Name: 基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学习使用基底膜基质封装小鼠脾脏细胞聚集的技术，用于三维体外培养和体内移植实验。该方法可识别脾脏再生所需的关键细胞类型，为组织工程研究提供平台。

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本研究由澳大利亚国家卫生与医学研究委员会资助（#GNT1078247）。

所有动物实验均按照昆士兰大学动物伦理委员会批准的实验方案（UQBR/079/19）进行。
1. 组织采集与基质细胞制备
<ol>
	<li>通过诱导低温法处死0.5至1.5日龄的雄性或雌性BALB/c新生供体小鼠：将动物用纸巾包裹后置于碎冰中超过&#62;10分钟。 
	注意：本方案可适用于不同品系、年龄及数量的小鼠。</li>
	<li>准备无菌外科器械。</li>
	<li>将小鼠置于右侧卧位，用80%乙醇擦拭皮肤，并使用虹膜手术剪做1 cm切口以暴露腹膜壁。</li>
	<li>在脾脏上方再做第二个0.5 cm切口，用精细镊子轻轻提起组织，使用手术剪剪断血管并切除脾脏组织。将组织转移至含有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。去除附着在脾脏上的任何残留结缔组织。 
	注意：体视显微镜可辅助完成操作器械所需的精细动作。</li>
	<li>为解离完整组织，将新生小鼠脾脏（每批不超过10个）转移至倒置的14 mL锥形管盖内缘。使用1 mL注射器推杆的塑料末端通过按压动作机械性地破坏组织。</li>
	<li>将管盖紧密固定在装有10 mL冷PBS的14 mL锥形管上。倒置管子5次，使所有破碎组织从管盖冲洗至管内。</li>
	<li>对任何剩余组织重复步骤1.6。</li>
	<li>将管子置于冰上静置1分钟，使组织沉降至管底。</li>
	<li>小心倾去上清液（含造血细胞），将溶液通过可逆的70 µm细胞筛网过滤。</li>
	<li>通过反转滤网并用新配制的2 mL含1 mg/mL Collagenase IV、40 µg/mL DNase I和2%胎牛血清（FBS）的补充型DMEM培养基（sDMEM）冲洗，回收不溶性的基质组分至14 mL锥形管中。 
	警告：Collagenase IV和Collagenase D为危险物质，必须在生物安全柜内佩戴适当的个人防护装备进行操作。</li>
	<li>为制备单细胞悬液，将合并的组织（最多20个）在37 °C下以恒定旋转条件酶解消化10分钟。</li>
	<li>直接向含有基质组织的管中加入4 mL新配制的含1 mg/mL Collagenase D、40 µg/mL DNase I和2% FBS的sDMEM。在37 °C下继续孵育10分钟，同时保持恒定旋转。</li>
	<li>加入8 mL冰上预冷的PBS终止消化反应。在4 °C下以200 x g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL冷PBS重悬细胞，于4 °C下以200 x g离心5分钟，重复洗涤两次。保持细胞在冰上。 
	注意：此时可对细胞进行计数并调整至所需浓度。不同细胞群体可能需要优化条件。采用本方案通常每只小鼠脾脏可回收0.5 × 106–1 × 106个基质细胞，具体数量取决于供体小鼠的年龄。此阶段可选择性地对细胞进行染色并进行流式细胞分选（FACS），以明确细胞组成。</li>
</ol>
2. 细胞聚集体的基质包封
<ol>
	<li>将无菌的 P200 吸头预先置于 -20 °C 冰箱中预冷。</li>
	<li>将柔性实验室封膜（例如 Parafilm）切成 1 cm × 2 cm 的小片，通过浸入 80% 乙醇中 10 分钟进行灭菌，随后用 PBS 浸泡 10 分钟。实验室封膜可预先制备并以无菌状态储存。</li>
	<li>将细胞以 200 × g 在 4 °C 离心 5 分钟，获得 0.5 × 106–2.5 × 106 个细胞。小心吸除上清液，保留约 20 µL 的 PBS 残液体积。将细胞沉淀置于冰上保存。 
	注意：可轻柔吸除残留 PBS，同时不扰动细胞沉淀，以确认残留体积。</li>
	<li>使用 P20 移液器，将 2 µL 冰冷的基底膜基质吸入预先冷却的 P200 吸头中。 
	注意：高浓度的基底膜基质（例如 Corning Matrigel Matrix High Concentration）有助于形成坚固的凝固胶塞。</li>
	<li>轻轻旋转以弹出吸头。拉伸一条预先灭菌的实验室封膜，覆盖在吸头末端，注意不要刺破膜。继续用封膜包裹吸头以密封。小心地将密封后的吸头直接放置于冰上，避免膜破裂。</li>
	<li>用残留的 PBS 重悬细胞沉淀，并将细胞悬液轻柔地铺加在基底膜基质上方。将构建物保持在冰上。</li>
	<li>准备一个离心管，将一个 1.2 mL 集群管放入一个 14 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>将吸头放入嵌套的离心管装置中，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将 14 mL 圆锥形离心管垂直放置，在 37 °C 培养 15 分钟，使基底膜基质在吸头内凝固。 
	注意：14 mL 圆锥形离心管可在后续实验使用前一直置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 三维类器官培养
<ol>
	<li>小心地从移液器吸头上去除实验室封膜。</li>
	<li>将一根细的不锈钢丝推杆从移液器吸头较大的一端插入。</li>
	<li>推出基质塞，使其从吸头末端释放至一个未经处理的6孔组织培养板的一个孔中，每孔含2 mL添加了10%胎牛血清（FBS）、1× Glutamax、1×非必需氨基酸（NEAA）、10 µM ROCK抑制剂、10 U/mL青霉素/链霉素和50 µM β-巯基乙醇的sDMEM培养基。 
	注意：可根据需要调整组织培养容器及相应的培养基体积。 
	警告：NEAA、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇为有害物质，必须在生物安全柜内佩戴适当的个人防护装备进行操作。</li>
	<li>将类器官置于37 °C、5% CO2 和95%湿度条件下培养4–12周。</li>
	<li>每5天更换一半培养基。 
	注意：如果类器官开始附着于组织培养板，请转移至新的孔中。</li>
</ol>
4. 肾包膜移植
<ol>
	<li>准备无菌外科手术器械。</li>
	<li>进行基底膜基质栓的肾包膜下移植：
	<ol>
		<li>根据机构动物伦理指南，使用异氟烷对8周龄BALB/c雌性受体小鼠进行麻醉。 
		警告：异氟烷为有害物质，必须清除废气以防止其进入工作环境。</li>
		<li>将小鼠置于右侧卧位。</li>
		<li>剃除手术区域的毛发，并根据机构指南对皮肤进行消毒。 
		注：建议使用含碘或氯己定的消毒剂与酒精类消毒液交替进行三次环形擦拭消毒。</li>
		<li>在皮肤上做一条垂直于脊柱的2 cm切口，以暴露腹膜壁。 
		注：可使用精细手术剪或手术刀片进行皮肤切口。操作者应遵循机构动物伦理指南或标准操作程序。</li>
		<li>在肾脏上方的腹膜壁上做一个较小的0.5 cm切口。 
		注：切口宽度应接近肾脏宽度，以确保移植过程中肾脏保持外露。</li>
		<li>用拇指和食指向下施压，使肾脏通过腹膜开口外露。可使用环形镊子辅助外露操作。在整个操作过程中，应定期使用棉签滴加无菌PBS以保持肾脏湿润。</li>
		<li>在体视显微镜下，用一对弯头超细镊子夹住肾脏一极的肾周脂肪与肾包膜，再用另一对弯头超细镊子朝相反方向轻轻向上撕开肾包膜，形成一个小开口。</li>
		<li>小心将镊子的一个尖端插入包膜下方，缓慢扫动以分离肾包膜与肾实质。</li>
		<li>通过移除移液器尖端的实验室封膜，准备用于移植的基底膜基质栓。</li>
		<li>用镊子的一个尖端提起肾包膜，将移液器尖端经开口插入，并推向肾脏的对侧极。</li>
		<li>将金属推杆插入移液器尖端，一边推出基质栓，一边同时将移液器尖端从肾脏中撤出。</li>
		<li>用PBS润湿肾脏，然后将其复位至体内。</li>
		<li>用一根5-0 Vicryl缝线缝合腹膜壁，用两个自动夹关闭皮肤。</li>
		<li>给予镇痛药物（皮下注射布托啡诺，剂量为0.05–0.1 mg/kg，或遵照机构动物伦理指南）。 
		警告：布托啡诺为有害物质，必须佩戴适当的个人防护装备进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭异氟烷气流，但保持氧气流通，使小鼠吸入纯氧直至开始恢复意识。</li>
	<li>将小鼠放回笼中。在恢复期间，通过将笼子部分置于加热垫上或置于加热灯下，保持动物体温，并持续监测直至小鼠完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>在术后前两周内或根据机构指南要求，监测术后恢复情况。</li>
</ol>

<ol><li>Jarcho, S., Andersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+autotransplantation+of+splenic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Traumatic autotransplantation of splenic tissue.</a> American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).</li>
<li>Storsteen, K. A., ReMine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+the+spleen+with+splenic+implants%3A+splenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis.</a> Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).</li>
<li>Mizrahi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraumatic+autotransplantation+of+spleen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue.</a> Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).</li>
<li>Miko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+autotransplantation.+Morphological+and+functional+follow-up+after+spleen+autotransplantation+in+mice%3A+A+research+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary.</a> Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).</li>
<li>Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+spleen+protects+against+overwhelming+Pneumococcal+sepsis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model.</a> Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoarchitecture+of+regenerated+splenic+and+lymph+node+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants.</a> International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+spleen+tissue+regeneration+from+neonatal+spleen+capsule+requires+lymphotoxin+priming+of+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells.</a> The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+subsets+directing+neonatal+spleen+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration.</a> Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).</li>
<li>Gee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+organoid+units+generate+functional+human+and+mouse+tissue-engineered+spleen+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).</li>
<li>Ueno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Tlx1+marks+a+subset+of+lymphoid+tissue+organizer-like+mesenchymal+progenitor+cells+in+the+neonatal+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).</li>
<li>Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01">https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01</a> (2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

新生小鼠脾细胞在半固体培养基中的聚集是生成脾脏结构的一种可行方法。类似的基于基底膜基质的实验方案已被用于启动三维脾脏培养。10在此，我们证明脾脏构建物同样适用于 体外 类器官培养系统以及 体内 移植模型。值得注意的是，移植 体外 尚未测试培养脾类器官的能力，但确定其是否具备完全或部分脾组织再生能力将具有重要意义。本方案还继承了先前脾移植研究中描述的细胞聚集技术。8这些研究涉及将细胞聚集体加载到胶原膜上，随后移植至肾包膜下。将细胞聚集体包裹于基底膜基质内，在移植物方向性方面具有明显优势，可消除胶原膜侧朝下与细胞聚集体侧朝下移植所带来的差异。
制备基底膜基质结构的方法相对简单。使用高浓度的基底膜基质可确保细胞在基质弥散前的数天内以聚集状态得到初始支持。根据我们的经验，在将PBS悬浮的细胞溶液小心分层（步骤 2.6）并离心（步骤 2.8）后，基底膜基质的混合与稀释程度极小。大多数优化工作集中在将细胞沉淀精确定位于基质凝胶内部（图1）。可通过测试多个变量来解决这一问题，例如离心速度、离心时间、基底膜基质体积、PBS悬浮细胞溶液的体积以及移液器吸头的尺寸。细胞数量及其特性（如大小、密度）也可能影响参数设置，每种细胞样品均应单独进行优化。
有几个局限性需要特别指出。基底膜基质可能对温度敏感，操作时应迅速进行，以保持试剂处于低温状态。这可以防止基质过早凝固，并确保细胞被正确包埋。尽管所有相关材料均在低温环境下储存、配制或保存，但人工操作步骤（例如弹出移液器吸头、用柔性实验室封膜密封 [步骤 2.5]）可能会不同程度地引入操作者带来的外部热量，从而改变基质的黏度，并影响离心过程中细胞的迁移特性。因此，实验内部及实验之间的可重复性可能难以持续保持一致。
第二个局限性在于对操作者经验和技术熟练程度的要求。某些手动操作技术可能需要经过较长时间的培训才能高效且成功地完成。例如，用实验室封口膜密封移液枪头（步骤 2.5）在初期可能成功率较低，但随着练习次数增加，操作水平必然会提高。动物显微外科技术的掌握同样依赖于反复实践。在进行移植操作时需格外小心，尤其是在将移液枪头插入肾包膜下方（步骤 4.2.10）、推进金属推杆以推出组织栓（步骤 4.2.11）以及从肾脏中撤出枪头的过程中。在撤出移液枪头的同时，必须轻柔而稳定地推出组织栓。过度或不恰当的操作可能导致肾包膜穿孔或肾实质损伤，从而引起大量出血。
总之，本文描述了一种将细胞包封于半固态基质中的方法，重点在于理解脾脏组织的形成过程。该体系同样可广泛应用于多种细胞类型，并具有多方面的应用潜力 体外 或 体内 下游应用

脾脏的创伤性破裂以及体内出现多个脾脏结节，是最早提示脾组织具有再生能力的现象之一1,2。随后，脾脏自体移植被引入临床，用于在需要急诊脾切除的患者中保留脾组织3。然而，尽管该技术已在临床实践中应用数十年，人们对脾脏如何再生仍知之甚少。动物移植模型为研究脾脏再生及免疫功能的多个参数提供了重要见解4,5。特别是，对移植物制备方法的实验性改进，使得在细胞和分子水平上更深入地研究组织再生成为可能。
涉及整片脾脏的移植在重建新的脾脏结构之前会经历一个大规模坏死的阶段6移植物坏死的初始阶段表明，移植组织的大部分主要由红细胞和白细胞构成，而这些成分对于脾脏再生并非必需。这一假设通过在小鼠肾包膜下移植前去除脾移植物中的造血细胞进行了实验验证。结果显示，脾脏中非白细胞/非红细胞组分（包括基质细胞和内皮细胞）足以诱导脾脏再生 从头合成 组织形成7脾脏基质组织可进一步处理为单细胞悬液，从而可利用细胞分选技术调控细胞移植物的组成。通过选择性去除特定细胞类型，两种CD45-TER-119- 基质细胞群体被鉴定为移植物发育所不可或缺：一类内皮样CD31+CD105+MAdCAM-1+ 细胞群体和更广泛定义的PDGFRβ+ 间充质细胞群体8.
利用脾细胞构建移植物在支撑材料和细胞接种方法上存在差异。此前，组织工程化脾脏是通过将脾单位接种到聚乙醇酸/聚-L-乳酸聚合物支架上制备而成。5,9有趣的是，脾脏基质细胞被吸收至胶原海绵后未能成功植入，而将基质细胞聚合并接种于胶原膜上则可促进脾脏再生8将脾脏基质细胞重悬于Matrigel基质中，在三维培养条件下也被证实可诱导细胞聚集。10然而，该方法尚未在移植模型中进行测试。本方案的总体目标是强制聚集脾脏基质细胞并将其直接包埋于基底膜基质内，随后可转移至三维环境 体外 组织培养系统，或作为动物模型移植的载体（补充图1).

<table><tbody><tr><td>96孔聚丙烯1.2 mL簇状管</td><td>康宁</td><td>CLS4401</td><td>用于放入14 ml锥形管内</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>储备液 55 mM，使用浓度为 50 μM</td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>来自溶组织梭菌</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I，II-S 型，冻干粉，蛋白质 &amp;ge;80 %, &amp;ge;2,000 单位/毫克蛋白</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，不含丙酮酸钠，液体。经无菌过滤。</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>不含氯化钙和氯化镁，经无菌过滤</td></tr><tr><td>Eclipse 200 &amp;mu;移液器吸头</td><td>Labcon</td><td>1030-260-000</td><td>斜面针尖</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>批号# 1382243</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>储存液为100倍浓度，使用时稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>康宁</td><td>354263</td><td>Matrigel基质膜（高浓度），批号# 7330186</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>储存液为100倍浓度，使用时稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10,000 单位/毫升青霉素储备液，10,000 微克/毫升链霉素储备液</td></tr><tr><td>可逆细胞过滤器</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27216</td><td>70 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>环形镊子</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td>环尺寸：3 mm</td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂（Y-27632）</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世卡 Heraeus Megafuge 40R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>加速度和减速度均设置为 8</td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>EMS</td><td>78340-51S</td><td>Style 51S。无磁性/耐酸型SA低碳奥氏体不锈钢镊子，具有耐腐蚀性。表面为防眩光缎面处理。</td></tr><tr><td>Vicryl 5/0 缝合线 Ligapak 卷轴</td><td>Ethicon</td><td>J283G</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol II 长导线活塞</td><td>德拉蒙德</td><td>5-000-2002-L</td><td>不锈钢柱塞，25 &amp;和 50 &amp;mu;L/WRTL II，长型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>伤口缝合夹施加器</td><td>MikRon</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>MikRon</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr></tbody></table>

基底膜基质包埋细胞聚集体用于研究小鼠脾脏组织形成

Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation for Investigating Murine Spleen Tissue Formation

脾脏是一种免疫器官，在血液介导的免疫反应中发挥关键作用。该组织的解剖性或功能性缺失会增加机体对严重血源性感染和败血症的易感性。临床上已采用自体脾组织片移植来替代丧失的脾组织并恢复免疫功能。然而，驱动脾组织 robust 再生并实现免疫学功能的机制尚未完全阐明。本研究旨在建立一种将脾细胞聚集并包封于半固态基质中的方法，以探究脾组织形成所需的细胞条件。基于基底膜基质包封的细胞构建物适用于 体外 三维类器官的组织培养以及肾包膜下移植以直接评估 体内 组织形成。通过调控用于聚集和包封的输入细胞，我们证明了移植物来源的 PDGFRβ+MAdCAM-1- 在动物移植模型中，新生基质细胞是脾脏组织再生所必需的。

细胞聚集对于促进细胞间的接触和信号传导具有重要意义。将细胞聚集体包埋于基底膜基质中，可同时支持三维培养 体外 组织类器官的形成，并促进了将细胞机械递送至肾包膜以进行移植物移植。为构建这些结构，首先在冰冻条件下使基底膜基质保持液态。随后通过在上方铺加浓缩的细胞悬液，并利用离心力推动细胞穿过高密度基质，从而实现细胞聚集。离心速度的优化（200–2000 × g)才能实现中层细胞的定位（图1A），这也取决于细胞数量。较高的离心力（&gt;500 x g)推动细胞至移液管的最尖端（图1B），对于细胞数量较少的情况需格外谨慎（即 &lt;5 × 105）在移除柔性实验室膜覆盖物时可能会丢失。相反，若离心力过低（≤200 x g) (图1C）。细胞数量的离心速度 &lt;1 × 105 或 &gt;2.5 x 106 可能需要进一步优化。离心后，通过将构建物在基底膜基质中升温，使细胞置于基底膜基质内 37 °C 15 分钟。此固化过程使得基质“凝胶柱”能够完全被推出（图1D使用细金属丝推杆。
体外脾类器官形成 
将基底膜基质凝胶小块挤出至适当的组织培养容器中，可重复地形成三维类器官样结构，该结构可在标准组织培养技术与条件下（37 °C，5% CO2，95% 湿度）长期维持11。在培养过程中，支撑性的基底膜基质基底在第0至14天逐渐消退（图2A，i-iii），至第21天时已不可见，仅留下完整的类器官样球形细胞团（图2A，vi），其直径约为545 µm（标准差 = 120 µm，n = 6）11。这些类器官结构在体外可维持培养超过30天，但其尺寸不随时间增加（图2B）。脾类器官由CD45-TER-119-基质细胞、CD45-TER-119+红细胞以及CD45+TER-119-淋巴样细胞组成（图2C），但各细胞群体在不同类器官中的比例存在差异（n = 4；表1）。为评估脾类器官的一般结构，制备了50 µm厚的组织冷冻切片并进行观察。类器官为非中空结构，细胞遍布整个组织横截面（图2D）。对类器官7 µm厚的单细胞层切片进行分析显示，细胞呈绳索样排列，无明确的空间取向（图2D），细胞串之间存在无细胞核的空隙区域。CD45抗体染色证实存在有核的造血细胞，这些细胞密集分布在类器官的外周区域（图2E）。此外，在类器官更中心的区域还观察到具有明显纺锤形形态的CD45+细胞。CD90.2（T细胞）和CD19（B细胞）抗体染色呈普遍阴性，而CD11b染色呈阳性，表明类器官中特异性存在髓系细胞（图2F）。在多个类器官中还检测到非造血来源的CD105+和CD31+内皮细胞11。
体内脾脏移植物移植 
将聚集的脾脏基质细胞包封于半固态基质中，有助于开展动物移植研究。该技术被用于将未经分选或经FACS分选的CD45-TER-119-新生小鼠脾脏基质细胞悬液嵌入基底膜基质凝胶中，作为移植至小鼠肾包膜下的载体。与类似的细胞聚集实验方案一致8，在4次成功的5次独立动物移植中，基底膜基质包封的细胞结构（MECCs）成功再生了脾脏组织，从而证实了该移植物构建技术的可行性。为了验证MECCs在界定脾脏再生所需细胞类型方面的应用价值，研究人员利用特异性去除PDGFRβ+MAdCAM-1+或PDGFRβ+MAdCAM-1-基质细胞（CD45-）的新生小鼠脾脏细胞构建MECC移植物11。缺乏PDGFRβ+MAdCAM-1+细胞的移植物仍具备整体组织再生能力（4个移植物中4个成功；图3A）11。其中四个再生组织中有三个表现出正常的脾脏细胞组成和结构，包括中央动脉、白髓滤泡、分隔的T细胞和B细胞区室、滤泡树突状细胞、边缘区网状细胞、边缘金属亲和巨噬细胞、红髓血窦、髓系细胞以及巨噬细胞（图3B）11。相比之下，缺乏PDGFRβ+MAdCAM-1-细胞的移植物几乎无法再生脾脏组织（4个移植物中仅1个成功）11。这些数据支持移植物来源的PDGFRβ+细胞在脾脏组织再生中的重要作用8，并明确指出PDGFRβ+MAdCAM-1-基质细胞具有特定的必要性。
<img alt="管中胚胎的显微观察；胚胎放置与提取过程；生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1．基底膜基质包埋聚集的脾脏基质细胞。 使用 200 µL 移液枪头促进细胞在基底膜基质内聚集。首先通过将 2 µL 冰冷的基底膜基质吸入预冷的移液枪头中，形成一层流体基质。将细胞悬液沉积在基质层上方，并施加离心力以促使细胞在基底膜基质内移动并聚集。(A) 离心速度的设置经过优化，使细胞聚集体位于基质层的中段位置。(B) 离心速度过高会导致细胞聚集在移液枪头末端。(C) 速度不足则会阻碍细胞穿过基质。(D) 在 37 °C 下孵育 15 分钟后，半固体基质块从移液枪头中弹出。箭头指示细胞聚集体在基质中的位置。比例尺，100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官培养与分析；显微镜图像、直径图表、流式细胞术、免疫荧光" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 体外 基底膜基质包埋的脾脏聚集体培养及三维类器官结构的形成。 (A脾类器官在35天培养周期中的发育过程。（i-vi）分别对应培养第0、7、14、21、28和35天。图像使用尼康TS2倒置相差显微镜拍摄。比例尺， 500 µm（B）脾脏类器官在长期培养过程中的直径变化。每条线代表一个独立的类器官。C) 间质细胞（CD45）的流式细胞术表征-TER-119-），淋巴样（CD45+TER-119-）和红系（CD45-TER-119+) 培养53天后的细胞群体。上图：来自新生小鼠脾脏基质的对照组织。下图：第52天的脾脏类器官。D类器官组织的大体形态 50 µm （上图）和 7 µm （下图）培养 22 天后的切片厚度。ECD45 的定位与形态+ 培养34天后的造血细胞。右侧图示为放大区域。切片为 7 µm. (F) 培养34天后对髓系（CD11b）、T（CD90.2）和B（CD19）细胞的评估。插图中显示放大区域。切片为 7 µm使用尼康Eclipse Ti2-E活细胞显微镜采集图像。比例尺（D，E，F), 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示组织切片和标志物合并的多重免疫荧光组织学分析示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3．基底膜基质移植物组织分析。 移植物由去除了PDGFRβ+MAdCAM-1+细胞的新生小鼠脾脏基质构建（n = 4）。更多在线数据11。(A) 移植后4周在肾包膜下再生脾脏移植物的大体外观。黄色框内区域表示再生的脾组织。图像使用配备Snap变焦适配器的Leica M60体视显微镜和Apple iPhone 6S拍摄。比例尺，1000 µm。(B) 冠状面冷冻切片（厚度30 µm）移植物组织的多色复合免疫荧光图像。使用所示抗体标记以显示脾组织的微结构。图像使用Nikon Eclipse Ti2-E活细胞显微镜采集。框内区域为高倍放大区域。比例尺，1000 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类器官编号</td>
			<td>基质细胞</td>
			<td>红细胞</td>
			<td>淋巴细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>62</td>
			<td>7.7</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.1</td>
			<td>96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>76</td>
			<td>12</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 各个脾类器官中基质细胞、红系细胞和淋巴细胞群体的百分比。
补充图1. 生成基质包埋细胞构建体主要步骤的方案流程图 体外 和 体内 研究。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/Supplemantary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本文介绍了一种将脾脏细胞在半固体基底膜基质中进行聚集和包封的实验方案。基底膜基质构建物可用于三维培养，以研究类器官的发育，或用于 体内 移植与组织再生研究。

脾脏是一种免疫器官，在血液介导的免疫反应中发挥关键作用。该组织的解剖学或功能丧失会增加……

本实验方案的总体目标是将细胞聚集并包埋于半固体基质中。所获得的包埋细胞聚集体可进一步用于三维体外培养，或作为体内移植实验的载体。该方法的主要优势在于其利用简单的实验方法和设备即可实现细胞聚集。该技术还可应用于多种细胞类型和数量。该方法已揭示出脾脏再生所必需的一种特定细胞类型。它可能进一步揭示脾组织再生的其他调控因子，或作为更广泛组织工程研究的平台。首先将一个200微升枪头盒放入-20摄氏度冰箱中预冷。然后将Parafilm浸入80%乙醇中10分钟，随后用PBS洗涤10分钟。为制备细胞悬液，将所需数量的细胞分装至14毫升锥形管中。在 200g 和 4 摄氏度条件下离心细胞 5 分钟。然后小心吸除上清液，保留约 20 微升液体。随后可将细胞沉淀重悬于残留的上清液体积中。使用预冷的移液枪吸头吸取 2 微升冰上保存的 Matrigel。轻轻旋转并弹出吸头以移除。拉伸一段预先灭菌的 Parafilm 封口膜，并将其覆盖在移液枪吸头末端，注意不要刺破薄膜。继续用封口膜包裹侧面，确保尖端密封。然后将细胞溶液轻柔地铺在基质胶上。将移液器尖端放在冰上，并准备一个14毫升的锥形管，内含一个1.2毫升的簇状管。然后可将移液器吸头插入嵌套的离心管装置中，在400g和4摄氏度条件下离心5分钟。将离心管在37摄氏度下孵育15分钟。之后可将离心管置于冰上，直至后续实验需要时使用。小心地从移液器吸头上去除封口膜，然后插入一根细金属推杆，将 Matrigel 凝胶块挤入组织培养基中。聚集的细胞可在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下进行培养。使用电动剪刀剃除毛发，并用 80% 乙醇擦拭皮肤。在皮肤上做一个垂直于脊柱的两厘米切口，暴露腹膜壁。然后在肾脏上方的腹膜壁上做一个较小的二次切口。施加压力并将肾脏外置。通过定期添加无菌 PBS 保持肾脏湿润。用一对超细镊子夹住肾包膜，再用另一对镊子轻轻向相反方向撕开。小心地将包膜与肾实质分离。用一对镊子提起肾包膜，缓慢将移液器尖端从开口处滑入。轻轻将金属丝推杆插入移液器尖端，推出Matrigel凝胶块。用PBS润湿肾脏，然后将其复位至腹腔内。使用5-0 Vicryl缝线缝合腹膜壁，并使用AutoClip施夹器和两个9毫米伤口夹闭合皮肤切口。本方案中的关键步骤是将细胞聚集于半固体基质中。通过优化离心速度可实现细胞的中间层定位。 较高的速度会推动细胞到达移液管的最尖端，而速度不足则会阻碍细胞在基质中的移动。凝固后，可将Matrigel构建物从移液管尖端推出。在体外培养的脾脏基质构建物可形成三维球形类器官结构。类器官呈现非中空结构，细胞分布于整个组织直径范围内。它们由三大类细胞群体组成，包括白细胞、红细胞以及非造血性的基质细胞和内皮细胞。这些结构还可移植至肾包膜下，用于组织再生研究。四周后，可观察到结构有序的脾脏组织，包括中央小动脉、B细胞滤泡、纤维状网状细胞、红髓髓系细胞、边缘区金属亲和性巨噬细胞、红髓血窦、滤泡树突状细胞网络、T细胞区、红髓巨噬细胞以及边缘区网状细胞。在进行细胞聚集和包封操作时，需注意动作迅速，并将所有材料保持在冰上。移植过程中最关键的步骤是在将移液器尖端从肾脏中抽出时，同时将Matrigel凝胶栓完全排出。操作时需注意避免穿破被膜或损伤肾实质。本方案用于研究两种基质细胞群体在脾组织再生中的作用。在此代表性实验中，只有去除血小板源性生长因子受体β阳性、MAdCAM阴性细胞的聚集体未能启动组织生长，表明该特定细胞群体对脾脏再生至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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