因敲低的ASD模型果蝇是否存在先天求偶模式缺陷；求偶指数和尝试交配次数均通过15分钟的视频记录进行计算。结果表明，row基因敲低果蝇的求偶指数显著降低，尝试交配次数也明显减少（图3E2），提示其向雌性个体传递交流信号的能力存在缺陷。
梳理行为 
梳理行为被用作重复性行为的检测指标 果蝇16,42,43梳理行为在以下条件下进行了量化： Fmr1 杂合子果蝇，并与之比较 w1118首次理毛的潜伏期显著缩短 Fmr1 果蝇的平均理毛持续时间及理毛指数则显著增加 Fmr1 果蝇（图4C），表明ASD模型果蝇的理毛（或重复性）行为增强。相比之下，与对照组果蝇相比，突变果蝇的理毛行为总次数未发现显著改变。
嗅觉习惯化实验 
在大量自闭症个体中发现存在习惯化缺陷，该表型可在Drosophila23中作为相应的检测指标。本研究利用LN1-GAL4驱动在嗅觉局部中间神经元中敲低row基因，构建ASD模型并检测其嗅觉习惯化能力。实验中使用一种厌恶性气味剂——20%丁酸乙酯，以诱导果蝇产生习惯化反应。结果表明，在持续3天的气味暴露后，row基因敲低果蝇未表现出明显习惯化现象（图5E中最后两根柱状图显示，未经训练果蝇与已习惯化果蝇之间的行为指数无显著差异），而野生型果蝇在暴露于丁酸乙酯3天后表现出典型习惯化特征（暴露组果蝇的行为指数显著低于未经训练组）。这表明row基因敲低果蝇在连续3天接触丁酸乙酯后未能形成习惯化，仍持续回避该厌恶性气味剂，证明此类ASD模型果蝇存在习惯化缺陷。
<img alt="果蝇攻击行为实验：装置、阶段、结果；硅胶管、移液器、行为图谱、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：攻击行为实验装置及典型行为模式。 （A）在24孔板中设置的攻击行为实验装置，配有带孔的盖子以便果蝇进入。插图：单个实验区域的尺寸，内含果蝇食物。 （B）单只饲养管（内含一只单独隔离的雄性果蝇）和群体饲养瓶（内含雄性和雌性果蝇，模拟社会环境）的照片。 （C）用于口吸法转移果蝇的吸虫器。组装果蝇吸虫器所需的部件，标明了果蝇进入端（果蝇端）和插入嘴中的一端（嘴端）（C1），以及组装完成的果蝇吸虫器（C2）。 （D）雄性果蝇之间典型的攻击行为模式：接近、展翅威胁、格斗、抓握、扑击、拳击和扭打。 （E）Fmr1 突变型雄性果蝇对其他雄性果蝇的攻击行为较对照组减少。箱形图显示了社会隔离状态下 w1118（对照组）与 Fmr1 反式杂合果蝇（Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M）雄性个体的攻击行为次数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇社交间距实验装置与结果；三角形腔室设计；标尺贴纸；数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：社交空间实验装置示意图。 （A）展示玻璃板与丙烯酸垫片尺寸及排列方式的示意图。 （B）装置组件的最终组装方式，其中丙烯酸垫片夹在两块玻璃板之间，底部留有供果蝇进入的小缝隙。玻璃板与垫片之间形成的三角形空间即为果蝇的社交空间实验装置（SSA）区域，此处果蝇仅能在二维空间中活动。 （C）果蝇置于腔室内的最终SSA装置实物照片。缩写：SSA = 社交空间阵列。 （D）ASD模型（Fmr1 双杂合）果蝇在社交空间实验中彼此之间的间距较 w1118 果蝇显著增大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="果蝇求偶行为分析；实验装置、观察阶段、行为图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：求偶行为实验装置及典型行为模式。示意图显示了（A）求偶实验装置的设计结构和（B）圆盘的排列方式。（C）最终组装完成后的求偶实验装置照片。（D）代表性图像展示了未经交配的雄性果蝇对已交配雌蝇的求偶行为模式：追逐、定向、振翅、舔舐、试图交配以及交配行为。（E）图表展示了两种自闭症谱系障碍（ASD）模型中的求偶指数及交配尝试次数：（E1）Fmr1 突变型果蝇与w1118对照组相比，求偶指数及交配尝试次数均显著降低。（E2）使用row基因敲低果蝇作为另一种ASD模型，其中在蘑菇体神经元（MB247-GAL4）中表达row-shRNA；结果显示row基因敲低后求偶行为显著减少。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇梳理行为；实验装置、果蝇行为阶段及数据分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：领地设置及理毛行为的代表性行为模式 (A) 盘状或轮状区域（所示求偶区域相同） 图3在LED面板上设置带有漫射器的装置，从底部提供均匀照明，并从顶部拍摄视频。这确保了更高的对比度，有助于识别 grooming 过程中附肢的细微运动。B) 成年雄性果蝇中观察到的梳理行为模式照片。T1 = 1st 一对腿，T2 = 2nd 腿对，T3 = 第三对腿。 grooming 模式采用直观的缩写命名法 BT1-头＝用第一对足摩擦头部；T1-T1＝第一对足相互摩擦，依此类推。缩写：LED＝发光二极管。 (C) 显示理毛行为实验结果的图表 Fmr1 反式杂合果蝇并进行比较 w1118. Fmr1 突变果蝇首次梳理行为的潜伏期显著缩短，表明其梳理行为的开始时间早于对照组。此外，突变果蝇的平均梳理行为持续时间及梳理指数均显著增加。 Fmr1 突变体表现出ASD模型果蝇重复性行为增强的特征。相比之下，与对照组相比，突变体果蝇的理毛行为总次数未发生显著改变。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Y迷宫嗅觉测试装置与结果；果蝇气味暴露、习惯化分析、行为表现图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5嗅觉习惯化诱导与检测设置及检测后代表性结果 (A二元气味选择实验装置的组成部分：（A1Y迷宫，A2）连接器，（A3这两个的排列方式，（A4用于连接在Y迷宫臂顶部的一对收集管，（A5用于盛装气味溶液或水的玻璃瓶和玻璃管，空气将在此鼓泡后再进入Y型迷宫。B果蝇食物瓶设置用于诱导嗅觉习惯化；示意图B1) 显示了装有气味物质的微量离心管如何从瓶内中点处的铜丝上悬挂；(B2最后，用棉塞封住瓶口，并用牛皮纸包裹密封。CY迷宫装置整体布局的照片。D) 实验结束后，收集室中果蝇分布情况的照片。D1) 未经训练的果蝇（仅接触无气味的石蜡油，对照组）对厌恶性气味物（本研究中用于诱导习惯化的20%丁酸乙酯）表现出排斥反应，选择进入Y型迷宫中充满普通空气的臂，而（D2）暴露（适应）的果蝇在两个臂中均匀分布。缩写：ID = 内径。E嗅觉习惯化实验结果 行-knockdown 果蝇表现出习惯化缺陷。野生型（Canton S）果蝇在暴露于丁酸乙酯 3 天后，其表现指数相较于未经处理的果蝇显著降低，表明已产生习惯化。当后代果蝇的 LN1-GAL4 × row-shRNA 果蝇暴露3天后，其表现指数与未经训练的果蝇相比无显著差异；这表明这些row基因敲低果蝇在持续3天的气味暴露下未能形成习惯化，重现了类似人类自闭症谱系障碍（ASD）的症状。缩略语：ASD = autism spectrum disorder；shRNA = short hairpin RNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

自闭症谱系障碍（ASD）与社交和沟通行为受损以及重复性行为的出现相关。本文描述了在黑腹果蝇（Drosophila）模型中研究ASD相关基因与行为缺陷之间相互关系的五种行为范式，用于检测社会间距、攻击性、求偶、理毛以及习惯化行为。

自闭症谱系障碍的Drosophila模型中的行为评估范式

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）包含一组异质性的神经发育障碍，其共同的行为症状包括……

自闭症谱系障碍会影响儿童，导致沟通能力受损、社交行为异常以及重复性行为增强。果蝇作为一种日益流行的自闭症研究模型，可用于解析潜在的分子通路。本文介绍了一套用于果蝇自闭症模型行为表征的标准技术。为了在果蝇中解析自闭症谱系障碍的分子基础，必须精确定义其行为表现。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中量化人类自闭症的行为特征是一项极具挑战性的任务。目前尚无单一的果蝇行为范式能够涵盖该障碍的全部行为异常。我们介绍了一套在果蝇中已建立的五种行为学研究范式，即攻击性检测、社会间距检测、求偶行为、理毛行为和习惯化检测。这些方法均可用于自闭症谱系障碍（ASD）果蝇模型，以表征和量化其在交流行为、重复性行为和社会行为方面的功能缺陷程度。本文以最简形式描述了这五种技术，以便任何具备基本果蝇研究条件的实验室都能轻松采用，并在自闭症谱系障碍的果蝇模型上开展实验，从而推动我们对该疾病机制的深入理解。首先，取一个标准的24孔板，将每孔的一半填充常规果蝇食物，让食物过夜干燥。在透明塑料或丙烯酸板上制作一个直径2.5毫米的小孔，并将其覆盖在孔板上。使用体视显微镜根据性别分离新羽化的所需基因型果蝇。将一半的雄性果蝇单独放入各自的饲养管中。将另一半雄性果蝇与雌性果蝇共同饲养在常规的群体饲养小瓶中，每组10只，形成社会性饲养条件。将所有小瓶在 25 摄氏度下保存五天。通过盖子上的孔，用口吸管将两只雄性果蝇从单独或群体饲养室转移至攻击行为实验板。立即移开孔洞，确保果蝇无法逃逸。适应一到两分钟后，开始计时20分钟。务必对果蝇进行录像。在计算机上播放视频，并统计每只果蝇的攻击行为总次数。在20分钟内，突变型雄性果蝇的攻击性行为次数显著少于对照组雄性果蝇。首先，将雄性果蝇从冰上混合的果蝇群体中分离出来，并放入收集小瓶中。准备实验区域时，将两个三角形丙烯酸垫片平放在一块矩形玻璃板上，使丙烯酸垫片的直角与玻璃板的角对齐。然后将两个矩形丙烯酸垫片平放在玻璃板上，使其与两个三角形垫片的底边对齐。确认四个丙烯酸垫片在矩形玻璃板上围成一个未被垫片覆盖的三角形区域。在其中一个三角形垫片上贴上尺子标签，确保从顶部可以清晰看到。现在，将第二块矩形玻璃片放置在丙烯酸垫片上方，使其与底部的玻璃片对齐。使用四个小型长尾夹将玻璃片和垫片固定。进行检测时，取下右下角的长尾夹，并将矩形垫片略微向外移动，以形成一个间隙。将果蝇从收集管转移到社交空间实验装置时，通过已创建的空间轻轻吸取果蝇。立即插入矩形垫片，并将长尾夹重新固定到位。将实验装置垂直握住，轻轻在软垫上敲击三次，使所有果蝇沉降至底部。将装置垂直夹紧并开始计时。20分钟后拍摄实验区域的清晰照片。使用ImageJ进行分析，列出果蝇之间的最近邻距离。突变型果蝇的最近邻距离显著大于对照组，表明其倾向于与其他果蝇保持更远的距离。首先，将求偶室的四个部件组装在一起。使用吸虫器，将一只五日龄单独饲养的待测雄性果蝇从单只饲养管中轻轻转移至含有单只已交配雌蝇的求偶室中。快速旋转盖子以关闭观察室。记录果蝇的行为15分钟，以计算求偶指数和交配尝试总次数。设置好实验装置后，用吸管将一只单独饲养的雄性果蝇转移至装置中。立即滑开盖子上的孔洞，防止果蝇逃逸。将梳理行为观察 arena 置于漫射 LED 面板上，让果蝇适应环境一分钟。随后对果蝇进行 10 分钟的视频记录。分析视频并计算理毛指数、理毛潜伏期、理毛序列次数和平均理毛序列持续时间。突变果蝇的求偶指数显著降低，且交配尝试次数减少。突变果蝇首次理毛的潜伏期显著缩短，而平均理毛序列持续时间和理毛指数则显著增加。首先，获取用于习惯化实验的果蝇。取1毫升用液体石蜡稀释的偏好性气味物质，置于1.5毫升微量离心管中。将管子涡旋振荡10分钟，并用均匀打孔的塑料封口膜封口。使用金属丝将装有气味物质的试管分别悬挂在含有果蝇的培养瓶中。用棉花紧密封住瓶口，并用牛皮纸包裹，以防止气味蒸气扩散。将对照组和含气味物质的培养瓶分别标记为“未暴露组”和“气味暴露组”。将这些诱导瓶置于培养箱中维持三天。进行Y型迷宫实验时，将Y型迷宫连接至适配器，固定Y型迷宫底部至入口小瓶，然后将攀爬室连接至Y型迷宫的两个臂。使用无气味的硅胶管，将每个攀爬室的锥形末端与含有气味物质的试剂瓶相连。使用真空泵将气味物质从气体瓶驱动至Y型管的两个臂中，并使其饱和15分钟。轻轻将每支试管中饥饿处理过的果蝇引入Y型迷宫装置的入口试管中。经过短暂适应后，将入口试管与Y型迷宫连接器连接，开始实验。让果蝇爬入Y型迷宫的臂中，并在两个收集室中困置超过一分钟。完成后，轻敲入口小瓶底部，使果蝇返回瓶底，然后交换Y型迷宫两臂的位置，以避免侧向偏好。记录在规定时间内爬入Y型迷宫两臂的果蝇数量。与野生型果蝇相比，该基因敲低果蝇在经过三天的气味暴露后并未产生习惯化。

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