Name: 用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解激光间质热疗技术治疗胶质母细胞瘤的免疫活性小鼠模型构建方法。该模型为研究热消融治疗反应及联合疗法提供了重要的临床前实验平台。

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本项目 funding 来源包括加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）-Alliance、Mitacs-Accelerate、曼尼托巴研究计划-IPOC、加拿大卫生研究院（CIHR）CGS-M 以及曼尼托巴大学研究生奖学金。CT2A 胶质瘤细胞系由美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学的 Peter Fecci 博士慷慨提供。我们还要感谢曼尼托巴大学组织学服务实验室以及小型动物与材料成像核心设施在本项目中提供的出色技术支持。

本方案的动物伦理已获曼尼托巴大学动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的伦理准则。本方案采用8至12周龄的C57BL/6免疫健全小鼠及同系胶质瘤细胞系CT2A，建立具有广泛应用前景的临床前模型，可用于组织学分析、免疫学变化或联合治疗干预等实验研究。根据实验需求，该方案可轻松适用于其他小鼠品系或细胞系。
<img alt="CT2A 移植实验示意图，显示 MRI、LITT 治疗、组织采集和分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：实验设计的基本图示。 使用 BioRender.com 制作 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 细胞制备简要步骤（第0天）
<ol>
	<li>开始细胞培养前，确保使用紫外线和乙醇对超净台及所有所需移液器进行彻底灭菌。</li>
	<li>将含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶置于水浴中，恢复至室温（RT）。</li>
	<li>用移液器吸出T25培养瓶中的培养基，用PBS短暂冲洗细胞。向细胞中加入1 mL胰蛋白酶，孵育30–60秒，直至细胞从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>在光学显微镜下确认细胞已脱落，然后加入4 mL培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
	<ol>
		<li>取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，再取10 µL混合液加入细胞计数载片中。</li>
		<li>将载片插入细胞计数仪，记录总细胞数、活细胞数及活细胞百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：如果无法使用自动细胞计数仪，可使用血细胞计数板进行手动计数。
<ol start="6">
	<li>计算所有计划注射所需的细胞数量。 
	注意：对于CT2A，建议每1.5 µL注射体积中含5000个细胞，每次制备总量至少为100 µL。</li>
	<li>以134 × g 离心5分钟，使细胞沉淀，并尽可能吸除上清液。</li>
	<li>在微量离心管中，用含5%基底膜提取物的PBS重悬细胞沉淀，体积根据需要确定。虽然较小的离心管更适合制备细胞悬液，但在手术过程中使用2 mL离心管更利于储存，因为细胞不易聚集在更圆润的管底，且通过轻弹管壁可使其迅速重新分散。</li>
	<li>将细胞置于冰上以备注射，并根据需要每4-5小时新鲜制备一次细胞悬液。</li>
</ol>
2. 原位移植（第0天）
<ol>
	<li>准备手术区域，并确保所有所需器械均已灭菌并处于可用状态。</li>
	<li>使用异氟烷（3% 挥发于 1 L/min 氧气中）麻醉小鼠2) 在监测呼吸频率（目标 60 bpm）的同时置于密闭室中。</li>
	<li>获取并记录动物体重，用于药物剂量计算。</li>
	<li>小心剃除手术区域的毛发，避免触碰眼睛、耳朵和触须。</li>
	<li>将动物转移至立体定位仪。
	<ol>
		<li>将门齿放入咬杆的孔中，调整鼻锥至贴合，拧紧固定螺钉以固定。</li>
		<li>通过双侧后肢脚趾夹捏检查麻醉深度，必要时使用耳杆固定颅骨，并调整动物头部至中立、水平位置。</li>
		<li>使用润滑的直肠温度探针监测动物核心体温，并提供辅助加温 37 °C 使用体下加热垫。 
		警告：请小心不要过度拧紧鼻锥，因为即使对鼻骨施加中等程度的压力，也可能导致呼吸停止。如果使用电加热垫（例如用于饲养箱的加热垫），请确保温度设置准确，并保持设定温度恒定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在双眼上充分涂抹眼用软膏以防止干燥。</li>
	<li>给予预防性注射并检查麻醉深度。
	<ol>
		<li>根据当地动物设施指南，使用28 G × ½"注射器皮下注射美洛昔康或其他长效镇痛药物（例如，5.0 mg/kg 美洛昔康）。</li>
		<li>在较长时间的操作过程中，为预防性补液支持，皮下注射20 mg/kg预热的生理盐水。</li>
		<li>将麻醉剂异氟烷浓度降低至1.5%-2.0%，以维持目标呼吸频率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌技术覆盖动物并准备手术区域。
	<ol>
		<li>使用无菌棉签，涂抹聚维酮碘或氯己定消毒液。从切口部位内侧开始，每次擦拭后旋转棉签，由内向外操作；然后使用另一根新的无菌棉签，以类似方式在该部位涂抹70%乙醇。</li>
		<li>用碘伏擦拭后，再用70%乙醇擦拭，重复此步骤共3次（即总共进行3次，每次均包含碘伏和70%乙醇擦拭）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行手术暴露前重新检查麻醉深度。在整个操作过程中密切监测呼吸频率，并根据需要调整麻醉剂用量。</li>
	<li>从两眼后方中线位置开始，使用15号刀片沿中矢状面朝尾端做1-1.5 cm的切口。或者，可用虹膜剪延长较短的刀片切口。 
	注意：切口应从正中线开始，但为单侧注射时，可略微向外侧倾斜，以便同时观察和准确定位前囟点及钻孔位置。</li>
	<li>使用无菌棉签轻柔地推开伤口边缘以暴露颅骨，并轻轻擦拭去除该区域的任何结缔组织。
	<ol>
		<li>必要时，可使用浸有双氧水的无菌棉签清洁颅骨表面，以观察颅缝。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位Bregma，即左右冠状缝在正中线与矢状缝交汇处（参见 图2).
	<ol>
		<li>使用无毒的彩色丙烯酸树脂和无菌木签或类似工具，在Bregma上方做一个非常小的标记。 
		注意：在某些情况下，左右冠状缝并不对称；此时，应使用“最佳拟合线”来估算它们在正中矢状面上的相交位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保动物头部位置没有倾斜或旋转（即处于水平平面）。
	<ol>
		<li>以颅骨前囟（Bregma）为立体定位零点。x 坐标表示内侧-外侧（ML）方向的位移，y 坐标表示前-后（AP）方向的位移，z 坐标表示背侧-腹侧（DV）方向的位移。</li>
		<li>确保Lambda与Bregma处于相同的DV平面（即，这两个标志点的z坐标均为0）。同样，在Bregma外侧+2.0 mm（x = 2）和-2.0 mm（x = -2.0）处，确保颅骨处于同一平面，DV/z坐标大致相等。确认颅骨固定牢固，调整后无任何移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在前囟（Bregma）前方 +2.0 mm（ML）和 +0.5 mm（AP）处钻颅骨孔图3).
	<ol>
		<li>使用立体定位钻孔装置附件，小心降低钻头尖端，直至其接触前囟，将坐标归零。</li>
		<li>略微抬起钻头，并将钻孔装置调整至相应前后（AP）和内外（ML）坐标位置。</li>
		<li>缓慢降低钻头，注意仅磨除颅骨。</li>
		<li>或者，使用立体定位仪中的微升注射器， lowering 针尖直至其接触前囟（Bregma），并将坐标归零。</li>
		<li>略微抬起针头，并调整至相应的前后（AP）和左右（ML）坐标。</li>
		<li>将尖端 lowered 至接触颅骨，并记录确切位置。</li>
		<li>将针头略微抬起，用外科标记笔在目标位置做一个小标记。</li>
		<li>抬起或旋转持针器以避开操作区域，使用手钻在颅骨上磨孔，注意避免损伤下方的脑组织。注意：通常情况下，雄性小鼠年龄越大，颅骨相对较厚，需要更长时间的钻孔。手钻操作时应谨慎进行，施加最小压力，因为颅骨突然破裂可能导致下方脑膜和/或脑组织受损。 
		注意：在激光间质热疗（LITT）过程中，需扩大颅骨钻孔以容纳热电偶探头。此步骤可在初次注射手术期间完成，有利于后续LITT手术更快、更顺利地进行。 Alternatively，也可在LITT手术过程中以相同方式扩大钻孔，这可能降低颅外肿瘤生长的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在注射位点外侧1.0 mm处（即+3.0 mm ML，+0.5 mm AP）为热电偶制作第二个颅骨钻孔。
	<ol>
		<li>按照前一步骤中所述的钻孔程序进行操作。</li>
		<li>为避免骨再生带来的困难，需去除两个孔之间的骨组织。 
		注意：建议以颅骨缝（Bregma）为参考点，采用 +2.0 mm ML、+0.5 mm AP 和 -2.5 mm DV 作为肿瘤植入的坐标。该位置位于尾状壳核上部，可实现稳定的肿瘤生长，且动物耐受性良好；然而，本方案也可根据需要调整至其他位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在微量注射器中制备CT2A小鼠胶质瘤细胞悬液（5000个细胞） 1.5 µL).
	<ol>
		<li>从冰上取出预先准备好的细胞微量离心管，用指尖轻轻弹击管底以重悬细胞。</li>
		<li>轻柔吸取 2 µL 到一个 5 µL 或 10 µL 注射器，注意避免产生气泡。</li>
		<li>表达 0.5 µL 以排除所有空气，确保针头已预充并正常工作。</li>
		<li>用酒精棉片擦拭针轴，以去除渗出的液体及针体外表面的细胞（这些细胞可能引起软脑膜肿瘤生长）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将注射器装入微量注射泵（或手动立体定位装置）中，缓慢降低针头。
	<ol>
		<li>将针头缓慢降至指定深度（z = -3.0 mm），并暂停 1 分钟。</li>
		<li>缓慢回撤针头0.5 mm（z = -2.50 mm），并注射细胞（≤ 0.5 µL/min用显微外科海绵棒保持注射器周围区域干燥，注意不要扰动针头。</li>
		<li>注射完成后至少等待 2 min，然后在 3–4 min 内缓慢撤出注射器。确保前 4–5 个撤出间隔的 100 µm 为防止细胞从其原始注射部位脱落，需缓慢回撤。</li>
		<li>使用酒精棉片轻轻擦拭针头外部，去除任何血液或液体，并根据制造商的说明冲洗和清洁注射器。在每次注射之间使用磷酸盐缓冲液（PBS）和蒸馏水，以确保针头不堵塞。注射完成后，用70%乙醇充分冲洗针头，以清除针头中残留的任何细胞。 
		警告：每次注射后未冲洗针头可能导致堵塞。若需注射多种细胞类型，应为每种细胞类型使用单独的针头，以避免可能的交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重新对合切口，注意使切口边缘稍外翻，以便下方真皮层相互接触。使用伤口夹或5-0缝线进行3针间断缝合关闭伤口。在闭合后的伤口处涂抹聚维酮碘溶液。</li>
	<li>将动物从立体定位仪中取出，放入垫有纸张的恢复笼内，并置于设定温度的加热垫上 37 °C确保动物呈胸卧位后，将其转移回饲养笼，笼底放置一小盘湿饲料。</li>
	<li>术后当天开始，至少每天两次监测动物状态，持续2天。分别在术后24小时、48小时和72小时重新给予美洛昔康，或根据机构指南执行。</li>
</ol>
<img alt="显示冠状缝、矢状缝、人字缝、前囟和人字点解剖位置的颅骨示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠颅骨及立体定位手术重要解剖标志的示意图。 使用 BioRender.com 创建 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="颅骨手术设置示意图，显示热电偶和激光光纤在前囟附近的位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颅骨钻孔与激光装置位置的示意图。 本图展示了前囟（Bregma）解剖标志、(A) 用于插入(A') 激光光纤的初始钻孔，以及(B) 用于插入(B') 热电偶探针的第二个（或延伸）钻孔之间的相对位置。右侧为激光光纤与热电偶探针的剖切示意图，显示探针如何通过一个带有预钻孔的立体定位末端足架进行固定，预钻孔的尺寸和间距均符合实验需求。图片使用 BioRender.com 制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. LITT 前肿瘤负荷监测（第 9 天）
<ol>
	<li>根据机构指南进行T2加权磁共振成像（MRI），以评估激光间质热疗（LITT）前一日的肿瘤生长情况。 
	注意：肿瘤直径应约为 1.5–2.0 mm。
	<ol>
		<li>使用以下参数获取小鼠全脑的合适冠状面扫描图像：快速自旋回波序列，TR = 5000 ms，TE = 45 ms，回波链数 = 7，视野（FOV）= 30 × 30 mm2矩阵大小 = 250 × 256，总层数 = 18，层厚 = 0.3 mm，信号平均次数 = 2。 
		注意：建议从移植后约第6天开始定期进行MRI检查，以确认异体移植是否成功并监测肿瘤生长情况——尤其是在初始实验阶段，因为操作步骤的细微变化都可能影响时间进程。CT2A具有高度侵袭性，需对动物进行密切观察。T2加权冠状位扫描对此目的效果良好。可联合使用荧光标记或荧光素标记的CT2A细胞与 体内 成像系统（IVIS）在无法获得小动物MRI设备时也可作为替代方案。然而，肿瘤的生长动力学及其他特征可能与本实验方案存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 激光间质热疗手术（第10天）
<ol>
	<li>同第2节所述，重复步骤2.1–2.13，准备动物以进行激光间质热疗（LITT）。 
	注意：由于物种差异及实验时间线的不同，前次手术后的伤口愈合可能处于不同阶段。再次制作切口时，需注意组织可能更薄或更脆弱。</li>
	<li>使用无菌棉签轻轻清洁颅骨，清除遮挡前囟点（Bregma）或先前钻孔部位的任何组织。如有必要，可重新钻孔；但由于CT2A肿瘤形成速度较快，骨组织再生极少或几乎没有。</li>
	<li>将LITT装置固定于立体定位仪框架后，以前囟点（Bregma）为基准，将激光光纤尖端的坐标归零。 
	警告：激光光纤极为脆弱，弯曲时易破裂。当光纤尖端接触颅骨时，应立即停止操作，避免过度下压。</li>
	<li>将光纤尖端略微上提，移动至目标的内-外（ML）和前-后（AP）坐标位置，然后缓慢将探针下降至目标背-腹（DV）坐标（2.0 mm ML，0.5 mm AP，-2.0 mm DV）。</li>
	<li>设定LITT治疗参数：模式：连续；功率：1 W</li>
	<li>通过脚踏开关将激光由待机切换至激活状态，并启动激光照射60秒。若温度超过46 °C，应短暂暂停，随后重新启动，尽量使温度维持在接近46 °C的水平。</li>
	<li>缓慢回撤激光组件，使用酒精棉签轻轻擦拭激光光纤和热电偶以清洁表面。将组件旋转移开时，注意避免探针与框架发生接触。</li>
	<li>按照上述肿瘤植入后所述的步骤2.18–2.20，缝合伤口并恢复动物。</li>
</ol>
5. 激光间质热疗后评估（第11天）
<ol>
	<li>在 LITT 治疗后的次日进行 LITT 术后 T2 加权 MRI 扫描，使用上述第 3.1 步中的序列和参数评估 LITT 肿瘤消融是否成功。 
	注：此外，液体衰减反转恢复（FLAIR）序列也可用于评估术后水肿。</li>
	<li>在研究结束前进行随访扫描，以监测治疗后的变化或肿瘤再生长情况。</li>
</ol>
6. 研究结束时（第11天/第15天/第20天）
<ol>
	<li>根据机构指南，在选定的实验终点处死动物。 
	注意：对于CT2A模型，即使接种细胞数量极低，超过第20天的实验终点也无法实现，因为对照组动物（即假手术或无治疗）以及部分治疗组动物可能已处于濒死状态，需要实施安乐死。如需进行更长时间的实验，建议考虑其他小鼠胶质瘤细胞模型。</li>
	<li>采集组织用于固定和后续处理。
	<ol>
		<li>使用4%多聚甲醛（PFA）进行心脏灌注，并采集目标组织。</li>
		<li>将脑组织在4% PFA中4 °C下浸泡固定过夜。</li>
		<li>按照标准流程对样本进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或固定后冷冻分析处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 分析
<ol>
	<li>使用 T2 加权 MRI 验证 LITT 消融是否成功，并通过苏木精-伊红染色等基本组织学技术进行验证。</li>
	<li>根据实验需要进行其他附加分析（例如，免疫组织化学、免疫荧光）。</li>
</ol>

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我们感谢Monteris Medical提供的支持，包括激光设备的实物捐赠。

关于激光间质热疗（LITT）的文献正在迅速增长；然而，这些研究主要局限于人类临床病例报告或病例系列。事实上，已有若干研究表明LITT具有潜在优势，包括术后并发症发生率和治疗成本较低，同时可实现相当的无进展生存期7,8,9,10,11。此外，LITT治疗后局部复发减少，并提高了全身药物治疗的效果，尽管其机制尚不完全清楚12。LITT在胶质母细胞瘤以外的其他临床应用也展现出良好前景，包括治疗转移性肿瘤及其他肿瘤类型3,12、放射性坏死13、难治性癫痫14、血管畸形15，甚至强迫症16。然而，目前基于小鼠模型的研究仍极为有限，仅有少数例外，且这些研究可能难以重复。例如，一项近期关于LITT治疗后血脑屏障通透性变化的研究使用了在欧洲用于临床的激光发生器，但该设备未获北美地区批准17。尽管该系统似乎适用于相关研究，但大多数研究人员难以负担其成本，且其专有或高度工程化的设计特征难以复制。因此，建立一套可及且优化的临床前动物模型详细操作方案，将为相关研究提供宝贵的机会。
本方案中的关键步骤包括准确定位前囟，以确保在同种异体移植及后续的激光间质热疗（LITT）消融手术中实现可重复的靶向操作。此外，细胞注射步骤中的递送速度和暂停操作尤为关键，对成功移植肿瘤细胞至关重要；若操作不当，将显著增加颅外肿瘤生长和肿瘤异质性升高的风险。还需特别强调，LITT手术应在肿瘤仍相对较小（即直径约1.5–2.0 mm）时进行规划。根据我们的经验，CT2A肿瘤在体积较大时形态往往更加不规则，而过大的肿瘤也会增加脑组织取出的难度，尤其是当肿瘤&#160;已生长穿透皮质表面时。此外，值得注意的是，即使仅间隔24小时（例如治疗前MRI与LITT手术之间），也足以发生显著的CT2A胶质瘤持续生长。
本方案可根据其他实验设计轻松进行多种修改。特别是，本方案重点介绍了在C57BL/6小鼠中成功实施原位移植和激光间质热疗（LITT）手术所需的技术步骤。&#160;同源CT2A小鼠模型。然而，所描述的模型可根据不同的实验目标轻松替换。对于需要较长时间点的实验，例如涉及先天性和适应性免疫应答的研究，可采用侵袭性较低的同源癌细胞系（如K1491）。此外，对于不侧重于适应性肿瘤-宿主反应的实验，可在免疫缺陷小鼠模型中使用患者来源的细胞系或其他异种移植模型作为可行替代方案。对于感兴趣的读者，Haddad等（2021）对几种常用同种异体移植和异种移植胶质瘤小鼠模型的优势与局限性进行了全面综述。4另一种简单的修改方式是根据机构的可用资源和指南，将吸入式麻醉剂替换为注射类替代物，例如氯胺酮与赛拉嗪的组合 &#177; acepromazine。然而，当可使用吸入性麻醉剂及相关设备（即立体定位鼻罩）时，我们出于多个原因推荐使用后者。首先，我们认为吸入性麻醉剂更为安全，因其无需腹腔注射，无需在手术时间较长或操作较复杂时重复给药，且可在较宽的安全范围内轻松调节剂量18此外，吸入性麻醉剂无需使用管制药品，且在手术后可实现快速苏醒和恢复。
本方案的故障排除应较为简单，大多数问题源于注射技术不佳，导致肿瘤形成不规则或颅外生长。激光间质热疗（LITT）的靶向问题可通过准确定位解剖标志、妥善固定激光光纤，以及在插入过程中仔细观察激光光纤位置以确保其未触碰钻孔侧壁而发生偏移，从而予以纠正。
该方法的局限性包括：操作过程需要具备中等到高级别的外科及技术熟练度，需使用小动物磁共振成像仪等专用设备，以及正位移植流程耗时较长，这些因素均限制了单日内可完成的注射次数。由于本方案旨在建立高级别胶质瘤的临床前模型，因此也存在某些固有局限，例如某些胶质瘤细胞系（如CT2A）具有更强的侵袭性。通过采用低细胞数接种、在纹状体内进行深部注射、精细的注射技术以及早期治疗，有助于减轻这些问题，但仍可能出现偶发的颅外生长或不规则肿瘤生长，因此建议采用较短周期的实验设计。如前所述，使用侵袭性较低的细胞系对本方案进行修改也较为简便。
据我们所知，本实验方案是目前唯一一份关于胶质母细胞瘤激光间质热疗（LITT）的临床前小鼠模型的详细描述，对于建立完善的模型以推动未来基础科学研究具有重要意义。

癌症是加拿大死亡人数最多的首要死因。胶质母细胞瘤（GB）是最常见的侵袭性脑肿瘤，占成人所有高级别原发性脑肿瘤的48%至60%1GB的预后尤其严峻，5年净生存率仅为4.8%&#160;与&#160;常规治疗，包括手术切除、化疗和放疗1,2.
激光间质热疗（LITT）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方法，利用激光对无法手术的脑肿瘤患者进行原位高温肿瘤消融，为传统手术切除提供了一种有吸引力的替代治疗方案3。然而，目前尚缺乏针对胶质母细胞瘤（GB）LITT治疗的详细且特征明确的小鼠模型，这阻碍了临床前研究的开展。
本方案旨在展示一种经优化的用于胶质母细胞瘤（GB）激光间质热疗（LITT）的临床前小鼠模型。我们选择使用C57BL/6小鼠及其同源胶质瘤细胞系CT2A，主要是因为CT2A在组织学特征、侵袭性、化疗和放疗耐药性以及具有自我更新能力和肿瘤再形成能力的干细胞样特性方面，能够很好地模拟人类高级别胶质母细胞瘤4。这些特性为涉及免疫反应或新型治疗策略的多种研究提供了优良的实验平台。此外，本LITT方案的技术细节也可轻松适用于其他同种异体移植和异种移植小鼠模型4,5,6，相关内容将在下文进一步讨论。
本方案的优势在于采用了一种简单而有效的激光间质热疗（LITT）治疗模式，可获得稳定一致的结果。所使用的1064 nm掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器，与目前两种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的临床系统之一所用的设备相同，因而可使实验条件与LITT在高级别胶质瘤治疗中的临床应用高度一致。本方案的主要缺点是在肿瘤细胞植入和LITT治疗过程中必须极为谨慎，以确保结果的可重复性。此外，由于CT2A细胞系具有高度侵袭性，该方案对时间要求极为严格。大多数实验最长需在20天内完成，这可能限制对某些适应性免疫应答或其他在较长时间尺度上发生的细胞与分子机制的深入研究。

<table><tbody><tr><td>吸收性海绵棒</td><td>FST</td><td>18105-01</td><td>止血海绵。</td></tr><tr><td>阿德森组织镊</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系 #000664</td><td>6 至 12 周龄的雄性和雌性</td></tr><tr><td>棉签（6&quot;）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>CT2A 胶质瘤细胞系</td><td></td><td></td><td>由杜克大学 Peter Fecci 博士慷慨捐赠。</td></tr><tr><td>Cultrex 低生长因子基底膜提取物，PathClear</td><td>Biotechne, R&amp;D systems</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，HEPES</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>双腔载玻片&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管（2.0 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 70%</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，加拿大来源</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Glad Press-n-Seal 塑料保鲜膜</td><td>Amazon.ca</td><td>12587704417</td><td></td></tr><tr><td>高速钻机</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号 1474</td><td></td></tr><tr><td>K &amp; J 热电偶温度计</td><td>Omega</td><td>HH509R</td><td></td></tr><tr><td>美沙酮（美洛昔康）</td><td>WDDC</td><td>114424</td><td></td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>WPI</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>微升注射器（700 系列）</td><td>Hamilton</td><td>87908</td><td>可提供定制针头。针尖斜面较陡有助于精确给药，较短的针头长度有助于提高稳定性。</td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td>由于操作空间受限，细尖头最为合适，但也可根据手柄偏好选择多种类型。</td></tr><tr><td>Opixcare Plus 眼科软膏</td><td>WDDC</td><td>135941</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10x）</td><td>Fisher bioreagents</td><td>BP399-4</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 1x</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3955-16</td><td>分装至小管中，便于与带棉头的涂抹棒配合使用。</td></tr><tr><td>生理盐水（正常）</td><td>WDDC</td><td>126588</td><td></td></tr><tr><td>手术刀，一次性使用（#15 刀片）</td><td>Feather</td><td>Feather NO15</td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td>精细学生剪、虹膜剪或 Bonn 剪均适用。</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号 940</td><td>配备数字显示控制台、小鼠鼻锥和耳杆。</td></tr><tr><td>立体定位注射器固定架</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号 1772-F</td><td>若不使用注射泵时使用。</td></tr><tr><td>缝合线（5-0 单股）</td><td>Ethicon</td><td>MCP463G</td><td>紫色单股 Monocryl 缝线，带反向切割针尖</td></tr><tr><td>注射器，28 G&amp;nbsp;（0.5 mL）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>BD 329461</td><td>BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器</td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>热电偶探头，细直径（K 型）</td><td>Omega</td><td>TJM-CA316-IM025G-150</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond 兽用组织胶&amp;nbsp;</td><td>WDDC</td><td>126125</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Peanut 毛发修剪器</td><td>WDDC/Wahl</td><td>100963</td><td>也可直接从制造商处购买。</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Bensen Medical</td><td>70308/121873</td><td>任何类似产品均可使用。</td></tr><tr><td>Webcol 酒精消毒片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>71005-20</td><td>酒精消毒擦拭片，双层，中等尺寸。</td></tr></tbody></table>

一种用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

胶质母细胞瘤（GB）是原发性脑癌中最具有侵袭性的类型，约占成人所有高级别原发性脑肿瘤的50%，目前尚无治愈手段。激光间质热疗（LITT）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗GB的方法，适用于不适合接受传统手术切除的患者。尽管LITT的临床疗效已得到证实，但除临床病例报告和病例系列研究之外的相关研究仍十分有限，主要受限于缺乏成熟的动物模型。本实验方案采用C57BL/6小鼠和同源CT2A胶质瘤细胞系，以高度模拟人类GB&#160;，同时使用波长为1064 nm的掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器——该激光器与目前两种FDA批准的LITT系统之一所用设备相同，因而具有良好的临床前相关性。成功建立该LITT小鼠模型将为深入研究LITT消融的独特特征及其对肿瘤微环境的影响提供一个有价值的平台，有望推动更优治疗策略的发展。

成功的CT2A肿瘤植入和LITT治疗可通过T2加权MRI进行表征，如图4、图5和图6所示。MR图像使用一台7T无液氦超导磁体（17 cm孔径）配合四通道小鼠头部线圈获取，成像序列参数遵循上述方案中的描述。严格遵循本方法可实现接近100%的成瘤率、稳定的肿瘤定位以及大致呈球形的肿瘤形态，如图4所示。这些特征为后续的LITT治疗及进一步分析提供了理想的基础。同样，如图5所示，LITT消融灶在大小和位置上也应保持一致。消融组织的中心区域由凝固性坏死和液化性坏死构成，在T2加权MRI上表现为低信号（即黑色），易于识别。在LITT治疗后的短期内，根据具体治疗参数的不同，病灶内部及周围通常还会出现高信号（即白色）区域，对应于术周水肿。图6展示了一例不良结果，突显了执行本方案时可能遇到的一些潜在问题。
<img alt="突出显示肿瘤生长的脑部 MRI 扫描序列，诊断成像分析阶段 A-C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：理想的 CT2A 肿瘤形成的 T2 加权冠状位磁共振成像。形成。 三只 C57BL/6 小鼠在植入后第 12 天肿瘤形成的代表性图像（A、B、C）。白色箭头指示肿瘤边界。请注意肿瘤位置的一致性以及大致呈球形的结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MRI脑部扫描显示肿瘤进展的三个阶段；示意图用箭头标出肿瘤区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：理想LITT消融术后1天的T2加权冠状位MR图像。 三只C57BL/6小鼠在植入后第13天接受LITT肿瘤消融的代表性图像（A，B，C）。可见坏死病灶核心的大小和位置具有一致性。若在LITT术前稍早进行MRI扫描并实施消融，将更有利于在激光靶向所需的最佳肿瘤大小与获取较晚治疗后终点数据的能力之间达到更好平衡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肿瘤的脑部MRI扫描图像；矢状面；医学影像分析；诊断工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：优化前LITT治疗的T2加权冠状面磁共振图像。三只C57BL/6小鼠（A，B，C）接受相同的激光参数和立体定位靶点治疗，此为非理想结果的示例，图像采集于方案优化之前。白色箭头指示肿瘤边界。带边区域显示水肿范围。可见显著的变异性，包括肿瘤生长不均以及激光消融靶向性差，导致组织损伤不一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

胶质母细胞瘤是一种破坏性极强的原发性脑癌，而激光间质热疗正逐渐成为无法手术切除的胶质母细胞瘤的一种有前景的替代传统手术切除的治疗方法。本方案描述了一种优化的临床前小鼠模型，可用于研究治疗效果或辅助治疗与联合治疗方案。

胶质母细胞瘤（GB）是原发性脑癌中最具有侵袭性的类型，约占成人所有高级别原发性脑肿瘤的50%，并且……

我们的研究聚焦于成人脑肿瘤，包括胶质母细胞瘤原发性胶质瘤以及脑转移瘤。我们已建立了脑肿瘤小鼠模型，旨在为患有这些致命性疾病的患者寻找更有效的治疗方法。胶质母细胞瘤是最严重且最常见的原发性脑肿瘤。在超过20%的胶质母细胞瘤患者中，该脑肿瘤无法通过手术切除。在这些情况下，临床上采用激光间质热疗（Laser Interstitial Thermal Therapy，简称LITT）来靶向治疗这些侵袭性脑肿瘤。LITT 是一种热消融组织技术，临床上用于治疗手术难以到达的脑肿瘤。我们利用 LITT 小鼠模型开展的研究将为肿瘤及周围脑组织对热疗的组织和细胞反应提供重要信息。更深入地理解 LITT 在脑内引起的分子和细胞变化，将有助于我们更有效地应用 LITT，从而改善脑肿瘤患者的治疗效果。最关键的实验挑战是准确地定位和治疗肿瘤。与临床上用于人类患者的LITT手术不同，大多数动物模型缺乏实时MRI成像，这使得在没有视觉辅助的情况下难以精确定位肿瘤。首先，记录麻醉小鼠的体重，以计算正确的药物剂量。小心剃除手术区域的毛发，避免触碰眼睛、耳朵和胡须。将小鼠的门齿放入咬合杆的孔中，并调整立体定位仪鼻锥的位置，直至其紧密贴合，然后拧紧固定螺钉以确保其固定到位。通过双侧后肢脚趾夹捏来检查麻醉深度。当小鼠被适当麻醉后，使用耳杆固定颅骨，并调整头部至中立水平位置。在两只眼睛上充分涂抹眼膏，以防止角膜干燥。使用28号半英寸注射器，皮下注射美洛昔康以缓解疼痛。降低麻醉速率以维持目标呼吸频率。接下来，无菌铺巾覆盖小鼠。使用无菌棉签，从内侧开始向外涂抹氯己定消毒液。然后使用新的无菌棉签，以同样方式涂抹70%乙醇。通过监测呼吸频率重新检查麻醉深度。接着使用15号刀片手术刀，在眼睛稍后方开始，沿头尾方向做一条1.0至1.5厘米长的正中矢状切口。现在，使用无菌棉签将伤口边缘轻轻拨开，以暴露颅骨。轻柔地擦去该区域的任何结缔组织。如有必要，可使用浸有双氧水的无菌棉签清洁，以暴露颅骨表面并观察人字缝。定位左右冠状缝与矢状缝交汇处的前囟点。为便于在LITT手术期间重新定位前囟点，可选使用无毒彩色丙烯酸树脂和无菌木签，在前囟点上方做一个小标记。将微量注射器安装至定位仪框架后，调整立体定位坐标至零，使针尖轻触前囟点。X 坐标表示内侧-外侧平面上的移动，Y 坐标表示前-后方向的移动，Z 坐标表示背侧-腹侧平面上的移动。确保λ点与前囟点位于相同的背侧-腹侧平面，即这两个解剖标志点的 Z 值均为零。如果需要进行调整，请使用无菌棉签轻轻施加压力，同时确保颅骨仍被牢固固定。将针尖置于目标区域上方，位置为前囟点外侧2.0毫米、前后方向+0.5毫米的坐标处。小心降低钻头尖端，直至接触颅骨。略微抬起针尖，使用无菌外科标记笔在开颅位置做一个小点标记。接下来，将针头略微上提，使其避开操作区域，然后在标记的位置钻孔，注意仅穿透颅骨，避免损伤下方的脑膜。在内侧-外侧方向+3.0毫米、前-后方向+0.5毫米处制作第二个颅骨钻孔，或扩大原始孔至该坐标位置，以便在激光间质热疗（LITT）过程中容纳热电偶。随后，从冰上取出含有CT2A小鼠胶质瘤细胞的微量离心管，用指尖轻轻弹击管壁，以重新悬浮细胞。使用5或10微升的注射器，轻轻吸取约2微升的细胞悬液。从注射器中排出0.5微升液体以去除任何气泡。用酒精棉片擦拭针头表面，以清除残留的液体或细胞。将针头缓慢降至 Z 轴负 3 毫米深度，暂停 1 分钟。然后将针头缓慢回撤 0.5 毫米，并以 0.5 µL/min 的速度注射细胞。注射完成后，等待 2 分钟，再于 3 至 4 分钟内缓慢回撤注射器。在最初的几个100至250微米间隔后暂停最多一分钟，有助于防止细胞移位。关闭伤口切口时，应使切口边缘重新对合。使用50号缝线进行三个间断缝合，在缝合伤口时轻微外翻切口边缘，以确保下方真皮层相互接触。将聚维酮碘溶液涂抹于闭合的伤口，并将小鼠转移至铺有纸巾的恢复笼中，笼子置于设置为37摄氏度的加热垫上。当动物恢复胸卧位后，可将其转移回其原饲养笼中。在注射CT2A小鼠胶质瘤细胞悬液9天后，将麻醉的小鼠固定于立体定位仪框架中。重新做一个正中切口，使用无菌棉签清洁颅骨，以清除任何遮挡前囟的组织。将激光间质热疗（Laser Interstitial Thermal Therapy，LITT）附件安装在立体定位仪上后，以前囟处为原点，将激光光纤尖端的坐标归零。接着，轻微抬高激光光纤尖端，并移动至预期的内侧-外侧和前-后坐标位置。然后缓慢将探针降至目标背腹坐标位置，以到达靶点。将LITT治疗参数设置为连续模式，功率为1 W。接下来，通过脚踏开关将激光从待机状态切换至激活状态，并持续照射60秒。如果温度超过46摄氏度，应短暂暂停，然后重新启动，目标是将温度维持在接近46摄氏度。最后，缓慢撤回激光组件。使用酒精棉签轻轻擦拭激光光纤和热电偶，使其清洁。将组件旋转至一旁，确保探头不与框架接触。T2加权角膜磁共振成像显示肿瘤移植成功，成瘤率接近100%，且肿瘤呈一致的球形生长。激光间质热疗（LITT）治疗产生了稳定的消融区域，表现为明确的高信号黑色区域，提示中心部位组织坏死，周围伴有高信号白色区域，显示围手术期水肿。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型

将GL261细胞颅内植入C57BL/6小鼠可诱导生成恶性胶质瘤，其特征与人类多形性胶质母细胞瘤的多种典型特征相似。我们采用稳定表达荧光素酶的GL261细胞，以便通过体内成像技术监测肿瘤进展过程。本文展示了手术操作及三维体内成像方法。...

颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

我们介绍一种集成方法，用于将人多形性胶质母细胞瘤细胞精确、立体定向地植入裸鼠脑内，并进行后续系列 体内...

立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

从胶质母细胞瘤的小鼠模型开始，这是一种侵袭性脑肿瘤。在肿瘤边缘，血脑屏障（BBB）保持完整，内皮细胞形成紧密连接，调控分子的进入。小鼠佩戴有头部固定的光纤，用于递送激光。施用低强度红外激光，该激光可穿透皮肤和颅骨以到达大脑。激光激发脑细胞中的分子氧，产生活性氧（ROS）。由此产生的氧化应激会破坏紧密连接，增加血脑屏障的通透性。血脑屏障的液体渗漏会增强围绕脑细胞和血管的脑组织间液（ISF）的流动。静脉注射脂质体悬浮液，脂质体是专为药物递送设计的纳米级囊泡。脂质体穿过受损的血脑屏障，增强的脑间质液流动促进了其在肿瘤内的分布和聚集。随着时间的推移，紧密连接蛋白的表达恢复了血脑屏障的完整性，并防止进一步渗漏。...

激光诱导血脑屏障开放用于脂质体递送至胶质母细胞瘤小鼠模型

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

免疫活性小鼠胶质母细胞瘤模型的生物发光成像

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内...

胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

本方案介绍了在实体瘤模型中实施靶向热疗所必需的技术与方法。该方法利用瘤内注射的金纳米棒对近红外光的光热转换作用，从而在肿瘤微环境中诱导局部加热。...

通过瘤内注射金纳米棒介导近红外光的光热转换在小鼠肿瘤模型中诱导靶向性轻度高热

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

了解激光间质热疗技术治疗胶质母细胞瘤的免疫活性小鼠模型构建方法。该模型为研究热消融治疗反应及联合疗法提供了重要的临床前实验平台。

一种用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型

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