基底膜基质包埋细胞聚集体用于研究小鼠脾脏组织形成

本实验方案的总体目标是将细胞聚集并包埋于半固体基质中。所获得的包埋细胞聚集体可进一步用于三维体外培养，或作为体内移植实验的载体。该方法的主要优势在于其利用简单的实验方法和设备即可实现细胞聚集。

该技术还可应用于多种细胞类型和数量。该方法已揭示出脾脏再生所必需的一种特定细胞类型。它可能进一步揭示脾组织再生的其他调控因子，或作为更广泛组织工程研究的平台。

首先将一个200微升枪头盒放入-20摄氏度冰箱中预冷。然后将Parafilm浸入80%乙醇中10分钟，随后用PBS洗涤10分钟。为制备细胞悬液，将所需数量的细胞分装至14毫升锥形管中。

在 200g 和 4 摄氏度条件下离心细胞 5 分钟。然后小心吸除上清液，保留约 20 微升液体。随后可将细胞沉淀重悬于残留的上清液体积中。

使用预冷的移液枪吸头吸取 2 微升冰上保存的 Matrigel。轻轻旋转并弹出吸头以移除。拉伸一段预先灭菌的 Parafilm 封口膜，并将其覆盖在移液枪吸头末端，注意不要刺破薄膜。

继续用封口膜包裹侧面，确保尖端密封。然后将细胞溶液轻柔地铺在基质胶上。将移液器尖端放在冰上，并准备一个14毫升的锥形管，内含一个1.2毫升的簇状管。

然后可将移液器吸头插入嵌套的离心管装置中，在400g和4摄氏度条件下离心5分钟。将离心管在37摄氏度下孵育15分钟。之后可将离心管置于冰上，直至后续实验需要时使用。

小心地从移液器吸头上去除封口膜，然后插入一根细金属推杆，将 Matrigel 凝胶块挤入组织培养基中。聚集的细胞可在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下进行培养。使用电动剪刀剃除毛发，并用 80% 乙醇擦拭皮肤。

在皮肤上做一个垂直于脊柱的两厘米切口，暴露腹膜壁。然后在肾脏上方的腹膜壁上做一个较小的二次切口。施加压力并将肾脏外置。

通过定期添加无菌 PBS 保持肾脏湿润。用一对超细镊子夹住肾包膜，再用另一对镊子轻轻向相反方向撕开。小心地将包膜与肾实质分离。

用一对镊子提起肾包膜，缓慢将移液器尖端从开口处滑入。轻轻将金属丝推杆插入移液器尖端，推出Matrigel凝胶块。用PBS润湿肾脏，然后将其复位至腹腔内。

使用5-0 Vicryl缝线缝合腹膜壁，并使用AutoClip施夹器和两个9毫米伤口夹闭合皮肤切口。本方案中的关键步骤是将细胞聚集于半固体基质中。通过优化离心速度可实现细胞的中间层定位。

较高的速度会推动细胞到达移液管的最尖端，而速度不足则会阻碍细胞在基质中的移动。凝固后，可将Matrigel构建物从移液管尖端推出。在体外培养的脾脏基质构建物可形成三维球形类器官结构。

类器官呈现非中空结构，细胞分布于整个组织直径范围内。它们由三大类细胞群体组成，包括白细胞、红细胞以及非造血性的基质细胞和内皮细胞。这些结构还可移植至肾包膜下，用于组织再生研究。

四周后，可观察到结构有序的脾脏组织，包括中央小动脉、B细胞滤泡、纤维状网状细胞、红髓髓系细胞、边缘区金属亲和性巨噬细胞、红髓血窦、滤泡树突状细胞网络、T细胞区、红髓巨噬细胞以及边缘区网状细胞。在进行细胞聚集和包封操作时，需注意动作迅速，并将所有材料保持在冰上。移植过程中最关键的步骤是在将移液器尖端从肾脏中抽出时，同时将Matrigel凝胶栓完全排出。

操作时需注意避免穿破被膜或损伤肾实质。本方案用于研究两种基质细胞群体在脾组织再生中的作用。在此代表性实验中，只有去除血小板源性生长因子受体β阳性、MAdCAM阴性细胞的聚集体未能启动组织生长，表明该特定细胞群体对脾脏再生至关重要。