利用新一代聚合血红蛋白氧载体在大鼠离体肺灌注模型中探索替代性灌注液

离体肺灌注（EVLP）可实现对供体肺的长期评估。目前存在两种灌注液，分别为无细胞和含细胞类型。本研究详细介绍了在大鼠EVLP模型中，使用基于聚合人血红蛋白（PolyHb）的氧载体作为灌注液的实验方案，以测试该灌注液的性能。

近年来，离体器官灌注技术的进步使得供体器官库得以扩大，且器官功能得到改善。通过开发定制的灌注液以延长常温灌注时间，将推动该领域进一步发展。目前的灌注技术采用细胞型或无细胞型灌注液，二者各有优缺点。

灌注液成分对于提供代谢支持、减轻炎症反应以及维持胶体渗透压至关重要。然而，现有的灌注溶液可能引起肺水肿和组织损伤，因此有必要开发新型灌注液，在维持正常细胞稳态的同时避免过度损伤。一种有前景的基于血红蛋白的氧载体（HBOC）是由过期浓缩红细胞合成的聚合人血红蛋白。

本实验室开发了一种新一代的多聚血红蛋白（PolyHb），其低分子量组分和无细胞血红蛋白含量极低。该制剂在动物研究中表现出更优的生物物理特性，并减少了血管收缩、高血压和氧化损伤。这些特性使其成为一种有前景的灌注液候选物。

首先，取人血清白蛋白，使其终浓度为3%。向其中加入聚合血红蛋白（PolyhHb），用Williams' E培养基稀释至终浓度为每分升3.7克。然后，向所得稀释的PolyhHb溶液中加入1毫升肝素溶液。将PolyhHb灌注液加入EVLP回路储液器中，并将水浴温度设定为37摄氏度。

然后，启动滚压泵，确保灌注液在回路中循环。将脱氧气体连接至中空纤维氧合器，以对灌注液进行脱氧。在计算机上打开数据采集软件。

确认肺动脉压力、气管压差、呼吸流速压差、肺重量和泵速传感器均已连接至管路系统和数据转换盒。仔细检查所有管路连接处，确保无泄漏，并确认温水正在整个系统中循环。在软件中点击“运行”，以检查所有压力传感器是否正常工作。

待系统正常运行后，关闭滚轴泵。首先，将已高压灭菌的手术器械放置于手术台上。剃除麻醉大鼠腹部的毛发，并将大鼠仰卧位固定于手术板上。

用聚维酮碘清洁腹部，随后使用70%乙醇。在大鼠眼睛下方涂抹眼膏以防止干燥。将大鼠固定在手术板上。

启动数据采集软件并开始记录。将呼吸机设置为每千克4毫升并开启，确保气道正压和呼气末正压约为2厘米水柱。使用剪刀，从剑突沿中线切开至耻骨联合进行剖腹手术。

然后，借助钝性器械进行内侧至外侧的内脏旋转，暴露肝下腔静脉。使用20号针头向腔静脉内注射肝素。用剪刀从胸骨切迹开始沿中线剪开皮肤，直至下颌角下方，并开始向气管方向进行解剖分离。

然后，钝性分离必要的带状肌以暴露气管。在气管软骨环之间的气管前壁做横向切口，注意不要切穿气管后壁。用5-0丝线在气管周围放置缝线。

将气管插管插入软骨环，并用5-0丝线固定。将气管插管连接至呼吸机，确保胸部有适当的起伏。使用剪刀行胸骨正中切开术，进入胸腔。

放置胸壁牵开器以暴露心脏和肺，避免对肺造成任何意外操作。结合使用锐性与钝性分离，从前纵隔中切除胸腺。辨认肺动脉，并在其周围放置一根5-0丝线缝线，以备插管。

使用剪刀在右心室流出道做2至3毫米的切口，将动脉插管插入肺动脉并用5-0缝线固定。处死大鼠后，迅速将除气的肺保存液连接至动脉插管，利用重力灌注冲洗肺脏。随后将动脉插管连接至体外肺灌注（EVLP）回路。

打开蠕动泵，使少量灌注液流经肺部，并从左心室流出进入胸腔。一旦灌注液开始从左心房流出，关闭蠕动泵。接着，将一把小镊子插入左心室，轻轻牵拉二尖瓣环。

在心脏周围放置一根5-0丝线结扎线，先松松打结。将左心房插管插入左心室，并推进插管直至在心房内可见。用预先打结的5-0缝线固定左心房。

辨认食管，并用止血钳尽可能靠近膈肌将其夹住，然后在止血钳下方剪断食管。以脊柱为引导，用剪刀切断心脏-肺组织块与周围结构相连的所有韧带附着部分。

然后，从颈部解剖出气管，并在气管插管上方切断气管，以游离心肺组织块。将心肺组织块转移至体外肺灌注（EVLP）回路中的胸腔外套内，并将左心房插管连接至回路。启动滚轴泵，并连接呼吸机监护仪。

检查气泡捕集器，确保没有空气栓塞进入系统。在最初的15分钟内，缓慢将通气和灌注参数调整至目标实验水平。此外，将灌注流速提高至目标流速和压力。

在指定时间点，检测灌注液的气体水平和肺功能。所有测试的灌注液均显示左心房氧分压略有下降，其中基于红细胞的灌注液在1小时时显著降低。在随后的数小时内，PolyHb组和对照组灌注液的左心房氧分压均保持稳定。

在灌注一小时后，红细胞灌注组的氧分压差显著降低，而PolyhHb组和对照组灌注液中的氧分压差保持稳定，无显著变化趋势。在灌注第一小时后，红细胞组和对照组灌注液的左心房二氧化碳分压显著低于PolyhHb组，该趋势在随后的几小时内持续存在。红细胞灌注液的二氧化碳分压差在灌注一小时后显著升高，之后在PolyhHb组和对照组灌注液中保持稳定。

实时肺生理数据显示，红细胞灌注液在灌注第一小时内显著增加了肺血管阻力，而PolyhHb组和对照组灌注液在整个期间均维持较低且稳定的肺血管阻力。红细胞灌注液组的肺重量变化在初期即显著增加，所有灌注液组的肺重量均持续上升，其中PolyhHb组略有更明显上升。红细胞灌注液组的肺顺应性在第一小时内显著下降，而其他灌注液组的顺应性下降无统计学意义。

四小时后，PolyhHb 的顺应性最高。