使用基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a 的系统快速、特异性地检测 鲍曼不动杆菌 感染

我的研究重点是呼吸系统疾病和感染。我将讨论该领域当前进步的技术以及整个项目领域的研究差距。我们在这里讨论的关键技术包括下一代测序、CRISPR、单细胞RNA测序和器官分析模型。他们对标准心脏病的诊断工作有着严格的结论，并提出了更好的治疗方法。我的方案满足了对鲍曼不动杆菌进行快速和特异性检测的需求，克服了当前诊断问题的局限性，例如耗时和基于培养的技术。

[旁白]首先，使用基于标准设计原则的引物设计工具设计 12 对引物。获得四个正向引物和三个反向引物，组成12对引物。使用国家生物技术信息中心的 Primer-BLAST 工具评估每个引物对的特异性和有效性。然后使用 LbaCas12a CRISPR RNA 支架序列作为固定序列设计 CRISPR RNA 或引导 RNA 或 gRNA。合并靶标特异性片段，确保原间隔区相邻基序或 PAM 位于非互补链的五素数端。对于阳性重组质粒的构建，首先使用正向和反向引物组扩增鲍曼不动杆菌 16S rDNA 片段。制备屏幕上给出的 50 微升 PCR 反应混合物。在PCR机上设置PCR循环条件。纯化阳性PCR产物后，将其克隆到用BamHI和SalI酶消化的PUC57载体中。用灭菌的双蒸馏水以十倍的增量连续稀释阳性重组质粒。将稀释的质粒储存在-20摄氏度以供进一步实验。接下来，将无引物的再水化缓冲液、鲍曼不动杆菌的正向和反向引物以及双蒸馏水混合在一起，最终体积为 465 微升。涡旋并短暂旋转混合物，然后将其从 RPA 试剂盒转移到酶反应管中。充分混合并加入 25 微升 280 毫摩尔醋酸镁。接下来，将每微升含有 10⁷ 拷贝的阳性重组质粒移液到具有不同引物对的溶液 A 中。将溶液在 39 摄氏度下孵育 20 分钟。然后使用 RPA 纯化试剂盒纯化扩增产物。将纯化产物在 120 伏的 1% 琼脂糖凝胶上运行 10 分钟，以鉴定具有最亮和最宽条带的引物对。为了优化RPA扩增系统，在将溶液A的最终体积调整为465微升的同时，保持所有其他反应组分的浓度恒定。然后加入适当体积的无RNA双蒸水，以获得给定的最终引物浓度并孵育。对RPA产物进行纯化和电泳后，通过分析谱带强度和分布来确定最佳引物浓度和孵育时间。要制备溶液 B，将单链 DNA 报告基因、CAST12a 反应缓冲液、CRISPR RNA CAST12a 和双蒸馏水混合在一起，最终体积为 15 微升。将五微升重组酶聚合酶扩增或RPA产物加入溶液B中，充分混合直至均匀。将样品放入荧光定量PCR仪器中。对于特异性测试，使用参考 DNA 提取试剂盒或通过在水中煮沸细菌来获取来自不同物种的 DNA 模板。使用水作为阴性对照。将 10 纳克或 1 微升 DNA 模板转移到含有正向和反向引物的溶液 A 中。然后移液 25 微升 280 毫摩尔醋酸镁。充分混合并在 39 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育后，将5微升反应产物加入溶液B中并混合。将样品放入荧光定量PCR仪器中。将通道设置为FAM，在39摄氏度下每分钟读取荧光信号，总共60分钟。为了评估基于RPA-CRISPR CAST12a的检测平台的灵敏度，使用稀释至每微升1至10⁷拷贝的浓度的阳性重组质粒作为反应模板。使用水作为阴性对照。将质粒转移到溶液A中，加入醋酸镁，如前所述孵育。孵育并转移到溶液B中后，读取荧光标志铝。引物对F3-R3被鉴定为重组酶聚合酶扩增最有效的，在琼脂糖凝胶电泳中显示出最亮和最致密的条带。扩增的最佳引物浓度为0.44微摩尔，最佳反应时间为20 min。CRISPR RNA1的荧光强度随时间增加而增加，而CRISPR RNA2则没有，因此选择CRISPR RNA1进行鲍曼不动杆菌检测。特异性分析证实，鲍曼不动杆菌检测系统仅检测鲍曼不动杆菌DNA，其他细菌DNA样品未观察到荧光。该系统每微升 DNA 可以检测到低至一个拷贝，使其高度灵敏。侧流条测定证实了检测方法的高特异性，显示出与其他细菌物种的交叉反应。鲍曼不动杆菌测定成功检测了从每微升 10⁷ 拷贝到每微升单拷贝的稀释度的 DNA，证实了其在紫外光下的稳健性。