小胶质细胞发育的人脑类器官的衍生
2025年1月17日
我们提出了一种方案，通过将诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的造血祖细胞 （HPC） 整合到类器官发育中来生成具有驻留小胶质细胞的人脑类器官。
我们提出了一种方案，通过将诱导多能干细胞衍生的造血祖细胞掺入神经元类器官诱导和发育过程中，生成包含常驻小胶质细胞和神经元的人脑类器官。该方法提供了一个模型来研究人脑发育过程中小胶质细胞和神经元之间的相互作用。3D 脑类器官是由诱导多能干细胞或 iPSC 产生的微型大脑。
作为动物和人类受试者的替代品，它们已被广泛用于模拟大脑发育和神经系统疾病的研究。它们是推进人类健康研究的绝佳工具。3D 人脑类器官的常规方案很少产生小胶质细胞，即人脑的常驻免疫细胞，因为这些细胞来自与神经元不同的胚胎谱系。
虽然小胶质细胞可以在分化的后期添加到大脑类器官中，但需要一种更好地模拟人脑发育的方法。大多数其他方案在脑类器官生成结束时添加 HPC 或小胶质细胞。在神经诱导之前，我们从混合的 iPSC 和 HPC 中生成胚状体。
这可能更好地模拟人脑发育，因为小胶质细胞前体在发育的早期就迁移到大脑。此外，使用 HPC 可以节省总分化时间，因为小胶质细胞分化方案通常需要 30 天以上。因此，我们的方案可以节省时间和试剂成本。
首先，在含有 1 毫升 E8 Flex 培养基的 12 孔板中培养解离的人诱导多能干细胞或 iPSC，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞 24 小时。第二天，在显微镜下检查菌落，并通过扫描孔中的所有字段来计算菌落的数量。用造血试剂盒中的 1 毫升培养基 A 替换培养基。
将板放回培养箱中 48 小时。第 3 天，用 500 微升新鲜培养基 A 替换 500 微升用过的培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。第二天，观察细胞生长和从 iPSC 集落分化。
用 1 毫升培养基 B 替换培养基，在显微镜下监测细胞分化，并每隔一天用 500 微升培养基 B 更换一半培养基，持续 6 至 7 天。第 10 天，观察明亮的单圆形细胞的存在，其形态为正常造血祖细胞或 HPC，漂浮或松散地附着在带有一些松散聚集体的扁平层细胞上。接下来，通过使用 1 毫升移液器吸头上下吹液 3 次来收集所有不同的 HPC。
将细胞转移到 15 毫升试管中。将细胞悬液以 300G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL 培养基 B 中，将 20 μL 细胞悬液加入细胞计数室中，并使用细胞仪对细胞进行计数。使用培养基 B 将细胞浓度调整为 100 万个细胞/毫升.连续稀释培养技术产生适当数量和大小的 iPSC 集落，在培养基 A 中培养结束时，菌落显示出显着的形态变化.在培养基 B 中培养三天后，观察到 HPC 分化，出现均匀的圆形细胞。
在第 10 天，HPC 主要形成集落状簇，没有明显的碎片。收集从人类 iPSC 分化而来的 HPC 后，验证 iPSC 的培养物是否已达到 80% 汇合。将 500 微升抗粘附冲洗液加入微孔板的一个孔中，以最大限度地减少气泡形成。
在装有板架的水平转头中以 2， 000G 离心板 5 分钟。完全去除冲洗液，用 1 毫升 DPBS 洗涤孔，然后用 1 毫升 DMEM/F-12 洗涤孔两次，不产生气泡。用 1 毫升 ACCUTASE 溶液处理 iPSC 以启动细胞解离。
在显微镜下观察细胞，注意到细胞分离的迹象，而细胞仍然附着在底部。用 1 毫升 DMEM/F-12 培养基替换 ACCUTASE 溶液，然后上下混合，将细胞解离成单个细胞。将解离的细胞转移到 15 mL 试管中，并加入 DMEM/F-12 培养基，使最终体积达到 5 mL。
将细胞以 300G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL E8 Flex 培养基中。对细胞进行计数，以将 E8 Flex 培养基中的细胞浓度调整为 100 万个细胞/毫升。接下来，将 iPSC 与 HPC 以 2:1 的比例混合到微孔培养板的孔中。
将每 1 毫升培养基中加入 1 微升 ROCK 抑制剂 Y-27632 储备溶液到上清液中，并左右摇动板。将板以 300G 离心 5 分钟，并在显微镜下观察以确认细胞已沉淀到微孔中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育。
48 小时后，在显微镜下观察细胞是否有拟胚体 （EB） 形成。接下来，用 500 μL 抗粘附冲洗缓冲液处理 24 孔细胞培养板 15 分钟，以形成低贴壁板。用 1 毫升 DPBS 洗涤孔两次，并向每个孔中加入 1 毫升 E8 Flex 培养基。
使用 1 毫升宽孔移液器吸头，将 EB 重悬于微孔培养板中。然后，对于低吸附 24 孔板的每个孔，加入 100 微升含有 EB 的培养基。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育 48 小时。
首先，将基底膜基质的等分试样在冰上解冻 30 分钟。在 EB 形成后的第二天，使用预冷的 20 微升移液器吸头，在培养基顶部以小滴加入 15 微升冰冷的基底膜基质以包被 EB。将板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中 48 小时。
在 EB 形成后的第 4 天，小心去除 500 微升培养基，而不干扰 EB 并重复基底膜基质涂层，如前所述。然后，在细胞顶部添加 500 μL 多能干细胞神经诱导培养基。将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中。
在第 6 天和第 8 天，小心地用 500 微升新鲜神经诱导培养基替换 500 微升培养基，进行半培养基更换。在第 10 天、第 12 天和第 14 天孵育后，用神经干细胞培养基进行半培养基更换。第 15 天，将含孔球体与培养基一起转移到用 Anti-Adinence 冲洗溶液处理的新 12 孔板中。
在培养物顶部添加 500 μL 神经元成熟培养基。在成熟阶段，监测培养基是否有营养消耗的迹象，例如颜色变化。如果观察到营养耗尽，则将类器官转移到六孔板中。
第 17 天，在成熟培养基中补充细胞因子 6 天，以促进小胶质细胞成熟。最后，在第 23 天，收集所得的神经类器官进行表征。高质量的 HPC 和 iPSC 混合物在 24 小时内形成 EB，显示出持续生长和最少的碎片。
转移到新板后，EBS 继续生长，直到在成熟培养基中达到平台期。
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概述
本文介绍了一种生成包含驻留小胶质细胞和神经元的人脑类器官的协议。通过将诱导多能干细胞衍生的造血祖细胞纳入类器官发育过程中，该方法允许研究大脑发育过程中小胶质细胞与神经元之间的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 类器官技术
背景
- 3D脑类器官是由诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的迷你大脑。
- 它们作为脑研究中动物模型和人类受试者的替代品。
- 传统协议通常无法生成小胶质细胞，而小胶质细胞对于研究大脑免疫反应至关重要。
- 本研究解决了需要一个包含神经元和小胶质细胞的模型的需求。
研究目的
- 开发一个创建包含驻留小胶质细胞的脑类器官的协议。
- 促进研究小胶质细胞与神经元之间的相互作用。
- 增强对人类大脑发育和神经系统疾病的理解。
使用的方法
- 将iPSC衍生的造血祖细胞纳入类器官发育过程中。
- 在类器官内诱导神经元分化。
- 使用3D培养技术支持类器官生长。
- 评估类器官模型中小胶质细胞和神经元的相互作用。
主要结果
- 成功生成同时包含神经元和小胶质细胞的脑类器官。
- 在发育过程中证明了小胶质细胞与神经元之间的相互作用。
- 提供了一个研究人类大脑发育的可行模型。
- 突出了在脑类器官研究中包含免疫细胞的重要性。
结论
- 所开发的协议使研究小胶质细胞-神经元相互作用成为可能。
- 该模型可以推进神经系统疾病的研究。
- 未来的研究可以利用这个类器官模型在神经科学中的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating microglia into human brain organoids addresses a critical gap in modeling neuroimmune interactions relevant to early-stage CNS drug discovery. This approach enhances predictive confidence for neuroinflammation and neurodevelopmental disease research by enabling mechanistic de-risking at the interface of neuronal and innate immune development. The model supports translational continuity from discovery biology to preclinical evaluation for neuroinflammatory and neuroinfectious disorder pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglia-neuron interactions during human brain development.
- Supports functional target validation for neuroimmune pathways implicated in CNS disorders.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling early immune-neural crosstalk.
- Improves predictive confidence for target selection in neuroinflammation research.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D human system for quantitative assessment of neuroimmune responses.
- Enables reproducible incorporation of microglia for standardized assay development.
- Supports screening of compounds affecting both neuronal and microglial biology.
- Allows for scalable generation of organoids with consistent microglial content.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for neuroinflammatory and neuroinfectious disorders.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for CNS therapeutic candidates.
- Provides a platform for translational biomarker exploration in human-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid model fits within the early discovery to preclinical continuum, bridging target validation, assay development, and translational research for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroimmune interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a human 3D context.
- Analytics: Enables immunostaining and single-cell RNA sequencing to compare microglial and neuronal development.
- Translational Research: Provides disease-relevant modeling for neuroinflammation and infection studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS and neuroimmune research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes microglial incorporation and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of CNS programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammation and neurodevelopmental assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, hematopoietic differentiation, and 3D organoid systems.
- Needs access to cell culture infrastructure and analytical platforms for immunostaining and scRNA-seq.
- Demands cross-team standardization for reproducible microglial incorporation and organoid quality.
- May require adaptation for different iPSC lines or disease-specific modeling.
- Technical challenges include maintaining consistency in microglial quantity and quality across batches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Introduction
1:53
Generating Hematopoietic Progenitor Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells for Use in Embryoid Body Formation
4:44
Developing Embryoid Bodies from Mixed-Induced Pluripotent Stem Cells and Hematopoietic Progenitor Cells
7:58
Induction, Proliferation, and Maturation of 3D Neural Organoids from Embryoid Bodies
