肝细胞癌微环境中肥大细胞预示良好预后：一项基于QuPath图像分析软件的回顾性研究

我们致力于评估肿瘤微环境中免疫细胞的分布情况。首先，我们分析免疫细胞在肿瘤组织及其邻近非肿瘤组织中的浸润情况，进而确定其在肝细胞癌中的预后意义。首要挑战在于肿瘤结构的复杂性，这使得肿瘤组织与非肿瘤组织的区分变得困难。

此外，人工进行细胞定量研究耗时较长。同时，非特异性染色是所有免疫组织化学方法固有的问题。大多数关于肝细胞癌及其他癌症中主细胞的初步研究，均利用位于肿瘤深部区域和内侧边缘的主细胞所提供的预后信息。

此类分析可通过使用图像分析软件来准确标注感兴趣区域，并对免疫细胞进行精确的定量分析。首先，获取免疫染色的肝细胞癌（HCC）切片图像，然后下载并打开 QuPath 0.4.3。

在计算机上运行exe文件。创建一个新文件夹，并为其命名一个合适的名称以用于管理QuPath项目。单击软件左上角的“创建项目”按钮，并选择新创建的文件夹。

然后将扫描的图像拖入 QuPath 软件窗口。当新窗口出现后，选择设置图像类型，点击 H-DAB，然后点击导入。要查看已导入的图像，请在菜单左侧窗口的列表中进行确认，双击图像即可打开。

从主菜单中选择文件，并将图像保存为项目。在主菜单中选择画笔或魔棒工具，以标注肿瘤区域。对于不连续的肿瘤区域，需分别对每个区域进行标注。

选择所有区域时，按住控制键不放。然后单击鼠标右键，选择“编辑多个”并选择“合并选定项”。之后，单击主菜单中的“自动”，然后选择“显示脚本编辑器”。

复制所需的脚本，将其粘贴到脚本编辑器中，然后点击运行。或者，从主菜单中选择折线工具，以精确绘制出分隔恶性细胞巢和邻近非肿瘤组织的边界。然后从主菜单中选择该边界。

选择对象，点击注释，然后选择并扩展注释。将扩展半径设置为 500 微米，并在线条端点处选择“平头”。启用“移除内部”，并确保已激活“约束于父对象”。

现在，右键单击新创建的注释。选择“编辑单个”并选择“拆分”。为了正确命名注释区域，右键单击左侧列表中的注释，选择“设置属性”，然后输入内侧边缘区域和外侧边缘区域的相应名称。

将剩余的肿瘤区域定义为肿瘤中心。从外缘向外延伸500微米宽的肿瘤周围区域，如前所述。进行详细的像素分析时，从主菜单中选择矩形工具。

然后标注一个包含所有待区分像素类型的区域。接下来，导航至主菜单，选择“分析”并点击“预处理”。

然后点击“估计染色向量”。激活可视化染色编辑器后，选择“自动”并点击“确定”。将估计的染色向量命名为 H-DAB。

进行像素分析时，另一种方法是使用主菜单中的矩形工具，圈选出经苏木精染色的细胞核的一小部分区域。接着，打开左侧菜单并选择“图像”，然后双击“染色1”并选择“是”。

再次使用矩形工具标注显示 DAB 阳性染色的小区域。之后，从左侧菜单中选择图像，双击“stain two”，然后点击“yes”。要从主菜单评估阳性免疫细胞的面积分数，请点击“classify”选项，选择“pixel classification”，然后点击“create thresholder”。

然后，将分辨率设置为高，选择 DAB 通道，并应用 Sigma 值为 0.5 的高斯预滤波器。将阈值调整至 0.2 到 0.3 之间。将高于阈值的像素定义为阳性，低于阈值的像素定义为阴性。

进行区域选择时，可选择任意标注，为分类器命名，然后点击保存、测量和确定。为记录结果，复制左侧菜单中显示的数据，并将其转移至电子表格中。也可通过点击顶部主菜单中的“测量”选项作为替代方法。

然后选择并显示注释测量值。选择“复制到剪贴板”，并将结果粘贴至电子表格中以详细记录。最后，右键点击图像，进入多视图选项，点击关闭查看器以关闭图像。

CD117蛋白主要在肿瘤间质和血管周围区域的圆形细胞的胞质膜中被观察到。在肿瘤包膜以及外缘和瘤周区域的血管周围区域也可见CD117阳性细胞。NKp46蛋白主要在类似窦状隙的圆形细胞胞质膜中、肿瘤中心的间质以及内缘区域被观察到。

NKp46阳性细胞出现在外缘和瘤周区域肿瘤巢周围的包膜以及门脉区的间质中。CD1a蛋白主要见于肿瘤中心和内缘区域间质及类似窦状隙结构中呈圆形的细胞的胞质膜上，这些细胞可呈散在分布或聚集成团。在瘤周区域的肝窦和胆管上皮中也发现了CD1a阳性细胞。