Name: 在斑马鱼胚胎中使用白血病细胞移植 物进行体内 药物反应的快速预测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解利用斑马鱼胚胎快速评估急性淋巴细胞白血病药物反应的异种移植方法。该方案通过阻断免疫细胞分化提高移植物存活率，为儿科肿瘤学研究提供可靠的临床前模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）在合作研究中心CRC1588（项目编号493872418）以及柏林Dr. Kleist基金会的资助，同时也获得了德国José Carreras白血病基金会（R03/2016）、柏林癌症协会（HEFF201633KK）和德国癌症联盟（DKTK，联合资助项目2016）的支持。我们感谢Julia Köppke和Mareike Wolff对稿件的审阅与宝贵意见。

<ol><li>Fontana, C. M., Van Doan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenograft+as+a+tool+for+the+study+of+colorectal+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenograft as a tool for the study of colorectal cancer: a review.</a> Cell Death Dis. 15, 1-12 (2024).</li>
<li>Sturtzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+high-content+imaging-based+phenotypic+drug+screening+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Refined high-content imaging-based phenotypic drug screening in zebrafish xenografts.</a> NPJ Precis Oncol. 7 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer+avatars%3A+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24, 2288(2023).</li>
<li>Gamble, J. T., Elson, D. J., Greenwood, J. A., Tanguay, R. L., Kolluri, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+xenograft+models+for+investigating+cancer+and+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish xenograft models for investigating cancer and cancer therapeutics.</a> Biology. 10 (4), 252(2021).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+avatars+towards+personalized+medicine-A+comparative+review+between+avatar+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models.</a> Cells. 9 (2), 293(2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+building+clinically+relevant+patient-derived+tumor+xenograft+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in building clinically relevant patient-derived tumor xenograft models for cancer research.</a> Animal Model Exp Med. 6 (5), 381-398 (2023).</li>
<li>Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+for+drug+discovery+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine.</a> Trend Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+avatar-test+forecasts+clinical+response+to+chemotherapy+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Zebrafish avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer.</a> Nat Comm. 15 (1), 4771(2024).</li>
<li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+-+Preclinical+testing+of+CAR+T+cells+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 - Preclinical testing of CAR T cells in zebrafish xenografts.</a> Method Cell Biol. 167, 133-147 (2022).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+T+cell+immunotherapy+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of T cell immunotherapy responses in vivo.</a> J Exp Med. 218 (10), 20210314(2021).</li>
<li>Pascoal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+embryonic+zebrafish+xenograft+model+to+investigate+CAR+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A preclinical embryonic zebrafish xenograft model to investigate CAR T cells in vivo.</a> Cancers. 12 (3), 567(2020).</li>
<li>Pal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+maintenance+of+clonal+abundance+and+leukaemia-initiating+potential+in+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro maintenance of clonal abundance and leukaemia-initiating potential in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Leukemia. 30 (8), 1691-1700 (2016).</li>
<li>Beneduce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinatumomab+in+children+and+adolescents+with+relapsed%2Frefractory+B+cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+real-life+multicenter+retrospective+study+in+seven+AIEOP+%28Associazione+Italiana+di+Ematologia+e+Oncologia+Pediatrica%29+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Blinatumomab in children and adolescents with relapsed/refractory B cell precursor acute lymphoblastic leukemia: A real-life multicenter retrospective study in seven AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica) Centers.</a> Cancers. 14 (2), 426(2022).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-course+blinatumomab+for+refractory%2Frelapse+precursor+B+acute+lymphoblastic+leukemia+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Short-course blinatumomab for refractory/relapse precursor B acute lymphoblastic leukemia in children.</a> Front Pediatr. 11, 1187607(2023).</li>
<li>Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+treatments+for+pediatric+relapsed+or+refractory+acute+B-cell+lineage+lymphoblastic+leukemia%3A+Precision+medicine+era%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era.</a> Front Pediatr. 10, 923419(2022).</li>
<li>Howe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Lee, H. C., Lin, C. Y., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%2C+an+in+vivo+platform+to+screen+drugs+and+proteins+for+biomedical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish, an in vivo platform to screen drugs and proteins for biomedical use.</a> Pharmaceuticals. 14 (6), 500(2021).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Miao, K. Z., Kim, G. Y., Meara, G. K., Qin, X., Feng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tipping+the+scales+with+zebrafish+to+understand+adaptive+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tipping the scales with zebrafish to understand adaptive tumor immunity.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 660969(2021).</li>
<li>Gauert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+in+vivo+model+for+drug-response+prediction+in+patients+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Fast, in vivo model for drug-response prediction in patients with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancers. 12 (7), 1883(2020).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Pase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-delivered+myeloperoxidase+dampens+the+hydrogen+peroxide+burst+after+tissue+wounding+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish.</a> Current Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).</li>
<li>Wijk, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+and+quantitative+understanding+of+pharmacokinetics+in+Zebrafish+larvae+through+nanoscale+blood+sampling+and+metabolite+modeling+of+paracetamol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanistic and quantitative understanding of pharmacokinetics in Zebrafish larvae through nanoscale blood sampling and metabolite modeling of paracetamol.</a> J Pharmacol Exp Ther. 371 (1), 15-24 (2019).</li>
<li>Lázaro-Navarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+casein+kinase+2+sensitizes+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+to+venetoclax+via+MCL1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Inhibiting casein kinase 2 sensitizes acute lymphoblastic leukemia cells to venetoclax via MCL1 degradation.</a> Blood Advances. 5 (24), 5501(2021).</li>
<li>Rhodes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+pu.1+and+gata1+determines+myelo-erythroid+progenitor+cell+fate+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Interplay of pu.1 and gata1 determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafish.</a> Developmental Cell. 8 (1), 97-108 (2005).</li>
<li>Zakaria, Z. Z., Eisa-Beygi, S., Benslimane, F. M., Ramchandran, R., Yalcin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+microinjection+of+Morpholino+antisense+oligonucleotides+and+mRNA+into+zebrafish+embryos+to+elucidate+specific+gene+function+in+heart+dvelopment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Design and microinjection of Morpholino antisense oligonucleotides and mRNA into zebrafish embryos to elucidate specific gene function in heart dvelopment.</a> J Vis Exp. (186), e63324(2022).</li>
<li>ZFIN: Zebrafish Book: Contents. , 
 <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html">https://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html</a> (2025).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Hasegawa, E. H., Gist H Farr, I. I. I., Maves, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+pronase+versus+manual+dechorionation+of+zebrafish+embryos+for+small+molecule+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of pronase versus manual dechorionation of zebrafish embryos for small molecule treatments.</a> J Dev Biol. 11 (2), 16(2023).</li>
<li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+safe+harbor%3A+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Stem cell safe harbor: the hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Adv. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+host+defense%3A+new+insights+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> J Leukocyte Biol. 98 (4), 523-537 (2015).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Nguyen-Chi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+signaling+and+macrophages+govern+fin+regeneration+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF signaling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae.</a> Cell Death Dis. 8 (8), e2979-e2979 (2017).</li>
<li>Rosowski, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+macrophage+versus+neutrophil+contributions+to+innate+immunity+using+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish.</a> Dis Models Mech. 13 (1), dmm041889(2020).</li>
<li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Comm Biol. 3 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+xenograft+platform-A+novel+tool+for+modeling+KSHV-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The zebrafish xenograft platform-A novel tool for modeling KSHV-associated diseases.</a> Viruses. 12 (1), 12(2020).</li>
<li>Pype, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+at+32.5+%C2%B0C+and+above+causes+malformations+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Incubation at 32.5 °C and above causes malformations in the zebrafish embryo.</a> Reprod Toxicol. 56, 56-63 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29-based+gene+therapy+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for glioblastoma.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 76(2021).</li>
<li>Siebert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhabdomyosarcoma+xenotransplants+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Pediat+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Rhabdomyosarcoma xenotransplants in zebrafish embryos.</a> Pediat Blood Cancer. 70 (1), e30053(2023).</li>
<li>van Bree, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orthotopic+medulloblastoma+zebrafish+model+for+rapid+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of an orthotopic medulloblastoma zebrafish model for rapid drug testing.</a> Neuro-Oncol. noae210, (2024).</li>
</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

由于具有高通量能力和成本效益，斑马鱼胚胎已成为药物筛选和癌症研究中日益流行的异种移植模型。这些异种移植模型有望成为转化医学的关键支柱，有助于临床前研究和决策制定9,21。然而，与大量关于实体瘤移植的研究相比，用于人类白血病细胞扩增和治疗的斑马鱼异种移植模型仍相对较少。本实验方案为利用斑马鱼异种移植模型开展白血病研究提供了详细指导，同时亦可灵活适用于实体瘤研究。
实现稳定的癌细胞移植具有挑战性，凸显了标准化分析和提高统计可靠性的必要性。本方案通过提供一套完整的流程，涵盖细胞准备、移植操作及后续的流式细胞术分析，并结合故障排除建议，解决了上述问题。
通过吗啉环寡核苷酸注射实现短暂免疫抑制 
斑马鱼胚胎在发育的最初几天依赖其先天免疫系统，这决定了本实验流程的时间窗口20。原始巨噬细胞约在受精后12小时出现，部分细胞在受精后33...

斑马鱼异种移植已成为研究癌症发病机制和预测药物反应的重要体内模型1,2,3,4,5。动物模型在临床前药物测试中仍至关重要，而斑马鱼模型相较于其他体内系统具有显著优势，包括高通量和高成本效益6,7,8。&#160;该模型还可辅助个性化治疗反应的预测，包括分子靶向治疗和CAR-T细胞治疗9,10,11,12。
BCP-ALL 尤其可以从斑马鱼异种移植中获益，因为原代患者细胞在体外培养中扩增仍然具有挑战性13。急性淋巴细胞白血病（ALL）迫切需要新的治疗方法。尽管儿童 BCP-ALL 的缓解率高达 80%–85%，但复发或难治性疾病的患者长期生存率仅为约 30%–60%14,15,16。在此类情况下，使用本方案提出的药物筛选流程可整合到临床实践中，以确定最佳的个体化治疗方案14,15。当面对多重耐药情况时，这种个体化治疗策略至关重要，可通过避免使用无效或次优且具有严重副作用的药物，显著减轻患者的治疗负担。
斑马鱼胚胎异种移植模型具有多个优势。人类与斑马鱼之间的遗传相似性较高，两者具有70%的基因同源性以及84%的疾病相关基因共享，这为基因-药物相互作用研究提供了有力支持。17因此，利用转基因宿主胚胎可以揭示影响药物敏感性的遗传倾向18. 或者，可移植具有特定基因修饰的细胞，以评估药物敏感性或耐药性是否与 体外 研究结果表明，斑马鱼胚胎异种移植模型还能揭示药物潜在的全身性效应。尽管2-3天龄胚胎的器官发育尚未完全成熟，但其器官定位正确，并在部分细胞组成上与其成体对应器官具有相似性。19.
该模型的其他优势包括：仅需少量癌细胞即可实现移植；宿主胚胎的维持操作简便，因为在出生后的前5天内无需喂养；并且由于胚胎具有透明性和适宜的尺寸，可快速评估注射是否成功。一个独特的特点是，在此发育阶段仅先天性免疫系统处于活跃状态，这有助于实现高效的移植20。本文所述的ZefiX实验方案（参见图1中的总结）通过在生命最初4天内使用靶向spi1和csf3r的稳定型吗啉代反义寡核苷酸抑制先天性免疫系统，进一步增强了免疫缺陷状态，从而阻断巨噬细胞和中性粒细胞的分化21,22,23。
该方案还不同于以往的斑马鱼异种移植方案，后者主要是为实体瘤移植而开发，通常采用基于整体成像的药物反应评估方法。ZefiX 针对液体肿瘤细胞（如 BCP-ALL 细胞）进行了优化，并已成功用于扩增新鲜或新鲜冷冻的患者样本21。通过选择适当的组织解离酶，ZefiX 也可适用于贴壁型癌细胞。
另一个主要优势是使用流式细胞术进行下游分析，该方法具有多项优点：（i）可快速处理大量移植物细胞，从而在单细胞水平上实现可靠的统计分析；（ii）可在单个细胞中同时评估增殖速率和存活率；（iii）流式细胞仪在临床研究环境中普遍可用，可在数小时内实现对移植物细胞在单细胞水平上的药物反应评价。为确保可重复性，本方案提供了一条从制备、移植到流式细胞术分析的标准化流程，可在一周内实现对急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的药物反应预测。

<table><tbody><tr><td>培养皿&amp;nbsp;（10 cm）</td><td>Greiner</td><td>P7237</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 活性染色液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（LE，分析级）</td><td>Biozym&amp;nbsp;</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>气压注射器</td><td>Narishige</td><td>IM400</td><td>&amp;nbsp;需外接气体供应</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;nbsp;488 抗人 CD19 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Annexin 结合缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td>或参见溶液配制方法</td></tr><tr><td>APC 标记 Annexin V&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>640941</td><td></td></tr><tr><td>毛细管（10 cm，外径 1.0 mm，带丝）</td><td>WPIINC</td><td>TW100F-4</td><td>外径 1.0；内径 0.75</td></tr><tr><td>细胞培养瓶（T-175）</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,12,002</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4693-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管（1.5 ml）</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管（聚苯乙烯圆底管，带细胞筛网帽，5 ml）</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管（50 ml）</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8056</td><td></td></tr><tr><td>细网滤器&amp;nbsp;（10 &amp;micro;m）</td><td>PluriStrainer</td><td>435001050</td><td></td></tr><tr><td>细网滤器&amp;nbsp;（20 &amp;micro;m）</td><td>PluriStrainer</td><td>431002040</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD LSRFortessa X-20</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带相机的荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>相机：DFC7000 T</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS，无钙镁）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>88284</td><td></td></tr><tr><td>注射模具（斑马鱼 MI/移植试剂盒）</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>Z-MOLDS</td><td></td></tr><tr><td>注射针（无丝）</td><td>Biomedical instruments</td><td>VZIPbl-20-10-55</td><td>斑马鱼注射移液管，钝头，外径：20&amp;mu;m &amp;plusmn; 1，总长：~10 mm，针长：55 mm，玻璃材质：BM100T-10P</td></tr><tr><td>大容量离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morpholino（csf3r）</td><td>Gene Tools LLC</td><td>csf3r (GAAGCACAAGCGA&lt;br/&gt; GACGGATGCCA)</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino（spi1）</td><td>Gene Tools LLC</td><td>spi1(GATATACTGATAC&lt;br/&gt; TCCATTGGTGGT)</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Penstrep；10,000&amp;nbsp;U/ml）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>培养板（4 孔）</td><td>Greiner Bio one&amp;nbsp;</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>培养板（96 孔）</td><td>Greiner Bio one&amp;nbsp;</td><td>657180</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine&amp;nbsp;（MS-222）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐</td></tr></tbody></table>

快速 体内 利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

Rapid in vivo Drug Response Prediction Using Leukemia Cell Grafts in Zebrafish Embryos

斑马鱼异种移植是一种研究人类癌症发病机制并预测个体药物反应的关键技术。本文介绍了一种简化的实验流程（ZefiX），用于在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中扩增原代B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）患者样本或永生化细胞系，并利用流式细胞术对治疗反应进行高分辨率的单细胞分析。与实体瘤移植相比，白血病细胞在实验过程中显著受益于基于吗啉代反义寡核苷酸的巨噬细胞和中性粒细胞分化因子的抑制。对解离后的移植物细胞进行流式细胞术分析，可对每个细胞的细胞数量、增殖速率和活力进行精确评估。该方法已使用靶向治疗药物（如维奈托克和达沙替尼）进行了验证，并将治疗结果与相应患者样本的临床记录及传统的二维培养对照进行了比较。值得注意的是，该方案&#160;可在7&#160;天内完成，符合临床决策的时间要求。该方法可适用于多种癌症类型（包括实体瘤）中特定药物的测试，从而支持个体化治疗策略的制定。然而，由于斑马鱼胚胎中的药代动力学限制，可同时评估的药物数量存在一定的局限性，需予以考虑。

有关ZefiX方案的详细科学评估，包括对新鲜冷冻的原代BCP-ALL细胞样本进行异种移植和药物处理，请参阅先前发表的论文21。使用患者样本进行临床前药物测试的研究许可，已由当地医学研究伦理委员会作为ALL-REZ BFM 2002试验（NCT00114348）和ALL-REZ BFM注册库与生物样本库（EA2/055/12）的附加研究部分批准，同时亦获得国家主管部门对IntReALL SR 2010国际试验（NCT01802814）的批准。患者和/或其监护人已通过其参与的相应试验或注册库程序签署了知情同意书。
图2 展示了注射前在琼脂糖培养皿中进行胚胎排列的示例，有助于简化注射过程。注射时应按照图中所示角度操作，以精确定位发育心脏周围的腔隙。此外，图2C 提供了成功注射的人源移植物细胞（蓝色）在2天龄胚胎中的参考图像，移植物细胞在注射前已用CTV标记。凡注射结果与图2C</s...

本方案提供了从细胞系和新鲜患者样本在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中建立人急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植模型并进行问题排查的逐步操作指南，同时包含使用流式细胞术评估药物反应的指导原则。该实验流程也可根据需要调整用于实体瘤研究。

斑马鱼异种移植是研究人类癌症发病机制和预测个体药物反应的关键技术。本文……

我们已开发出一种快速的七天工作流程，用于测试肿瘤细胞在斑马鱼胚胎中对药物的反应。由于靠近儿科肿瘤学领域，我们能够获得罕见的癌症样本，最初从B细胞前体白血病开始研究，但目前正将该方案扩展至儿童实体瘤，以评估该检测方法是否同样适用于临床环境。我们已成功在斑马鱼胚胎中培养出患者来源的白血病细胞，使其成为一种极为理想的临床前模型。然而，药代动力学可能较为复杂，因为某些药物难以穿过生物屏障，因此我们在开始实验前必须确保测试其穿透能力。我们的方法具有独特性，因为它可阻断先天免疫细胞的分化，从而有助于白血病移植物细胞在宿主体内更好地存活。此外，我们采用流式细胞术来检测每10条宿主鱼中移植物细胞的单个细胞活力与增殖情况。这使我们能够获得非常精确的药物反应数据，并具有强大的统计学效力。首先，在微波炉中将1%琼脂糖溶解于100毫升E3培养基中。对于移植用培养皿，将约20毫升培养基倒入直径10厘米的培养皿中，填充至一半高度。轻轻摇晃培养皿，使液体均匀分布。对于吗啉寡核苷酸注射用培养皿，将注射模具放置于两个培养皿的液态琼脂糖中，确保不产生气泡。倾斜皿盖以覆盖培养皿，并在室温下静置，直至琼脂糖完全凝固。琼脂糖凝固后，将平板倒置并放入密封塑料袋中，在 4 摄氏度下保存。接下来，使用拉针仪从 10 厘米长的毛细管制备针尖。折断针尖以获得约 10 微米的直径。为了注射吗啉环寡核苷酸，将约100个受精的斑马鱼卵分批转移至预先准备好的注射板中，尽量减少携带的液体。小心地将胚胎排列在注射板的凹槽中。在单细胞期，向细胞内或细胞下方的卵黄囊中注射1纳升浓度为50微摩尔的spi1和csf3r吗啉环寡核苷酸混合物。将注射后的卵在28摄氏度下孵育过夜。第三天，为启动去壳过程，使用巴斯德吸管从培养皿中移除任何无心跳或无运动、外观不透明或形状不规则的死亡胚胎。使用两把精密镊子夹住卵壳，以固定其位置。用第二把镊子固定胚胎的同时，用第一把镊子在镊尖附近轻轻夹住。小心地将卵壳拉开，释放出胚胎。将去壳后的胚胎在28摄氏度下孵育过夜。首先，准备两个直径为10厘米的培养皿，其中加入含有青霉素-链霉素的E3培养基（E3/P/S）。将培养皿置于28摄氏度环境中预热30分钟。使用CellTrace Violet（CTV）对细胞进行荧光标记后，离心BCP-ALL细胞。然后加入 PBS 至所需细胞浓度，并置于冰上保存。使用微量移液器吸头将 4 µL 细胞悬液加入移植针中。在含有 E3/P/S 培养基和鱼胚胎的培养皿中加入三卡因，使其终浓度为 4 g/L，用于在注射前对胚胎进行至少 2 分钟的麻醉处理。接下来，将15至20个去壳胚胎转移至涂有琼脂糖的注射皿中，并吸去多余液体以防止胚胎滑动。将胚胎在注射皿上排列整齐。从背尾侧方向以45度角插入显微注射针，向心包腔内注射约1,000个CTV阳性的BCP-ALL细胞。注射15至20个胚胎后，将其转移至预先温育的、盛有E3/P/S培养基的培养皿中。将移植胚胎与未移植的对照组胚胎均在28摄氏度下孵育1至3小时。在荧光体视显微镜下观察胚胎，以确认移植成功，并确保卵黄完整无损。向96孔板的每个孔中加入100微升E3/P/S培养基和0.5% DMSO。使用玻璃巴斯德吸管，尽可能少地吸取含有移植胚胎的E3培养基。倾斜吸管，使胚胎沉降至吸管尖端底部，并利用毛细作用将其释放到孔中。在96孔板的24个孔中，分别加入100微升的溶剂对照溶液或两倍浓度的维奈托克溶液。将胚胎置于35摄氏度环境中培养72小时，包括未移植的胚胎作为对照。第三天结束时，从培养箱中取出含有移植斑马鱼胚胎的96孔板。使用体视显微镜对培养板进行筛选，以识别并挑选健康的斑马鱼胚胎。将每种条件下的10个宿主胚胎随机混合至一个1.5毫升微量离心管中，理想情况下每种条件获得两个管。尽可能彻底去除每管中的液体。向每支试管中加入 500 µL 不含钙和镁的 HBSS。使用 200 µL 微量移液器枪头通过吹打法机械解离胚胎和移植物细胞，上下吹打约 15 次。在室温下以 350 ×g 离心 5 分钟，使组织碎片沉淀。按每种条件，在含有 2 毫升 PBS 的 FACS 管中加入带 35 微米细网滤器盖。然后将沉淀重悬于 500 微升酶混合液中，在室温下孵育 15 分钟。孵育期间，每隔 5 分钟使用同一枪头将混合物上下吹打一次，以避免组织损失。将解离的细胞转移至FACS管的35微米细网滤器盖中。以350 ×g离心5分钟。进行流式细胞术分析，以评估移植物细胞的总数。使用CTV和CD19染色的3dpi培养细胞开始数据分析。创建CD19与CTV的散点图，以确认信号重叠并验证双染癌细胞的存在。接着，创建FSC-A与SSC-A的散点图，以区分完整细胞与碎片。然后利用完整的细胞群体创建一个新的散点图，以SSC-A和SSC-H来识别单个细胞。使用单细胞群体创建7AAD和Annexin V的散点图，将细胞分为四个群体。打开移植斑马鱼的文件。使用 CTV 和 CD19 的点图将人源移植物细胞与宿主细胞分离。鉴定并分离 CTV、CD19 双阳性移植物细胞。将针对 3dpi 培养细胞所述的相同设门策略复制并应用于移植物细胞群体。将所有 Annexin V 和 7AAD 阴性细胞群体合并到一个直方图中，横轴为 CTV 值。计算全部五个样本的几何平均值以确定增殖率。流式细胞术结果显示，移植到斑马鱼胚胎中的新鲜 BCP-ALL 单细胞在三天后存活率为 95.2%，是培养皿中培养细胞 61.9% 存活率的 1.5 倍。在体内和体外条件下，CTV 荧光强度在三天内均呈现相似程度的下降，表明细胞分裂速率相当。在培养三天后，对每组胚胎中完整的移植物细胞数量进行定量分析，结果表明移植效率一致。

rapid-vivo-drug-response-prediction-using-leukemia-cell-grafts

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

在斑马鱼胚胎中使用白血病细胞移植 物进行体内 药物反应的快速预测

限制性稀释细胞移植实验用于测定肿瘤传播细胞的频率。本方案描述了一种生成同基因型斑马鱼的方法，这些斑马鱼可发育出荧光标记的白血病，并详细说明如何分离这些白血病细胞，并以限制性稀释方式将其移植至成年斑马鱼的腹腔内。...

利用同系斑马鱼中的有限稀释细胞移植法量化肿瘤传播细胞的频率

本文介绍了一种将斑马鱼骨骼肌及胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）细胞移植到成年免疫缺陷的 rag2E450fs...

正常与恶性肌肉细胞移植入免疫缺陷的成年斑马鱼

该方法利用斑马鱼胚胎高效检测癌细胞的血管侵袭能力。将荧光标记的癌细胞注射至发育中胚胎的心前窦或卵黄囊内，24至96小时后通过尾部区域的荧光显微镜观察，评估癌细胞的血管内侵及外渗情况。...

在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

癌症细胞移植是研究癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术依赖于免疫缺陷型动物。本文介绍一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫健全胚胎中的方法，用于长期分析肿瘤细胞行为 体内...

将斑马鱼儿童脑肿瘤移植到免疫健全宿主中以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。...

利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

本方案描述了利用斑马鱼幼体作为宿主的病毒介导双荧光标记肿瘤异种移植模型的优化步骤。该异质性异种移植模型可模拟胰腺癌微环境的组织构成，在个性化的斑马鱼患者来源异种移植（zPDX）模型中为评估药物反应提供了更为精确的工具。...

利用斑马鱼幼虫作为宿主的胰腺癌患者来源异质性异种移植模型用于药物比较评估

该方法旨在通过将哺乳动物肿瘤细胞异种移植到血管带有荧光标记的斑马鱼胚胎中，建立体内肿瘤血管生成模型。通过成像观察异种移植的肿瘤及其相关血管，可定量评估血管生成反应。...

斑马鱼肿瘤异种移植模型中宿主血管生成反应的活体成像与定量分析

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。...

斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。...

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

了解利用斑马鱼胚胎快速评估急性淋巴细胞白血病药物反应的异种移植方法。该方案通过阻断免疫细胞分化提高移植物存活率，为儿科肿瘤学研究提供可靠的临床前模型。

快速体内利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

探索更多视频

快速 体内 利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

探索更多视频

快速体内利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应