基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成
June 28th, 2024
本文描述了一种在半固体基底膜基质中聚集和封装脾细胞的方案。基底膜基质构建体可用于三维培养，用于研究类器官发育，或用于 体内 移植和组织再生研究。
该协议的总体目标是将细胞聚集并包裹在半固体基质中。然后，包埋的细胞聚集体可用于下游的三维体外培养，或作为体内移植实验的载体。该方法的主要优点是它使用简单的方法和设备来实现细胞聚集。
它也可以应用于一系列细胞类型和数量。该技术揭示了脾脏再生所需的特定细胞类型。它可以揭示脾脏组织再生的进一步调节因子，或作为更广泛的组织工程研究的平台。
首先在零下 20 摄氏度的冰箱内预冷 200 微升移液器吸头盒。然后将封口膜浸入 80% 乙醇中 10 分钟，然后在 PBS 中洗涤 10 分钟。要制备细胞溶液，将所需的细胞数量等分到14毫升锥形管中。
将细胞在200g和4摄氏度下离心5分钟。然后小心地吸出上清液，留下大约 20 微升的体积。然后可以将细胞沉淀重悬于剩余的上清液体积中。
使用预冷的移液器吸头，吸出 2 微升冰冷的 Matrigel。轻轻扭转并弹出以取出移液器吸头。拉伸预先灭菌的封口膜条，并将其放在移液器吸头的末端，注意不要刺穿薄膜。
继续将封口膜缠绕在侧面以确保尖端密封。然后将细胞溶液轻轻地铺在基质胶上。将移液器吸头放在冰上，准备一个 14 毫升的锥形管，里面放着一个 1.2 毫升的簇状管。
然后可以将移液器吸头插入嵌套管配置中，并在 400 克和 4 摄氏度下离心 5 分钟。将试管在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。管子可以放在冰上，直到进一步需要。
小心地从移液器吸头上取下石蜡膜，然后插入细丝柱塞，并将基质胶塞排出到组织培养基中。聚集的细胞可以在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养。使用电动剪刀剃毛，并用 80% 乙醇擦拭皮肤。
在垂直于脊柱的皮肤上做一个两厘米的切口，并暴露腹膜壁。然后在肾脏上方的腹膜壁上做第二个较小的切口。施加压力并使肾脏外部化。
通过定期使用无菌 PBS 确保肾脏保持湿润。用一把超细镊子捏住肾囊，然后用第二把镊子向相反的方向轻轻撕开。小心地将包膜与肾实质分开。
用一把镊子提起肾囊，然后慢慢地将移液器吸头滑过开口。轻轻地将金属丝柱塞插入移液器吸头，然后排出基质胶塞。用PBS润湿肾脏并重新内化到腹膜腔中。
用 5-O-Vicryl 缝合线缝合腹膜壁，并使用 AutoClip 涂抹器和两个 9 毫米伤口夹闭合皮肤切口。该协议的一个关键步骤是在半固体基质中聚集细胞。中间层定位是通过最佳离心速度实现的。
较高的速度将细胞推到移液器的最尖端，而速度不足会阻止细胞在基质中移动。凝固后，基质胶结构可以从移液器吸头中弹出。体外培养的脾基质结构形成三维球形类器官结构。
类器官显示非空心结构，细胞存在于组织的整个直径上。它们由三大细胞群组成，包括白细胞、红细胞和非造血基质细胞和内皮细胞。构建体也可以移植到肾囊下进行组织再生研究。
4周后，可观察到有组织的脾脏组织结构，包括中央小动脉、B细胞滤泡、成纤维细胞网状细胞、红髓髓细胞、边缘区嗜金属巨噬细胞、红浆窦状细胞、滤泡树突状细胞网络、T细胞区、红浆巨噬细胞和边缘区网状细胞。在尝试细胞聚集和封装时，重要的是要记住要快速工作并将所有材料保持在冰上。移植最重要的步骤是排出基质胶塞，同时从肾脏中取出移液器尖端。
必须注意不要穿孔包膜或破坏肾实质。该方案用于研究脾脏组织再生中对两个基质细胞群的要求。在这个具有代表性的实验中，只有血小板衍生的生长因子受体-β阳性MAdCAM阴性细胞的聚集体未能启动组织生长，这表明这种特殊的细胞群对于脾脏再生至关重要。
概述
本文描述了一种在半固态基底膜基质中聚集和包裹脾脏细胞的协议。该技术可用于三维培养，以研究器官样结构的发展，或用于体内移植和组织再生研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞聚集
- 组织工程
- 再生医学
背景
- 该协议允许细胞被包裹在半固态基质中。
- 它可以应用于各种细胞类型和数量。
- 这种方法揭示了脾脏再生所需的特定细胞类型。
- 它为更广泛的组织工程研究提供了平台。
研究目的
- 在基底膜基质中聚集并包裹脾脏细胞。
- 促进三维体外培养。
- 实现体内移植实验。
使用的方法
- 脾脏细胞的聚集。
- 在半固态基底膜基质中的包裹。
- 采用简单的方法和设备。
- 适用于各种细胞类型。
主要结果
- 成功聚集并包裹脾脏细胞。
- 识别了脾脏再生所需的特定细胞类型。
- 有可能揭示更多的组织再生调节因子。
- 建立了组织工程研究的平台。
结论
- 该协议提供了一种简单的细胞聚集方法。
- 它对理解脾脏组织再生有重要意义。
- 这种技术可能会增强未来的组织工程研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Basement membrane matrix encapsulated cell aggregation enables controlled investigation of cellular requirements for murine spleen tissue formation, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform provides predictive confidence for identifying essential stromal cell populations in tissue regeneration, directly informing target validation and tissue engineering strategies. The method's adaptability to both in vitro organoid culture and in vivo transplantation positions it as a reusable capability for regenerative medicine R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying spleen tissue regeneration.
- Supports functional validation of stromal cell populations critical for organogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating and testing specific cell types.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on tissue formation requirements.
Screening & Assay Development
- Prepares validated three-dimensional organoid systems for downstream analysis.
- Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible tissue constructs.
- Generates quantitative outputs on organoid structure and cellular composition.
- Enables scalable evaluation of cell population contributions to tissue formation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo models for translational continuity in tissue engineering.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative strategies based on functional tissue outcomes.
- Provides a disease-relevant system for studying immune organ regeneration.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to successful tissue formation.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation and aggregation method bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling controlled manipulation and assessment of cell populations in both organoid and transplantation models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular drivers of spleen tissue regeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative organoid constructs for comparative studies.
- Analytics: Provides measurable outputs on tissue architecture and cell-type contributions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo tissue formation and functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target cell populations for tissue regeneration.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing regenerative strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of tissue engineering approaches.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, encapsulation, and organoid culture techniques.
- Needs access to centrifugation, sterile handling, and transplantation instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Careful handling is essential to avoid tissue or organ damage during transplantation steps.
