基于流式细胞术的胰腺癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞的分离和治疗评估
2025年1月17日
我们描述了一种通过流式细胞术利用小鼠肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 进行过继细胞转移的方法。该方案旨在验证 TILs 在同基因胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌过继细胞疗法的开发提供见解。
我们专注于开发一种在胰腺癌模型中分离和过继转移肿瘤浸润淋巴细胞 TIL 的方法。我们试图回答 TILs 的子集是否可以在体内有效靶向和杀死胰腺肿瘤，以及如何优化 T 细胞以用于未来的临床试验。过继细胞疗法的最新发展，包括增强 TIL 分离和表达技术、温和修饰 TIL 以提高其靶向性，以及将 TIL 疗法与其他免疫疗法（如检查点抑制剂或靶向疗法）相结合以增强抗肿瘤疗效。
我们已经建立了一种从胰腺癌小鼠模型中分离和扩增肿瘤反应性 TILs 的稳健方法。我们证明了过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤功效增强。与其他特异性较低的方法相比，我们的方案通过能够分离和选择肿瘤特异性 TIL 提供了一种更具针对性的过继细胞治疗方法。
它还使用生物发光成像进行无创肿瘤监测。我们的研究结果将通过提供标准化的临床前模型来评估 TIL 治疗效果和优化胰腺癌 T 细胞亚群的治疗参数，从而推动该领域的发展。为了制备用于诱导小鼠原位胰腺肿瘤的 KPC-荧光素酶细胞悬液，请在 37 摄氏度下将 KPC-荧光素酶细胞系胰蛋白酶消化 1 分钟。
胰蛋白酶消化后，加入 PBS，转移细胞，然后离心细胞悬液。计数细胞，并以 1 倍 10 的浓度重悬于含有 30% 基底膜基质的 PBS 中，达到每毫升 6 个细胞的幂次方。将麻醉的鼠标放在作平台上。
在左腹切开 0.5 至 1 厘米后，用镊子固定脾脏并露出胰腺。制备 KPC-荧光素酶细胞和基底膜基质混合物后，使用 50 号针头将含有 50， 000 个细胞的细胞悬液注入胰腺。将胰腺送回腹腔。
依次缝合腹膜和皮肤。让鼠标在温暖的垫子上恢复，直到完全唤醒。7 天后，腹膜内注射小鼠 60 微升 D-荧光素钾盐溶液进行实时成像。
麻醉后，将鼠标置于体内成像系统中进行生物发光检测。成像后，从系统中取出鼠标，让它从麻醉中自然恢复。首先，将供体安乐死的小鼠放在作平台上。
用 75% 乙醇对全身消毒。在无菌罩中，使用剪刀和镊子打开腹腔。取出肿瘤并将其置于冰上的 PBS 中。
用游标口径测量肿瘤大小。然后，使用屏幕上的公式计算肿瘤体积。在 RPMI 1640 中使用胶原酶、分散酶 II 和 DNAse I 制备 1X 消化溶液后，在 12 孔板中每孔添加 1 至 2 mL 溶液。
用剪刀将肿瘤切成小块。将肿瘤块转移到 12 孔板的每个孔中，在 37 摄氏度下消化，同时以 70 RPM 振荡 30 分钟。要终止消化，请添加 1 至 2 毫升 10% 胎牛血清，并将细胞悬液转移到收集管中。
用 PBS 洗涤 12 孔板的孔两次，以收集任何剩余的细胞。通过 70 微米细胞过滤器过滤细胞悬液，切碎并压碎组织碎片，以使用注射器柱塞的平端释放单个细胞。将滤液在 4 摄氏度下以 400 G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 5% 牛血清白蛋白中，用于流式细胞术染色。
首先，将从荷瘤小鼠中分离的细胞与来自非荷瘤小鼠的脾脏或外周血单核细胞一起放在工作平台上。用 FC 阻滞剂对细胞进行染色，并以 1 至 100 的稀释度流式抗体。将试管在冰上避光孵育 30 分钟。
孵育后，通过离心在 PBS 中洗涤细胞两次，然后将它们重悬于 PBS 中的 1% 牛血清白蛋白中。在流式细胞仪上，要对 CD45+CD3+细胞进行分选，根据 FSC-A 和 SSC-A 对活细胞进行门控，以创建门 P1。然后，基于 FSC-A 和 FSC-H 的 P1 门控单细胞以创建门 P2。使用 CD45 和 CD3 门控从 P2 中分选 CD45+CD3+细胞。将分选的细胞收集到收集管中。
在 4 摄氏度下以 400 G 离心分选的 CD45+CD3+细胞 5 分钟。将细胞重悬于小鼠血清中，浓度为 1 倍 10 至每毫升 6 个细胞的幂，并将它们置于冰上。将肿瘤诱导的受体小鼠放在作平台上。
使用 29 号 1/2 英寸胰岛素注射器，腹膜内注射分选的免疫细胞。然后，连续 3 天腹膜内注射白细胞介素 2。
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概述
本研究提出了一种在胰腺癌模型中分离和转移肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的方法。研究旨在评估TIL亚群在体内靶向和消除胰腺肿瘤的有效性。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 肿瘤学
- 细胞治疗
背景
- TILs对抗肿瘤的免疫反应至关重要。
- 采用性细胞治疗在癌症治疗中显示出希望。
- 胰腺癌对免疫疗法提出了独特的挑战。
- 增强TILs的分离和靶向对于有效的治疗至关重要。
研究目的
- 从胰腺癌小鼠模型中分离并扩展肿瘤反应性TILs。
- 评估TILs对胰腺肿瘤的细胞毒性。
- 优化T细胞治疗以用于未来的临床应用。
所用方法
- 用于TILs分离的流式细胞术。
- 采用性细胞转移技术。
- 体内肿瘤靶向测定。
- 与检查点抑制剂的联合治疗。
主要结果
- 展示了肿瘤反应性TILs的增强抗肿瘤效力。
- 建立了一种用于TILs分离和扩展的稳健方法。
- 显示了将TILs疗法与其他免疫疗法相结合的潜力。
- 为优化TILs用于临床试验提供了见解。
结论
- 该研究为采用性细胞治疗提供了一种靶向方法。
- 分离的TILs在有效靶向胰腺肿瘤方面显示出希望。
- 未来的研究应关注优化TILs的临床应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Flow cytometry-based isolation and adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in a pancreatic cancer mouse model addresses a critical gap in preclinical immunotherapy development. This workflow enables precise evaluation of TIL subset efficacy, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for cell therapy pipelines. The approach provides a standardized platform for optimizing cell processing and combination regimens, directly informing translational and portfolio advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of TIL subset function and tumor specificity in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and expanding tumor-reactive lymphocytes.
- Facilitates predictive confidence in immunotherapy target selection and validation.
Screening & Assay Development
- Provides validated immune cell populations for downstream cytotoxicity and efficacy assays.
- Standardizes TIL isolation and expansion for reproducible assay development.
- Enables quantitative assessment of tumor response using bioluminescent imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant immune responses in pancreatic cancer.
- Supports optimization of cell processing parameters and combination immunotherapy regimens.
- Enables longitudinal monitoring of therapeutic efficacy in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, assay development, and translational research for adoptive cell therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TIL-mediated tumor cytotoxicity and immune pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for immune cell efficacy assessment.
- Analytics: Provides bioluminescent imaging and flow cytometry data for comparative analysis of treatment conditions.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical evaluation of cell therapy strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating and optimizing adoptive immunotherapy workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunotherapy development.
- Operational Value: Standardizes TIL isolation, expansion, and monitoring for scalable preclinical studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, immune cell handling, and in vivo imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for cell sorting and bioluminescent monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of cell processing and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different tumor models or immune cell subsets.
- Throughput and scalability are limited by animal model and cell expansion logistics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:17
Inducing Orthotopic Pancreatic Tumors in Mice Using KPC-Luciferase Cells
4:04
Orthotopic Pancreatic Tumor Harvesting and Single-Cell Preparation for Flow Cytometry
5:53
Flow Cytometry-Guided Tumor Cell Isolation, Adoptive Transfer, and Tumor Monitoring in Pancreatic Cancer Recipient Mice
