Name: 高产量和低损伤分离脐带来源的间充质干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 了解钝性分离技术用于从脐带华通氏胶中高效分离间充质干细胞的方法。该技术可提高细胞产量和存活率，为再生医学与类器官研究提供可靠的细胞来源。

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本工作受到国家自然科学基金（82172107）、广东省自然科学基金（2021A1515011927、2021A1515010918、2020A1515110347）、深圳市医疗卫生科研基金（SMRF.D2301015）、深圳市科技创新委员会（JCYJ20210324135014040、JCYJ20220530172807016、JCYJ20230807150908018、JCYJ20230807150915031）以及龙岗区经济与技术发展专项资金（LGKCYLWS2022007）的资助。

样本取自中国广东省深圳市龙岗区妇幼保健院的知情同意健康捐赠者。本研究使用人类样本已获得北京中医药大学深圳医院伦理委员会（SZLDH2020LSYM-095）和深圳市龙岗区妇幼保健院医学伦理委员会（LGFYYXLLS-2020-005）的批准。所有实验均按照批准的指南进行。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 人类脐带的采集
<ol>
	<li>在无菌条件下从合作医院获取人脐带样本。 
	注意：选择年龄小于35岁、 preferably 为初产妇的供体，无肝炎、性传播疾病或遗传性疾病病史。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒的入院检查结果需为阴性。选择剖宫产作为分娩方式。</li>
	<li>选取一段长约10–15 cm的平直且完整的脐带。</li>
	<li>在剖宫产娩出足月新生儿后，立即用止血钳夹闭脐带两端，并在止血钳内侧端之间用外科结扎法结扎。（所采集的脐带如图1步骤1所示）。 
	注意：剖宫产操作可确保采集过程的无菌性。建议使用0号或2-0号缝线打结，以获得更好的抗张强度。</li>
	<li>使用手术剪在止血钳与结扎线之间剪断已结扎的脐带（图1，步骤1）。</li>
	<li>用生理盐水冲洗脐带，去除表面可能存在的血凝块，并迅速转移至含有20 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌50 mL塑料管中。 
	注意：转移过程中未使用抗生素。</li>
	<li>密封管子，放入聚苯乙烯盒中的冰上，于4 °C保存，待运送至实验室。 
	注意：应在采集后4小时内进行脐带解剖。</li>
</ol>
2. 脐带华通胶的分离
<ol>
	<li>按照以下步骤处理脐带：
	<ol>
		<li>准备一个灭菌托盘，内含外科器械、无菌包装的90 mm培养皿、1000 µL移液器、无菌PBS、75%乙醇溶液以及无异源成分的人源间充质干细胞培养基。 
		注：齿状镊子和蚊式钳有助于高效处理滑腻的脐带。</li>
		<li>在将物品放入生物安全柜之前，对所需物品及工作区域进行表面去污染。 
		注：开始操作前，让工作区域的空气净化数分钟。</li>
		<li>对管子表面进行消毒，并在生物安全柜中将样本转移至培养皿。将带有结节的样本浸入75%乙醇中30秒，然后在新的培养皿中用无菌PBS多次冲洗。 
		注：脐带必须在浸入75%乙醇前结扎，浸入时间应控制在30秒至1分钟之间，以实现充分消毒而不造成损伤。</li>
		<li>剪除结节，并用手术剪刀和镊子在两个结节之间横向将脐带切成约2 cm长的小段。 
		注：带有结节的脐带末端应予以丢弃。脐带段长度不宜过长或过短，否则均可能增加操作难度。</li>
		<li>使用1000 µL移液器以PBS灌注静脉（较大的血管），直至液体从脐带另一端流出时完全透明19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖脐带。
	<ol>
		<li>将已切割的一段脐带转移至新的培养皿中。 
		注：横切面上应清晰可见两条动脉和一条静脉8（图2B）。</li>
		<li>加入适量PBS，以保持脐带在整个操作过程中湿润。</li>
		<li>用镊子夹住脐带，并借助蚊式钳沿其长轴方向拉出动脉。 
		注：若动脉被拉断，可尝试从脐带另一端继续拉出，因动脉壁具有较强弹性。</li>
		<li>将脐带水平固定，较厚的一侧朝上，将镊子的一叶插入脐静脉内，然后夹紧，确保镊子夹在较厚的一侧。</li>
		<li>使用手术刀，沿镊子另一叶的边缘，从一端到另一端在线状切开羊膜上皮层（图3）。 
		注：切割时应尽量减少对华通胶的损伤，以保持其完整性。</li>
		<li>从切口的一角开始，用齿状钳提起羊膜上皮的一角，再用角膜剪沿上皮内表面水平继续剪开一小段。
		<ol>
			<li>用钳子分离华通胶与羊膜上皮，并逐渐扩展至脐带一端的整个圆周，纵向剥离上皮层（图3）。 
			&#8203;注：华通胶是由致密的羊膜上皮包裹的黏液性结缔组织8。整个操作应平稳进行，若剥离过程中遇到困难，可使用蚊式钳进行钝性分离。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将镊子的两叶插入静脉内，夹住一部分华通胶，然后将其翻转，使脐静脉上皮暴露出来（图3）。</li>
		<li>由于内部张力作用，静脉上皮与周围华通胶之间自然分离，可轻松剥离静脉上皮（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用传统方法解剖脐带以进行对比20。
	<ol>
		<li>选取另一段与先前脐带重量相近的已切割样本，转移至新的培养皿中。</li>
		<li>用剪刀沿脐静脉纵向剪开，并展开脐带以暴露血管和华通胶。</li>
		<li>去除脐静脉和两条动脉，并用剪刀和手术刀将华通胶从内皮层上刮下。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脐带间充质干细胞的分离与培养
<ol>
	<li>将收集的华通氏胶（WJ）置于预先标记的90 mm培养皿中，用剪刀和镊子将其切成1-3 mm大小的组织块。</li>
	<li>将培养皿倒置（盖子朝下），放入37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，以增强组织块与塑料表面的贴附。</li>
	<li>将培养皿翻转，轻柔加入适量人源间充质干细胞（MSC）培养基进行后续培养。 
	注意：加液时应使用最低流速，确保组织块仍保持贴壁状态。</li>
	<li>每3天更换一次人源MSC培养基。前7天内每2天观察一次成纤维样细胞的生长情况，并更换三分之二的培养基；第7天时更换全部培养基，之后每日观察一次。 
	注意：前7天内避免移动培养皿。约4天后可观察到明显的成纤维样细胞向外生长。</li>
	<li>持续传代培养至细胞融合度达到80%。 
	注意：此步骤通常需要7-10天。
	<ol>
		<li>将PBS、0.25%胰蛋白酶及无异源成分的人源MSC培养基在水浴中预热至37 °C。</li>
		<li>用移液器吸除上清液后，以PBS清洗，再加入预热的0.25%胰蛋白酶消化细胞，直至轻敲培养皿时细胞可脱落。</li>
		<li>按4:1比例加入预热的MSC培养基中和胰酶活性，收集细胞悬液，于4 °C下以300 × g离心5分钟。 
		注意：此批细胞定义为第0代（P0）。</li>
		<li>用移液器弃去上清液，将细胞重悬于人源MSC培养基中，按1×104 cells/cm2的接种密度接种至新的培养皿中进行扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第一、第二和第三代扩增后，使用血细胞计数板分别统计两种方法获得的总细胞数量。在第一、第三和第五代时，于显微镜下观察细胞形态。 
	注意：这些细胞的形态应与P0代细胞相似。</li>
	<li>使用第五代细胞进行流式细胞术及其他实验。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术检测细胞表面标志物的表达
<ol>
	<li>用0.25%胰蛋白酶消化第5代（P5）细胞，用细胞染色缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。将沉淀用细胞染色缓冲液重悬至每管100 µL。</li>
	<li>标记各管，并根据制造商说明书加入适量与别藻蓝蛋白（APC）、异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）偶联的抗体：CD44-APC、CD73-APC、CD90-FITC、CD105-FITC、CD11B-PE、CD19-PE、CD43-PE、HLA-DR-PE21。室温避光孵育15–20分钟。</li>
	<li>将染色后的细胞在4 °C下以300 × g离心5分钟，用移液器吸除上清液，并用细胞染色缓冲液洗涤一次。</li>
	<li>再次离心细胞，并用300 µL细胞染色缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>将细胞上机进行流式细胞仪检测，并根据制造商说明书分析抗体染色细胞。</li>
</ol>
5. 通过细胞计数法测定细胞生长曲线
<ol>
	<li>使用两种方法将P5细胞用人间充质干细胞培养基稀释，制备单细胞悬液。</li>
	<li>将8,000个细胞接种至24孔板的每孔中，每种方法共接种21孔。 
	注意：接种前需用移液器轻轻吹打和抽吸混匀细胞。</li>
	<li>接种后24小时，从三个孔中收集细胞。使用血细胞计数板进行细胞计数，并计算平均值。 
	注意：细胞计数前轻轻振荡培养板。可适当延长振荡时间，以防止细胞聚集成团。</li>
	<li>每隔24小时重复一次细胞计数，持续7天。以时间（天）为X轴，细胞数量（×104/mL）为Y轴，绘制生长曲线。</li>
</ol>

Dissection and Isolation of WJ-MSCs from the Human Umbilical Cord

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</ol>

作者声明无利益冲突。

间充质干细胞（MSCs）是再生医学研究中的一个活跃领域，具有深远的应用前景22。其独特的生物学特性使其成为科学研究的焦点，并有望彻底改变多种疾病和损伤的治疗方式7。脐带华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）是MSCs的一个独特亚群，可从脐带（UC）中血管间组织与羊膜上皮之间的胶状结缔组织中分离获得23。MSCs的临床应用关键在于获得足够数量的细胞24。然而，随着传代次数的增加，细胞开始表现出一定程度的衰老现象，MSCs的增殖能力在第5代（P5）之后逐渐下降24。因此，优化提高MSC产量的方法至关重要。
分离华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）最有效的方法是在保持其完整性的前提下解剖整个华通胶6。研究表明，来自脐带边缘区域的这些边界细胞比血管间区域的华通胶间充质干细胞具有更强的迁移能力和更高的增殖速率23。然而，目前尚未建立标准化的华通胶解剖区域和方法，且由于各分区之间缺乏明确的组织学边界，华通胶间充质干细胞群体是否具有相同的特性仍不明确3。
既往研究表明，来源于脐带不同部位的华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）在特性上存在显著差异，其中靠近羊膜表面的细胞表现出更强的增殖能力3。本研究采用一种独特的脐带解剖与WJ-MSCs分离方法，旨在减少华通氏胶表层组织的丢失和细胞损伤，从而提高细胞得率和存活率。本方案展示了一种可将脐带处理为近乎完整华通氏胶的方法。该方案的第一步是通过剥离和钝性解剖去除上皮层。其创新之处在于使用蚊式钳沿纵轴方向剥离上皮层。该方法能有效减少传统使用剪刀进行锐性解剖所造成的邻近细胞损伤25。
静脉的内皮脆弱且难以去除。在去除脐静脉的羊膜上皮后，通过静脉翻转脐带以暴露内皮。然后利用华通胶（WJ）产生的内部张力剥离静脉内皮，从而在后续的细胞培养过程中最大限度地减少人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的干扰。
由于相较于其他可用方法具有更高的产量，因此采用了组织块培养法18。未贴壁的细胞会随着人源间充质干细胞培养基的更换而逐渐被去除，从而导致细胞丢失26。根据以往经验，未能贴附于塑料表面的组织块可能会阻碍细胞的迁出。需要考虑组织因培养箱内外温度变化而释放出的水蒸气所带来的影响。为了保持培养皿的干燥状态，创新性地在培养过程中将培养皿倒置30分钟（盖子置于底部）。这种倒置操作避免了水蒸气在组织与培养皿表面接触处发生冷凝，从而有利于外泌体更好地贴附于塑料表面，促进细胞的迁出和生长。
通过测量获得的华通氏胶（WJ）的重量百分比以及培养和传代的间充质干细胞（MSCs）的数量，将当前方法与传统的解剖方法进行比较；结果显示，新方法在WJ产量和收获的MSCs数量方面均显著更高。尽管从各组分中分离干细胞群的任何方案均存在来自其他组分的细胞污染风险，但实验结果证明了所分离MSCs的纯度，表现为间充质标记物高表达（均超过99%），造血和内皮标记物检测呈极低水平（数据未显示）。结果证实，WJ-MSCs具有高纯度，适用于多种应用，符合国际细胞治疗学会（ISCT）指南21。培养的MSCs在短期内呈现成纤维细胞样形态，并逐渐形成漩涡状排列，表现出强大的增殖潜能和迁移特性。
本研究中所述方案存在若干不足之处。首先，操作者需要具备较高的操作熟练度，这一点从羊膜上皮的分离过程即可看出。这可能会限制该方案在科研或临床应用中的广泛推广。其次，该方案在解剖过程中高度依赖手工操作，可能导致不同实验之间或不同操作者之间出现不一致。若能对解剖过程进行标准化，将有助于提高方案的可靠性和可重复性25。此外，缺乏与传统方法的其他对比，仍留下一些未解答的问题。
综上所述，本方法提供了一种有效分离完整华通胶与羊膜上皮及血管的技术，所获得的组织包含血管周围和羊膜下华通胶。引入倒置培养步骤进一步改善了间充质干细胞（MSC）的贴壁效果。与传统方法相比，该方案在提高华通胶收获量以及获取更多具有更强增殖能力的MSC方面展现出显著优势。研究结果还表明所分离的MSC纯度较高，这体现在细胞表面标志物表达的明确特征上。该方法可提高MSC的产量及其增殖能力，为增强MSC生产提供了一种经济有效的方式。

自1991年首次从华通胶（Wharton's jelly, WJ）中分离出间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）以来，这些多能干细胞因其再生特性和多向分化潜能而受到研究人员的广泛关注1。MSCs可从多种来源分离获得，包括骨髓、外周血、牙髓、脂肪组织、胎儿组织（人类流产组织）以及与出生相关的组织2。脐带（UC）因其采集无创、细胞产量丰富且具有良好的分化能力，表现出高增殖率、强分化潜能以及免疫调节特性，已成为极具前景的细胞来源3。胎儿来源的MSCs具有显著的干性和免疫学特性，因而在过去二十年中成为临床试验和基础研究的主要焦点2,4,5。相较于骨髓或脂肪组织等其他来源的MSCs，脐带来源的MSCs具有更优越的治疗潜力6,7。
脐带（UC）由羊膜上皮、三条血管（两条动脉和一条静脉）以及被称为华通胶（WJ）的胶状物质组成3。有趣的是，脐带仅由内皮和间皮构成，缺乏外膜层，是一种结构简单的血管系统；而华通胶中不含淋巴管或神经8。脐带具有独特的结构，非常适合进行分段分离。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）主要位于华通胶中。MSCs 可从华通胶的不同区域分离获得，包括羊膜层、羊膜下层（羊膜层与羊膜下层亦统称为脐带衬里区）以及华通胶的血管周围区域8。华通胶的每个区域都具有其独特的结构、免疫组织化学特征和功能3,6。
源自脐带华通胶（WJ）的间充质干细胞（MSCs）被广泛认为比来自其他来源的MSCs具有更优的临床应用价值3。由于具备多向分化潜能、免疫调节特性、旁分泌作用、抗炎作用以及免疫豁免特性，WJ-MSCs已在多种疾病的临床前和临床研究中得到广泛探索2,3。研究已证实WJ-MSCs在治疗多种疾病方面具有潜力，包括移植物抗宿主病（GvHD）、移植物排斥反应、克罗恩病、自身免疫性疾病以及心血管疾病9,10,11,12,13,14。随着临床对WJ-MSCs的需求持续增长，脐带供体的短缺目前已成为其广泛应用的主要障碍。
华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的产量取决于所采用的细胞提取方法15。虽然可通过组织块培养法或酶消化法分离WJ-MSCs，但后者方法的传代时间较长，可能增加细胞损伤风险并降低细胞活力16。然而，大量研究表明，组织块培养法可提高细胞产量和活力，且组织块释放的旁分泌因子也有助于促进细胞增殖17,18。
本研究采用一种独特的分离方法获取完整的华通氏胶，从而获得增殖能力更强、活力更高且数量更多的间充质干细胞，同时最大限度地减少对华通氏胶的损伤。该创新性方法为分离华通氏胶间充质干细胞提供了一种简化的策略，满足了间充质干细胞应用中的关键需求。

<table><tbody><tr><td>APC 抗人 CD44 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>338806</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗人 CD73（外切-5'-核苷酸酶）抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>APC 小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照（FC）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>400122</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>HIRAYAMA</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Countstar</td><td>FL-CD</td><td></td></tr><tr><td>BAMBANKER 冷冻保存液</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>上海智城</td><td>C1112B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td></td></tr><tr><td>电热鼓风干燥箱</td><td>上海精宏</td><td>DHG-9423A</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD105 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>323204</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD90（Thy1）抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>FITC 小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照（FC）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>400110</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Superior Marienfeld</td><td>640410</td><td></td></tr><tr><td>细胞内染色通透洗涤缓冲液（10&amp;times;）&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>倒置生物显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Axio Vert. A1</td><td></td></tr><tr><td>液氮储存罐</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY50935-70</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（NS）</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1032</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD11b 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>393112</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD19 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>392506</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD34 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>343606</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD45 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>368510</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 HLA-DR 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>307606</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照（FC）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>400114</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG2a, &amp;kappa; 同型对照（FC）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>400214</td><td></td></tr><tr><td>精密电子天平</td><td>Satorius</td><td>PRACTUM313-1CN</td><td></td></tr><tr><td>雪花制冰机</td><td>ZIEGRA</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌 50 mL 塑料离心管</td><td>Greniner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>上海一恒</td><td>HWS12</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1:250</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>UltraGRO-Advanced</td><td>Helios&amp;nbsp;</td><td>HPCFDCGL50</td><td></td></tr><tr><td>超纯水与纯水净化系统</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Reference</td><td></td></tr><tr><td>无异种成分人源间充质干细胞培养基</td><td>FUKOKU&amp;nbsp;</td><td>T2011301</td><td></td></tr></tbody></table>

高产率低损伤的脐带来源间充质干细胞分离

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

间充质干细胞（MSCs）是一类具有强大再生能力和免疫调节特性的多能细胞。脐带（UC）中的华通胶（WJ）因其是MSCs的优质来源，在生物医学领域受到日益关注。然而，现有方法存在供应量有限和缺乏标准化等挑战。本文介绍一种通过从脐带中分离完整华通胶以提高MSC产量的新方法。该方法采用钝性解剖去除上皮层，保持华通胶整体结构的完整性，从而显著增加收获的MSC数量及其活性。与传统的锐性解剖方法相比，该方法显著减少了华通胶的浪费。为确保WJ-MSCs的纯度并最大限度减少外来细胞的影响，研究采用翻转脐带后利用内部张力剥离内皮层的操作步骤。此外，在组织块培养过程中将培养皿短暂倒置，以促进组织贴附和细胞外生长。对比分析表明，该新方法在华通胶及WJ-MSCs的收获量和细胞活性方面均优于传统方法。两种方法获得的细胞在形态学特征及细胞表面标志物表达模式上的相似性，进一步证实了其特性与纯度，适用于多种应用需求。该方法为WJ-MSCs的分离提供了高产量、高活性的技术路径，在MSCs的临床应用方面展现出巨大潜力。

收集、培养及后续分析脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的操作流程总结于图1中。采用本研究特有的方法将脐带精确地分割为若干段；主要操作步骤的具体示意图见图2。对组织块培养中外延细胞的生长情况进行常规监测和记录。培养约4天后，可见贴壁的梭形细胞逐渐从组织块中爬出，并越来越多地呈漩涡状排列。这些细胞被定义为P0代，并继续增殖以进行后续传代，且在增殖和传代过程中保持一致的细胞大小和形态。传统方法与当前方法在细胞大小和形态方面差异 negligible（可忽略）（图3）。
传统的解剖方法包括从血管和脐带（UC）内层上皮刮除外膜华通氏胶（WJ）。通过重量校正，两种方法在WJ得率上表现出显著差异。WJ得率可通过测量2 cm脐带（2.4 g ± 0.2 g）中WJ的重量百分比来计算。对当前方法与传统方法在WJ得率比例上的比较显示，采用新方法后WJ得率显著提高（图4A）。进一步通过计数两种方法从等量脐带中同时收获的WJ-MSC总数，结果显示随着传代次数增加，细胞数量差距更加明显（图4B）。生长曲线表明，在相同接种密度下，新方法中MSC的增殖速率在2天后显著高于传统方法（图4C）。这些实验结果证明了当前方法的优势，该方法可高效增加相同来源材料的供应量。
根据国际细胞与基因治疗学会（ISCT）指南中定义间充质干细胞（MSCs）的最低标准，MSCs的免疫表型表现为 CD105、CD44、CD90、CD73 呈阳性表达（超过 95%），而 CD45、CD19、CD34、CD11b 和 HLA-DR 为阴性表达（低于 2%）。22. 来自WJ的MSCs被研究 通过 定量流式细胞术（图5）；两种方法分离的细胞对表面抗原CD105、CD44、CD90和CD73均呈高度阳性（均高于99%），而表面分子CD45、CD19、CD34、CD11b和HLA-DR的表达水平均低于检测限（数据未显示）。根据细胞表面标志物的检测结果，贴壁细胞可明确认定为间充质干细胞（MSCs），其鉴定结果和纯度可得到充分保证。
<img alt="脐带MSC培养流程；示意图；步骤：解剖、培养、表征、生长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从脐带中解剖与分离华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的示意图。 步骤1：从新生儿脐带采集样本，用生理盐水冲洗，并对静脉进行灌注，随后将脐带切成约2 cm长的小段。步骤2：采用本方法分离纯化华通胶（WJ），包括去除动脉、羊膜上皮及静脉上皮；同时采用传统方法作为对照。根据需要对脐带组织进行解剖。步骤3：将分离出的WJ组织切成1–3 mm大小的组织块，将培养皿倒置于培养箱中孵育30分钟，以增强组织块与塑料培养表面之间的贴附。随后将WJ组织块接种培养，并以1 × 104 个细胞/cm2的接种密度传代培养，直至细胞融合度达到80%。步骤4：采用流式细胞术通过分析间充质干细胞（MSC）表面标志物对第5代（P5）细胞进行表征。步骤5：通过细胞计数法绘制细胞生长曲线，评估细胞的增殖能力。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="脐带解剖过程；华通胶提取示意图；静脉与动脉分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：脐带解剖结构及解剖示意图。（A）脐带横截面，标示出动脉（A）、静脉（V）、华通胶（WJ），并通过后续解剖将脐带分离为不同组分。（B）去除羊膜上皮层的示意图。沿羊膜上皮上的虚线进行切开，从脐带侧角开始分离上皮层。（C）去除静脉上皮的示意图。将脐带内翻（箭头方向表示施力方向），以暴露静脉上皮以便去除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中当前方法与传统方法的细胞生长比较；比例尺：200 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：原代培养与传代培养的WJ-MSCs的形态学特征。 从组织块中可见明显的成纤维细胞样细胞生长，约在第4天开始出现（箭头所示），并逐渐呈现涡旋状生长模式。组织块被移除并进行继代培养后，分离获得的细胞在大小和形态上均一。两种方法在细胞大小和形态方面未观察到显著差异。比例尺：200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="传统与当前细胞培养方法的柱状图和折线图比较；显示产量、传代和生长动态随时间变化的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：WJ产量及培养MSCs生长特性的图示比较分析。（A）两种方法使用2 cm脐带（初始重量为2.4 g ± 0.2 g）获得的WJ产量比较。WJ产量 =（WJ重量）/（未处理脐带的初始重量）。WJ产量比率（%）=（WJ产量）/（当前方法的平均WJ产量）× 100。（B）在相同条件下，两种方法培养和传代后的细胞计数比较。（C）两种方法中P5代细胞的生长曲线。所有实验均包含三个生物学重复，统计学差异采用双因素方差分析法进行分析（***p &lt; 0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞表面标志物 CD44、CD105、CD90、CD73 的流式细胞术直方图；数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：间充质干细胞细胞表面标志物的流式细胞术分析。采用传统方法和当前方法收集的 P5 代细胞均进行流式细胞术分析。细胞表面抗原 CD44、CD105、CD90 和 CD73 均呈高表达（全部高于 99%），而 CD45、CD19、CD34、CD11b 和 HLA-DR 表面分子的表达均低于检测限。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本研究介绍了一种独特的钝性分离方法，可保持华通胶（Wharton's jelly, WJ）的完整性，从而减少WJ的损伤，并获得数量更多、活力更高的间充质干细胞（MSCs）。与传统的锐性分离方法相比，该方法具有更高的细胞得率和增殖能力。

间充质干细胞（MSCs）是一类具有显著再生能力和免疫调节特性的多能细胞。华通胶（Wharton's jelly，WJ）……

我们的研究利用人类干细胞培育出多种类器官，这些类器官能够模拟人类器官的功能。我们开发了独特的技术，用于实现中胚层和内胚层的共分化。它们使这些类器官具备丰富的血管网络。这些类器官将促进器官发育、再生医学、疾病模型构建、药物筛选以及个性化医疗，例如类器官移植。我们的方案针对现有研究中的空白，优化了从脐带中完整分离华通胶的方法，同时保留其血管旁和次级耳样成分。该方法旨在提高间充质干细胞的产量、存活率和增殖能力，为增加MSC的生产提供一种经济有效的方法。本方案的优势在于，与传统方法相比，能够利用更多的华通氏胶并收获更多具有更强增殖能力的MSC。首先，将所有无菌外科器械放置于工作台面上。在生物安全柜中，使用75%乙醇对含有先前采集的人类脐带的试管表面进行消毒。将样本移入培养皿中，并用75%乙醇浸泡带结节的部分30秒。然后，在新的培养皿中，用无菌 PBS 多次冲洗样本。使用手术剪和镊子剪除结节，再将两个结节之间的脐带横向切成短段。用 1 毫升移液器向静脉中灌注 PBS，直至从脐带另一端流出的液体完全透明。将一段已切割的脐带转移至新的培养皿中。加入适量的磷酸盐缓冲液（PBS），以保持脐带在操作过程中的湿润。用镊子夹住脐带，并借助蚊式钳沿脐带长轴方向拉出动脉。为将脐带水平固定，使较粗的一侧朝上，将镊子的一个刀片插入脐静脉中并牢固夹紧，确保镊子夹住较粗的一侧。使用手术刀，沿镊子另一侧刀片的边缘，从一端到另一端在羊膜上皮层做线性切口。从切口的角部开始，用有齿镊夹起羊膜上皮的一角，然后用角膜剪沿上皮内表面继续水平剪开一小段距离。用钳子分离华通胶和羊膜上皮，并逐渐向脐带一端的整个圆周扩展。纵向剥离上皮层。将镊子的两个叶片插入静脉内。取部分华通胶，将其翻转以暴露脐静脉的上皮组织，随后轻轻剥离静脉上皮。将收集的华通胶置于预先标记的90毫米培养皿中，用剪刀和镊子将其剪切成1至3毫米大小的组织块。将培养皿倒置（盖子朝下），放入含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育30分钟。每三天更换一次人源间充质干细胞培养基。与传统方法相比，这种独特的钝性解剖法显著提高了华通胶的产量。通过两种方法计数华通氏胶间充质干细胞的总数量进行进一步分析，结果显示随着传代次数的增加，细胞数量差距显著。在新方法中，间充质干细胞在培养两天后的增殖速率明显更高。

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