通过流式细胞术有效检测Hoechst侧群细胞

我们采用Hoechst染料群体法检测肿瘤起始细胞。在本文中，我们尝试寻找Hoechst激发的替代方法。我们发现，高功率的375纳米和405纳米激光器可作为传统355纳米激光器的可行替代方案。

传统上，Hoechst 染料使用 355 纳米的紫外激光进行激发。由于紫外激光器成本较高，大多数流式细胞仪型号并未配备此类激光器。本方案拓展了可用于检测 Hoechst 染色的激光器范围。

对于专注于正常和恶性干细胞的研究人员，可采用更多流式细胞术模型来检测侧群细胞。首先，从小鼠中获取骨髓细胞，并向2毫升细胞悬液中加入5微克/毫升的Hoechst 33342染料。同时制备阴性对照管。

在37摄氏度水浴中孵育90分钟，每30分钟轻柔振荡一次。孵育结束后，将细胞置于冰上冷却5分钟，然后在4摄氏度下以250 G离心5分钟。用含2% FBS的冰冷运行缓冲液（Hank's平衡盐溶液）重悬细胞，在4摄氏度下再次离心5分钟。

接下来，将所得的细胞沉淀按每份样品加入500微升运行缓冲液重悬。在进行流式细胞术分析之前，向细胞中添加终浓度为每毫升2微克的碘化丙啶，并将细胞置于冰上孵育约5分钟。首先，用Hoechst 33342对配对的骨髓细胞进行染色。

进行流式细胞术时，启动所需的软件，然后选择质控标准化选项。将质控（QC）荧光微球样本管插入试管架中，随后选择“开始”以启动质控程序。

要创建新实验，请点击文件菜单中的“新建实验”选项，指定文件路径并保存实验。然后，在设置菜单中选择“设置通道”，选中通道信号复选框，并在标签列中添加试剂名称。

接下来，在图谱区域中点击伪彩图图标以创建图谱。在试管界面中点击添加试管以创建新的样本管，并修改其名称。然后，选择运行以加载样本。

查看图谱并设定门控。调整增益和阈值设置，选择“记录”以保存数据。要设计门控设置逻辑，请单击 x 轴选择 FSEW，单击 Y 轴选择 FSEA。

选择多边形门以绘制门A，圈选单个细胞并排除贴壁细胞。对于第二个图，单击x轴选择FSEA，单击y轴选择SSCA。选择多边形门以绘制门B，分离非碎片状细胞并排除细胞碎片。

对于第三个图，单击 x 轴选择 PIA，单击 Y 轴选择 SSCA。绘制门 B 后，选择呈现碘化丙啶阴性的活细胞，并绘制门 C 以获取活细胞。

对于第四个二维图，单击 x 轴选择 Hoechst 红色，单击 Y 轴选择 Hoechst 蓝色。右键单击该图，从下拉菜单中选择属性。将 x 轴和 Y 轴均设置为线性格式。

然后，圈定侧群细胞的门控区域。同时使用355纳米和405纳米激光器检测对照细胞和实验细胞。在690/50纳米和450/50纳米荧光通道采集对应于两种激光的荧光信号。

观察355纳米和405纳米激光对Hoechst 33342染料的有效激发，以清晰显示侧群细胞。对于相同样本，使用375纳米和405纳米激光进行细胞检测。355纳米激光可有效激发Hoechst 33342染料，从而清晰观察到骨髓中的SP细胞。

通过355纳米激光和405纳米激光检测的同一样本中的SP细胞基本一致。375纳米和405纳米激光均能有效激发Hoechst 33342以获取SP细胞。