Name: 基于流式细胞术的胰腺癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞的分离和治疗评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习基于流式细胞术分离和过继转移肿瘤浸润淋巴细胞的方法，用于胰腺癌小鼠模型的免疫治疗评估。该技术为优化T细胞疗法和推进临床转化研究提供标准化方案。

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本研究由国家自然科学基金（NSFC）资助，资助编号为82272767和82072691，授予Y.M.。作者感谢团队成员的讨论与合作。

小鼠群体饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证的设施中，严格遵守所有相关的美国农业部（USDA）、美国卫生与公共服务部（HHS）以及美国国立卫生研究院（NIH）的法规与标准。天津医科大学肿瘤研究所和医院动物护理与使用委员会已审查并批准了所有动物实验操作，包括品系选择的依据、实验分组安排，以及动物数量和随机化方案的统计学依据。
1. 肿瘤诱导
<ol>
	<li>使用 KPC-Luc 细胞系11 在小鼠体内诱导原位胰腺肿瘤。</li>
	<li>通过胰酶消化KPC-Luc细胞，用PBS洗涤两次，重悬于浓度为1 x 10⁶个/mL的细胞悬液6 细胞/mL，溶于含30%基底膜基质（BMM）的PBS中。</li>
	<li>使用异氟烷以4%的诱导剂量对小鼠进行麻醉，随后切换至2%的维持剂量。使用加热垫提供保温，并根据需要进行监测。在两只眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。</li>
	<li>使用碘伏和酒精以环形方式多次消毒手术区域。术前给予5 mg/kg剂量的卡洛芬皮下注射以镇痛。使用无菌手术刀片，在小鼠左侧肋骨下方做一小型左腹部切口（0.5–1 cm），暴露胰腺。</li>
	<li>用镊子夹住小鼠脾脏以暴露小鼠胰腺，将细胞混匀后注入小鼠胰腺，每只小鼠注射50,000个细胞。使用29 G针头将50 µL细胞悬液直接注射入胰腺。</li>
	<li>将小鼠胰腺复位，并依次用缝线缝合腹膜和皮肤。</li>
	<li>将小鼠置于保温垫上，直至其完全苏醒。术后每天皮下注射5 mg/kg卡洛芬，连续3天，以提供镇痛。</li>
	<li>注射后7天进行活体成像以监测肿瘤生长。 
	注意：此步骤可进行处理。
	<ol>
		<li>腹腔注射小鼠D-荧光素钾盐（15 mg/mL，溶于PBS，每只小鼠60 µL）。</li>
		<li>在异氟烷麻醉后，将小鼠置于 体内 用于生物发光检测的成像系统。成像完成后，将小鼠从系统中取出，并使其从麻醉状态自然恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 收集肿瘤
<ol>
	<li>使用 CO2 麻醉箱处死供体小鼠。用 75% 乙醇对整个小鼠身体进行消毒。</li>
	<li>将小鼠置于无菌操作台中。使用无菌剪刀和镊子打开腹腔。</li>
	<li>取出肿瘤并将其放置在冰上的 PBS 中。使用&#160;游标卡尺测量肿瘤尺寸，并通过公式 (π × 长 × 宽 × 宽)/6 计算肿瘤体积。</li>
</ol>
3. 肿瘤消化
<ol>
	<li>通过将0.125 mg/L&#160;胶原酶、0.125 mg/L&#160;Dispase II和10 μg/mL&#160;DNase I溶于RPMI 1640培养基中，配制成1x浓度的消化液。在12孔板中，每孔加入1–2 mL消化液。</li>
	<li>使用无菌剪刀将肿瘤组织剪成小块。于37°C、70 rpm振荡条件下消化30分钟。</li>
</ol>
4. 细胞收集
<ol>
	<li>加入 2-4&#160;mL 10% 胎牛血清以终止消化。将所有细胞转移至收集管中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤孔板两次，以收集残留的细胞。将细胞悬液通过 40 µm 或 70 µm 细胞筛过滤。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟收集细胞。用 5% BSA 重悬细胞，用于流式细胞术染色。</li>
</ol>
5. 流式细胞术样品制备
<ol>
	<li>从无肿瘤小鼠中制备脾脏或外周血单个核细胞（PBMCs）作为对照。 
	注意：可选：也可使用荷瘤小鼠的PBMCs作为对照。</li>
	<li>用Fc阻断剂（&#60;1 μg/百万个细胞）和流式抗体（CD3-APC，CD45-APC/Fire750，1:100稀释）对细胞进行染色。</li>
	<li>冰上避光孵育30分钟，用冷PBS洗涤两次，将细胞重悬于含1% BSA的PBS中。</li>
</ol>
6. 细胞分选
<ol>
	<li>使用流式细胞仪分选 CD45+CD3+ 细胞。根据 FSC-A 和 SSC-A 对活细胞设门（P1），然后根据 FSC-A 和 FSC-H 对 P1 中的单细胞设门（P2）。</li>
	<li>最后，利用 CD45 和 CD3 设门从 P2 中分选 CD45+CD3+ 细胞，并将其收集至收集管中。分选过程中应确保细胞充分重悬并维持细胞活性。</li>
</ol>
7. 转移用细胞的制备
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 ×&#160;g 离心 5 分钟，沉淀分选后的细胞。用小鼠血清重悬细胞，终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。将细胞置于冰上保存。 
	注意：ex vivo 培养或活化分选后的细胞可按需进行。</li>
</ol>
8. 过继性转移
<ol>
	<li>在细胞移植前7天对受体小鼠进行肿瘤诱导。</li>
	<li>使用29 G × 1/2&#34;胰岛素注射器，每只受体小鼠腹腔注射2 × 105个细胞。连续3天每天腹腔注射IL-2（每只小鼠50 IU）。</li>
</ol>
9. 肿瘤监测
<ol>
	<li>在移植后的第4天和第7天进行活体成像，以评估肿瘤生长情况，并按照步骤1.8中所述的相同程序每周继续进行活体成像。</li>
	<li>随访受体小鼠的存活情况。实验结束时，按照前述方法处死小鼠，使用眼科剪刀和镊子取出肿瘤，将其置于冰上PBS中，迅速测量肿瘤大小，并可根据需要继续进行后续实验。</li>
</ol>

Adoptive Therapy Using Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Pancreatic Cancer Models

<ol><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+PD-1+inhibitor+and+OX40+agonist+induces+tumor+rejection+and+immune+memory+in+mouse+models+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).</li>
<li>Pitt, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tumor+microenvironment%3A+Removing+obstruction+to+anticancer+immune+responses+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy.</a> Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy%3A+Understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).</li>
<li>Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+regulatory+t+cells+as+targets+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy.</a> Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).</li>
<li>Betof Warner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+guidelines+on+management+and+best+practices+for+tumor-infiltrating+lymphocyte+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy.</a> J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+the+adoptive+immunotherapy+of+cancer+with+tumor-infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.</a> Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).</li>
<li>Leidner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoantigen+t-cell+receptor+gene+therapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer.</a> N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).</li>
<li>Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLowery%2C+FJ+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 375 (6583), 877-884 (2022).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+immunotherapy+for+patients+with+solid+epithelial+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers.</a> Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).</li>
<li>Yossef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+signatures+of+circulating+neoantigen-reactive+cd8%2B+t+cells+in+patients+with+metastatic+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers.</a> Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).</li>
<li>Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mast+cell-stromal+cell+interactions+promote+growth+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer.</a> Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+first+tumour-infiltrating+lymphocyte+%28til%29+therapy%2C+bolstering+hopes+for+cell+therapies+in+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers.</a> Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).</li>
<li>Morotti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2+inhibits+til+expansion+by+disrupting+IL-2+signalling+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function.</a> Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).</li>
<li>Chupp, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+that+mounts+mature+class-switched%2C+hypermutated+and+neutralizing+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses.</a> Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).</li>
<li>Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. 29 (6), 1336-1337 (2023).</li>
<li>Wang, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-infiltrating+CD8%2B+T+cells+are+predominantly+a+clonally+expanded+GZMK%2B+effector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population.</a> Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transformable+supramolecular+bispecific+cell+engager+for+augmenting+natural+killer+and+t+cell-based+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy.</a> Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。在使用 ChatGPT 和 Claude-3 进行语言润色时，作者在将 ChatGPT 或 Claude-3 生成的词句纳入文章之前，已对其内容进行了仔细审阅和验证。

针对胰腺癌的潜在免疫疗法可能通过增强免疫系统来靶向并清除肿瘤细胞，包括过继性免疫疗法、免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗12。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法从肿瘤组织中提取淋巴细胞并进行扩增，随后将其回输给患者。与其他过继性细胞疗法相比，TIL疗法具有多样化的T细胞受体克隆性、更强的肿瘤归巢能力以及较低的脱靶毒性，因此在治疗实体瘤方面具有优势13。
Rosenberg6 和同事从小鼠中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs），并用IL-2进行扩增 体外，并将其回输至转移性黑色素瘤患者体内，显示出显著的抗肿瘤反应。这一成功推动了TIL相关临床试验在多种实体瘤中的进一步开展。然而，多项临床试验表明，TIL疗法在实体瘤中的疗效和稳定性仍需提高。9,13研究人员正在不断改进TIL治疗效果。本研究聚焦于胰腺癌，旨在通过小鼠实验为...

胰腺癌的免疫治疗尚处于初期阶段，目前主要在小鼠模型中进行持续的临床前探索与验证1。当前胰腺癌的治疗方法包括手术、化疗、放疗和靶向治疗。然而，这些方法往往无法彻底清除肿瘤病灶，导致肿瘤复发和进展。传统治疗主要针对肿瘤细胞，却常常忽视肿瘤微环境（TME），而TME不仅包含肿瘤细胞，还包括由肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、成纤维细胞和细胞外基质组成的相关间质2。TILs是存在于TME中的免疫细胞，包括细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞以及髓源性抑制细胞3。这些细胞参与调控免疫反应，影响肿瘤的生长及治疗效果4。
过继性细胞治疗（ACT）涉及收集患者的免疫细胞，对其进行修饰和扩增 体外，然后重新引入体内以靶向并杀伤肿瘤细胞。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗是一种过继性细胞疗法（ACT），目前正被研究用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、肺癌和宫颈癌。该过程包括从肿瘤组织中分离淋巴细胞，并在体外用IL-2进行培养 体外，并在化疗或放疗进行淋巴细胞清除后，将其重新输注回患者体内5.
自从 Rosenberg 于 1986 年的研究证明了肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在小鼠中的有效性以来6，过继性细胞转移免疫疗法已成为研究热点，并在癌症治疗中展现出良好前景7,8,9,10。我们的目标是从小鼠中提取 TILs，通过流式细胞术分选特定的 T 细胞，并通过过继性转移验证其杀伤肿瘤的效果。
在本实验方案中，我们描述了一种利用流式细胞术从小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中分离细胞并进行过继性细胞转移的方法。该方法旨在验证TILs在同基因型胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，从而为胰腺癌的过继性细胞治疗开发提供依据。本方法包括将活体或经辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告基因小鼠体内以诱导免疫细胞浸润，通过流式细胞术分选从原发肿瘤中分离淋巴细胞，或激活并扩增肿瘤反应性T细胞。 离体，并将这些活化的T细胞过继转移至荷瘤小鼠体内。随后给予白细胞介素-2并进行生物发光肿瘤成像，可对原位肿瘤的生长及治疗反应进行长期监测，尤其用于评估肿瘤特异性的细胞毒性效应。该方法重现了开发针对胰腺癌患者过继细胞转移疗法所涉及的操作流程。实验结果表明，与无关淋巴细胞对照组相比，过继转移的肿瘤反应性T细胞具有更强的抗肿瘤疗效。这一多功能方法能够实现 体内 胰腺癌的过继性免疫治疗研究，以及细胞处理参数和联合治疗方案的优化。

<table><tbody><tr><td>生物发光成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>IVIS Spectrum</td><td>用于监测肿瘤生长</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td>用于细胞重悬</td></tr><tr><td>细胞筛（40 &amp;mu;m 或 70 &amp;mu;m）</td><td>Jet</td><td>CSS013040</td><td>用于过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>用于细胞收集与制备</td></tr><tr><td>CO2 安乐死舱</td><td>天津利良</td><td>N/A</td><td>用于小鼠安乐死</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>用于消化液配制</td></tr><tr><td>CD3-APC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td>用于流式细胞术染色</td></tr><tr><td>CD45-APC/Fire750 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100154</td><td>用于流式细胞术染色</td></tr><tr><td>C57BL/6 白化小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>58</td><td>供体与受体小鼠</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>用于消化液配制</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SparkJade</td><td>AC1711</td><td>用于消化液配制</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>碧云天</td><td>ST198-10g</td><td>用于活体成像</td></tr><tr><td>乙醇（75%）</td><td></td><td>N/A</td><td>用于消毒灭菌</td></tr><tr><td>Fc 阻断剂</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>用于流式细胞术染色</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>IL-2（白细胞介素-2）</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td>用于细胞回输后给药</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>山东安特</td><td>N/A</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>KPC-Luc 细胞系</td><td>PI 实验室构建</td><td>N/A</td><td>用于诱导原位胰腺肿瘤</td></tr><tr><td>Matrigel 基质胶</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>用于原位移植</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500ML</td><td>用于洗涤和重悬细胞</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>用于配制消化液</td></tr><tr><td>无菌操作台</td><td>ESCO</td><td>N/A</td><td>用于无菌肿瘤提取与处理</td></tr><tr><td>无菌剪刀和镊子</td><td></td><td>N/A</td><td>用于肿瘤取出</td></tr><tr><td>缝合线（4-0，PGA 可吸收缝线）</td><td>金环医疗</td><td>R413</td><td>用于伤口闭合</td></tr><tr><td>注射器</td><td>江西丰林</td><td>1 mL 0.45 &amp;times; 16RWLB</td><td>用于注射</td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>Jet</td><td>TCP001012</td><td>用于肿瘤消化</td></tr></tbody></table>

基于流式细胞术分离及在胰腺癌小鼠模型中对肿瘤浸润淋巴细胞进行治疗效果评估

Flow Cytometry-Based Isolation and Therapeutic Evaluation of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in a Mouse Model of Pancreatic Cancer

胰腺癌是一种侵袭性强、预后极差且治疗选择有限的恶性肿瘤。过继性细胞治疗作为一种有前景的实验性方法，涉及分离并激活患者自身的免疫细胞（如肿瘤浸润性淋巴细胞，TILs），再将其回输至体内。然而，在临床前胰腺癌模型中，过继性细胞治疗的技术尚未得到良好建立。本文介绍了一种利用同源性胰腺癌小鼠模型中TILs进行过继性细胞治疗的详细方案。该操作包括将活体或经辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告基因小鼠体内，以诱导免疫细胞浸润；随后通过流式细胞术分选从原发肿瘤中分离淋巴细胞，并/或激活与扩增肿瘤反应性T细胞。 离体并将这些激活的T细胞过继性地腹腔转移至荷瘤小鼠体内，随后给予白细胞介素-2。&#160;生物发光肿瘤成像技术可实现对原位肿瘤生长及其治疗反应的长期监测，尤其适用于评估肿瘤特异性的细胞毒性效应。该方法重现了开发针对胰腺癌患者过继性细胞转移疗法所涉及的技术流程。实验结果表明，与无关淋巴细胞对照组相比，过继转移的肿瘤反应性T细胞具有更强的抗肿瘤效果。这一多功能方法可实现对 体内 胰腺癌的过继性免疫治疗研究，以及细胞处理参数和联合治疗方案的优化。

为全面评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）转移的疗效，受体小鼠被分为七组：（a）生理盐水对照（空白对照）：接受生理盐水注射的小鼠，作为基线对照。（b）仅注射IL-2（空白对照）：接受IL-2注射的小鼠，用于评估该细胞因子单独作用的影响。（c）与供体治疗组小鼠相同的单一治疗（阳性对照）：接受与供体小鼠相同治疗的小鼠，用于比较直接治疗与TIL转移的效果。（d）来自对照组供体的TIL联合IL-2（阴性对照）：用于评估来自未经治疗肿瘤的TIL的作用效果。（e）来自对照组供体的外周血单个核细胞（PBMC）联合IL-2（阴性对照）：用于比较外周血细胞与TIL的作用差异。（f）来自治疗组供体的TIL联合IL-2（治疗有效组）：主要实验组，用于评估来自治疗组供体的TIL的疗效。（g）来自治疗组供体的PBMC联合IL-2（非特异性细胞毒性对照）：用于评估经治疗小鼠的全身免疫细胞是否具有抗肿瘤效应。
代表性结果表明，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分离与过继转移技术具有显著疗效。在接...

我们描述了一种利用流式细胞术从小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中分离细胞并进行过继性细胞转移的方法。该方案旨在验证TILs在同基因型胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌的过继性细胞治疗开发提供依据。

胰腺癌是一种侵袭性强的恶性肿瘤，预后极差且治疗选择有限。过继性细胞治疗是一种通过分离和扩增特异性T细胞，再将其回输给患者以增强抗肿瘤免疫应答的治疗方法。

我们致力于开发一种在胰腺癌模型中分离和过继性转移肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的方法。我们试图回答TIL亚群是否能在体内有效靶向并杀伤胰腺肿瘤，以及如何优化T细胞以用于未来的临床试验。近年来，过继性细胞治疗领域取得了进展，包括改进TIL的分离与表达技术，轻度修饰TIL以增强其靶向能力，以及将TIL治疗与其他免疫疗法（如检查点抑制剂或靶向治疗）联合使用，以提高抗肿瘤疗效。我们已建立一种从胰腺癌小鼠模型中分离和扩增肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的稳健方法。我们证实了过继转移的肿瘤反应性T细胞具有增强的抗肿瘤效果。与其它特异性较低的方法相比，本方案通过实现肿瘤特异性TILs的分离与筛选，为过继性细胞治疗提供了更具靶向性的策略。此外，该方法还利用生物发光成像技术对肿瘤进行无创监测。我们的研究结果将通过提供一种标准化的临床前模型，用于评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗在胰腺癌中的疗效，并优化T细胞亚群的治疗参数，从而推动该领域的发展。为在小鼠体内建立原位胰腺肿瘤模型，需制备KPC-Luciferase细胞悬液，将KPC-Luciferase细胞系在37摄氏度条件下消化1分钟。消化后，加入 PBS，转移细胞，然后离心细胞悬液。计数细胞，并将其重悬于含有 30% 基底膜基质的 PBS 中，细胞浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升。将麻醉小鼠置于手术平台上。在左侧腹部做0.5至1厘米的切口后，用镊子夹住脾脏并暴露胰腺。准备好KPC-Luciferase细胞与基底膜基质的混合物后，使用29号针头将含有50,000个细胞的50微升细胞悬液注射到胰腺中。然后将胰腺放回腹腔内。依次缝合腹膜和皮肤。将小鼠置于保温垫上，直至其完全苏醒。术后7天，向小鼠腹腔注射60微升D-荧光素钾盐溶液，用于活体成像。麻醉后，将小鼠置于活体成像系统中进行生物发光检测。成像结束后，将小鼠从系统中取出，并使其自然恢复清醒。首先，将已实施安乐死的供体小鼠放置于手术平台上。用75%乙醇对整个身体进行消毒。在无菌操作台中，使用剪刀和镊子打开腹腔。取出肿瘤并将其置于冰上的PBS中。使用游标卡尺测量肿瘤大小，然后根据屏幕上的公式计算肿瘤体积。在使用胶原酶、Dispase II 和 DNAse I 配制 RPMI 1640 中的 1× 消化液后，每孔加入 1 至 2 毫升该溶液至 12 孔板中。使用剪刀将肿瘤组织剪成小块。将肿瘤组织块转移至12孔板的每个孔中，在37摄氏度、70转/分钟振荡条件下消化30分钟。消化结束后，加入1至2毫升含10%胎牛血清的培养基，终止消化反应，并将细胞悬液转移至收集管中。用 PBS 清洗 12 孔板的孔两次，以收集残留的细胞。将细胞悬液通过 70 微米细胞筛网过滤，使用注射器活塞的平端切碎并研磨组织碎片，以释放单个细胞。在 4°C 条件下以 400 ×g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 5% 牛血清白蛋白中，用于流式细胞术染色。首先，将来自荷瘤小鼠的分离细胞与来自非荷瘤小鼠的脾脏或外周血单个核细胞置于工作平台。使用FC阻断剂和流式抗体以1:100的稀释比例对细胞进行染色。将试管置于冰上避光孵育30分钟。孵育后，通过离心用 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于含 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中。在流式细胞仪上分选 CD45+CD3+ 细胞时，根据 FSC-A 和 SSC-A 设门圈选活细胞，得到门 P1；接着，根据 FSC-A 和 FSC-H 从 P1 中圈选单细胞，得到门 P2；最后，利用 CD45 和 CD3 设门，从 P2 中分选 CD45+CD3+ 细胞，并将分选出的细胞收集至收集管中。在4°C条件下，以400 × g离心力离心分选后的CD45+CD3+细胞5分钟。用小鼠血清将细胞重悬至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升，并置于冰上。将荷瘤受体小鼠放置于手术平台上。使用29号1/2英寸胰岛素注射器，将分选后的免疫细胞进行腹腔注射。随后，连续三天腹腔注射白细胞介素-2。

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