Name: 使用基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a 的系统快速、特异性地检测 鲍曼不动杆菌 感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解基于重组酶聚合酶扩增与Cas12a的检测系统，用于快速、特异性识别鲍曼不动杆菌感染。该方法灵敏度达每微升一个拷贝，为临床诊断提供高效替代方案。

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本工作由吉林省科学技术发展计划项目（20240305027YY）和吉林省财政厅（JLSWSRCZX2023-55，JLSWSRCZX2021-041）资助。

1. 构建 A. baumannii -DETECTR
注意：A. baumannii-DETECTR 的构建是一个四步过程，包括引物和crRNA的设计、阳性重组质粒的构建、反应溶液的制备、通过RPA进行等温DNA扩增，以及RPA-CRISPR/Cas12a检测结果的可视化。DETECTR检测的示意图见图1。
<ol>
	<li>引物与crRNA的设计（参见 补充文件 1)
	<ol>
		<li>根据引物设计原则，使用设计工具设计12对引物。获得4条正向引物（F0–F3）和3条反向引物（R1–R3），组合成12对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。
		<ol>
			<li>确保引物的5'端前3-5个核苷酸中包含C或T碱基，避免连续的G序列。同时，引物3'端的最后三个核苷酸最好为G和C碱基，以增强扩增效率。</li>
			<li>设计引物时应避免自身互补序列，以防形成发夹结构，且引物之间互补或同源碱基数不超过四个。避免引物3'端互补，以防引物二聚体形成。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Primer-BLAST工具评估每对引物的特异性，以评价引物的有效性和特异性。 
		注意：Primer-BLAST 可利用 NCBI 数据库查找与设计引物匹配的序列，帮助用户评估引物的有效性和特异性。</li>
		<li>引物筛选完成后，使用 LbaCas12a crRNA 骨架序列（5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'）作为固定序列，设计 CRISPR RNA（crRNA）或引导 RNA（gRNA）。插入靶点特异性片段（5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'），并确保 PAM 序列位于非互补链的 5' 端。 
		注意：所有寡核苷酸和crRNA的序列均列于 表1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阳性重组质粒构建
	<ol>
		<li>使用引物组扩增16S rDNA片段 A. baumannii 16s rDNA-F（正向引物）和 A. baumannii 16S rDNA-R（反向引物）
		<ol>
			<li>加入1 µL 10 µM F和10 µM R，以及10 µL 5x 快速pFu缓冲液，1 µL 快速pFu DNA聚合酶，4 µL的2.5 mM&#160;dNTPs，1 µL 10 ng/µL A. baumannii 基因组DNA和32 µL无核酸酶水加入至50 µL PCR体系中。</li>
			<li>PCR扩增循环条件设置如下：95 °C预变性5 min；随后进行33个循环，每个循环为95 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸1 min 20 s；最后72 °C终延伸10 min。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化阳性PCR产物。随后，将纯化的DNA克隆至经BamHI和SalI酶切的pUC57载体中。 
		注意：该过程将产生含有保守区域的阳性重组质粒。</li>
		<li>将阳性重组质粒用灭菌的ddH₂O进行10倍倍比稀释2O 以达到每微升1个拷贝至10个拷贝的浓度7 拷贝/µL 将稀释后的质粒于 -20 °C 保存，以备后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液配制
	<ol>
		<li>按如下步骤配制溶液A：每反应加入29.5 µL无引物重悬缓冲液和2.4 µL 10 µM A. baumannii- F 和 10 µM A. baumannii-R，和12.2µL 的 ddH2O，使终体积为46.5 µL。涡旋混匀，短暂离心。随后，将反应混合物加入RPA试剂盒的酶反应管中。用移液器吹打混匀。 
		注意：本实验采用针对A. baumannii的F和R引物 A. baumannii 基因。请参阅 表1 用于该序列。</li>
		<li>按如下步骤配制溶液B：每个反应中加入0.24 µL的10 µM ssDNA报告探针、2 µL的10x Cas12a反应缓冲液、1 µL的1 µM crRNA、1 µL的1 µM Cas12a以及10.76 µL的无核酸酶水，混匀。µL 的 ddH2O，以达到终体积15 µL。 
		注意：探针（单链DNA报告探针）为外购产品，包含一条单链DNA报告探针，其5'端标记有5-羧基荧光素（FAM）荧光基团，3'端标记有黑洞淬灭剂1（BHQ1）淬灭基团。若需检测大量样本，可预先配制足量的溶液B，随后再分装成若干 aliquot 使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等温DNA扩增（RPA）
	<ol>
		<li>加入1 µL 10的阳性重组质粒7 将不同引物对的拷贝数/µL加入溶液A中，充分混匀。然后，向溶液中加入2.5 µL的280 mM乙酸镁（MgOAc），充分混匀。 
		注意：RPA 反应在加入 MgOAc 后立即开始。</li>
		<li>39 °C孵育20分钟。20分钟后，使用纯化试剂盒对RPA扩增的不同引物产物进行纯化，然后将纯化后的扩增产物在120 V电压下于1%琼脂糖凝胶中电泳10分钟，选择最亮且最宽的条带作为最佳引物对。 
		注意：对于模板拷贝数较低的情况，在孵育4分钟后，取出EP管，涡旋振荡并短暂离心，然后放回加热装置中继续孵育16分钟。扩增完成后，应极其小心地打开管盖，避免扩增产物污染工作台面。此预防措施可降低后续实验中出现假阳性结果的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RPA 扩增体系的优化 
	注意：在上一步中选定的最佳引物对 F3R3 设置了不同的终浓度，用于 RPA 扩增反应，以筛选出最佳的引物浓度和反应时间。NC 为相应引物浓度的空白对照。
	<ol>
		<li>保持溶液A中其他组分的浓度不变，总体积为46.5 µL。调整RNase-free ddH₂O的体积2O 相应地调整，使引物终浓度分别为 10 µM F3 和 10 µM R3，对应体积浓度为 0.40 µM (2.0 µL)、0.44 µM (2.2 µL)、0.48 µM (2.4 µL) 和 0.52 µM (2.6 µL)。</li>
		<li>在39 °C下孵育不同时间：10分钟、20分钟、30分钟。</li>
		<li>使用DNA纯化试剂盒纯化RPA产物，并在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳10分钟，通过分析条带特征确定最佳引物浓度和孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RPA-CRISPR/Cas12a 检测的可视化
	<ol>
		<li>向溶液B中加入5 µL的RPA产物，充分混匀至均一状态。</li>
		<li>将样品放入荧光定量PCR仪中，设置FAM通道，在37 °C下每分钟读取一次数值，持续60分钟，共读取60次。 
		注意：绿色荧光信号可维持数天。为确保系统有效运行，建议进行无DNA和无RNase的检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基于RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的特异性评估
注意：为了测试 A. baumannii-DETECTR 的特异性，将 A. baumannii、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、Rickettsia mooseri、Enterobacter、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Chlamydia psittaci、Legionella、Coxiella burnetii、Serratia 以及人源样本的核酸进行了 DETECTR 检测。
<ol>
	<li>通过使用参考的DNA试剂盒或通过将细菌在水中煮沸来获得来自不同物种的DNA模板。确保所有模板的浓度相等。使用水作为阴性对照。</li>
	<li>将10 ng或1 µL的DNA模板加入含有F3R3引物的溶液A中。加入2.5 µL的MgOAc，充分混匀，并在39 °C下孵育20分钟。</li>
	<li>20分钟后，将上一步反应产物的5 µL加入溶液B中并混匀。</li>
	<li>放入荧光定量PCR仪中，将通道设置为FAM，在37 °C下每分钟读取一次荧光值，共读取60次，持续60分钟。</li>
</ol>
3. 基于RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的灵敏度评估
<ol>
	<li>使用已配制浓度为 1-107&#160;拷贝/µL 的阳性重组质粒作为反应模板，阴性对照使用水。</li>
	<li>按照步骤 2.2–2.4 进行操作。 
	注意：引物组 RPA-F3 和 RPA-R3 旨在从阳性重组质粒中扩增一段较短的 174 个碱基对的片段。</li>
</ol>
4. 样品在紫外光下及侧向流动试纸检测期间的准备工作
<ol>
	<li>取出所需数量的试纸条，并做好相应标记。</li>
	<li>分别将步骤 2 和步骤 3 中扩增产物各 10 µL 转移至不同的 PCR 管中，然后每管加入 40 µL 的 ddH2O。 
	注意：若使用自行配制的反应体系，建议探索最佳稀释比例。</li>
	<li>进行检测。
	<ol>
		<li>将含有扩增产物的 PCR 管置于凝胶成像仪下，观察是否存在荧光信号。</li>
		<li>将试纸条插入 PCR 管中，确保样品垫一端朝下。</li>
		<li>室温静置 5–10 分钟后读取结果。在此时间后，确保液体液面未超过最大标记线，再进行后续操作。</li>
		<li>若 T 线无显色，则判读结果为阴性；若 T 线肉眼可见显色，则判读结果为阳性，表明核酸探针已被 Cas 酶切割，且 Cas 酶已被激活；若 C 线和 T 线均无显色，则判读结果无效。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争利益。

传统的A. baumannii感染诊断方法存在多种限制，使其在即时检测中的可及性和可行性较低27。例如，PCR具有良好的灵敏度和特异性，但需要专业的热循环设备和复杂的操作流程，且必须由专业人员操作。本文介绍了一种新方法，即结合重组工程的RPA与CRISPR-LbaCas12a基因编辑技术，称为A. baumannii-DETECTR检测法，可实现高效的基因操作。该方法为Acinetobacter baumannii感染以及其他细菌病原体的诊断提供了快速、灵敏且特异的检测手段。工作流程如图1所示。
我们的方法在诊断和管理感染方面具有显著优势，有助于促进患者康复，并通过克服现有诊断技术的不足来遏制鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的传播。A. baumannii-DETECTR 系统被证实能够以高特异性和高灵敏度检测出 A. baumannii（<strong cla...

在临床微生物学中，检测Acinetobacter baumannii感染面临重大挑战。这种革兰氏阴性菌可引起具有严重临床症状的感染，甚至导致高死亡率，尤其在免疫功能低下患者中更为显著1。传统的基于培养的病原体检测方法耗时较长，且可能灵敏度不足，从而延迟抗生素治疗，影响患者预后。快速而准确地鉴定A. baumannii对于有效治疗和控制暴发至关重要。为满足这一需求，已探索采用核酸扩增的分子技术。然而，这些方法通常需要复杂的热循环设备，并受限于训练有素的技术人员和设施完善的实验室。为克服这些局限，研究 increasingly 集中于开发等温扩增技术2,3,4。
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）是由 Piepenburg 等人建立的一种 DNA 扩增方法5，其原理类似于聚合酶链式反应（PCR），但无需进行温度循环。该方法包含以下组分：50 mM Tris（pH 7.5）、100 mM 醋酸钾、14 mM 醋酸镁、2 mM DTT、5% PEG20000（一种高分子量的聚乙二醇）、200 µM dNTPs、3 mM ATP、50 mM 磷酸肌酸、100 µg/mL 肌酸激酶、120 µg/mL UvsX、30 µg/mL UvsY、900 µg/mL Gp32、30 µg/mL Bsu LF、450 nM 引物以及 DNA 模板。扩增过程始于重组酶蛋白 UvsX 在 3 mM ATP 和 5% PEG20000 存在下与引物结合，形成重组酶-引物复合物。该复合物随后促进引物与双链 DNA 上同源序列的结合。
在UvsY的协助下，重组酶UvsX促进引物与模板链之间的交换，导致靶DNA的一条链被置换。Gp32有助于维持单链DNA的结构。最终，重组酶解离，一种具有链置换能力的DNA聚合酶（Bsu LF）结合到引物的3'端，并在脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）存在下延伸引物。该过程以循环方式重复进行，实现指数级扩增。所有扩增过程可在20至40分钟内完成，反应温度相对恒定，介于37 °C至42 °C之间。该温度范围与生理温度相近，使得RPA可在简化的环境中进行，因而RPA成为一种多功能且高效的DNA检测与分析工具。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR-Cas）系统在细菌和古菌中作为适应性免疫机制发挥作用，包括I类和II类系统。II类系统包含Cas12（a、b、f）、Cas13（a、b）和Cas14等蛋白，这些蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引导下识别并切割靶标DNA或RNA6,7,8。LbaCas12a（或Cpf1）是一种由crRNA引导的DNA内切酶。crRNA在CRISPR-Cas系统中作为引导RNA，与Cas蛋白形成复合物。它利用其间隔序列与靶标DNA配对，从而有效地将蛋白复合物导向靶序列。序列5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'是保守的crRNA重复序列，为所有LbaCas12a crRNA中的恒定元件。该重复序列之后是一个靶标特异性片段，其序列根据预期的DNA靶标而有所不同。该靶向序列长度为18至24个核苷酸。
PAM（Protospacer-Adjacent Motif）序列（TTTV，其中V可以是A、C或G）位于DNA靶标非互补链的5'端。Cas12a在PAM序列处切割靶向的双链DNA。随后，被激活的Cas蛋白对单链DNA（ssDNA）执行非特异性的反式切割9,10,11,12。因此，带有荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA在发生附带切割后被裂解，从而产生荧光信号8,13。可通过荧光检测仪定量荧光强度，实现对核酸的精确定量检测14。值得注意的是，Cas12a被广泛用于DNA分析，其对靶序列的结合与切割依赖于对Protospacer-Adjacent Motif（PAM）的识别，而Cas13a则无需该识别条件。
CRISPR-Cas 系统15,16,17 可在单个反应中实现切割18,19,20,21。将上述两种技术结合，可构建一种名为 A. baumannii-DETECTR（LbaCas12a 介导的靶向 A. baumannii 检测）的高效检测工具，用于核酸检测22,23,24。本方案展示了将 RPA 与 Cas12a 的 DNase 活性相结合，特异性靶向并切割 A. baumannii 16s rDNA 基因中由 crRNA 引导的序列，从而实现对该病原体的高灵敏度和高精确度检测。
这 A. baumannii-DETECTR 方法相较于传统检测方法具有多项优势25,26首先，等温的&#160;RPA 流程简化的特征&#160;流程并降低成本&#160;无需热循环仪的扩增&#160;机制5其次，Cas12a 核酸酶通过 crRNA 介导的靶向作用和沃森-克里克碱基配对提高检测的特异性。7最后，使用单管法 A. baumannii-DETECTR 不仅节省时间，还显著降低了扩增子污染的风险19.
本方案详细描述了DNA提取的步骤、目标DNA序列的选择、引物和crRNA的设计、阳性重组质粒的构建、Cas12a-RPA检测体系的建立、RPA扩增条件的优化，以及利用实时荧光检测仪器（如实时荧光PCR仪）对结果进行可视化分析，并包含灵敏度与特异性评估。
A. baumannii-DETECTR 方法有望通过促进及时有效的治疗、强化感染控制以及遏制抗生素耐药性的传播，从而改善患者的治疗效果。本方案可作为 Cas12a-RPA 技术实施的全面指南，提升其在各类医疗环境中的应用价值。然而，必须注意的是，每个步骤都应根据具体的实验室条件和样本类型进行优化，以确保结果的一致性和可靠性。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;-20 &amp;deg;C 冷冻柜</td><td>Haier</td><td>HYCD-290</td><td>中国</td></tr><tr><td>琼脂糖基础</td><td>BioFroxx</td><td>1110GR100</td><td>中国</td></tr><tr><td>所有寡核苷酸和crRNA均由公司合成</td><td>www.comatebio.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas12a切割底物 - 单链DNA - 荧光型</td><td>EZassay Biotech. Co. Ltd.</td><td>DNA-FAM-BHQ</td><td>中国</td></tr><tr><td>Cas12a切割底物 - 单链DNA - 试纸型</td><td>EZassay Biotech. Co. Ltd.</td><td>DNA-FAM-BIO</td><td>中国</td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>BIO-RAD</td><td>POWER PAC1000</td><td>美国</td></tr><tr><td>荧光定量PCR仪</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX Connect</td><td>美国</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>BIO-RAD</td><td>Gel Doc 2000</td><td>美国</td></tr><tr><td>https://ezassay.com/rna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.ezassay.com/primer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>侧向流动试纸条（生物素/FAM）</td><td>EZassay Biotech. Co. Ltd.</td><td>HD-FMBO</td><td>中国</td></tr><tr><td>LbaCas12a (Cpf1) 增强蛋白</td><td>EZassay Biotech. Co. Ltd.</td><td>CAS-12E-001</td><td>中国</td></tr><tr><td>LED透射仪</td><td>LABGIC</td><td>BL-20</td><td>中国</td></tr><tr><td>乙酸镁，MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>英国</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>allsheng</td><td>Mini-6k</td><td>中国</td></tr><tr><td>PCR条形管</td><td>PCR条形管</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>中国</td></tr><tr><td>TGrade干浴孵育器</td><td>Tiangen biochemical technology&amp;nbsp;</td><td>OSE-DB-01</td><td>中国</td></tr><tr><td>天根细菌DNA提取试剂盒</td><td>Tiangen biochemical technology&amp;nbsp;</td><td>DP302-02</td><td>中国</td></tr><tr><td>TIANamp 细菌DNA提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>TIANGEN BIOTECH&amp;nbsp;(BEIJING) CO.; LTD.</td><td>DP302</td><td>&amp;nbsp;中国&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TransStart&amp;nbsp;FastPfu&amp;nbsp;DNA聚合酶&amp;nbsp;</td><td>TransGen Biotech. Co. Ltd.</td><td>AP221</td><td>&amp;nbsp;中国&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic试剂盒</td><td>TwistDX</td><td>TABAS03KIT</td><td>英国</td></tr><tr><td>通用DNA纯化试剂盒</td><td>Tiangen biochemical technology&amp;nbsp;</td><td>DP214-03</td><td>中国</td></tr></tbody></table>

基于重组酶聚合酶扩增/cas12a系统的acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii 是一种革兰氏阴性细菌，因其可引起高死亡率的严重感染而臭名昭著。快速且准确地检测 A. baumannii 对于及时治疗、有效控制感染以及遏制抗生素耐药性至关重要。然而，目前尚无适用于现场快速、简便检测 A. baumannii 的理想方法。DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统（DETECTR）结合了Cas12a的靶标特异性识别能力与重组酶聚合酶扩增（RPA）的等温扩增高效性，为 A. baumannii 的检测提供了一种快速、精确且灵敏的方法。本方案详细描述了利用RPA与LbaCas12a内切酶联合检测 A. baumannii 的实验流程。本文所述步骤包括：DNA提取、特异性DNA序列的选择、引物与CRISPR RNA（crRNA）的设计、阳性重组质粒的构建、Cas12a-RPA检测体系的建立、RPA扩增系统的优化、使用实时荧光PCR仪等荧光检测工具对RPA-CRISPR/Cas12a检测结果进行可视化，以及灵敏度与特异性的评估。

本研究中，我们介绍了一种名为 A. baumannii-DETECTR 的新型便携式诊断平台，该平台结合了RPA的等温扩增效率与CRISPR-Cas12a系统，可实现对 A. baumannii 的快速、可靠的现场鉴定。DETECTR检测方法的示意图见图1。
根据引物设计原则，使用设计工具设计了十二对引物。共获得四条正向引物（F0-F3）和三条反向引物（R1-R3），由此组合成12对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。在39 °C下进行RPA扩增20分钟之后，将RPA-PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳10分钟，以确定最佳引物组合。结果显示F3R3引物对效果最优，其条带最亮且最浓密（图2）。...

为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A. baumannii感染。

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种革兰氏阴性细菌，因可引起高死亡率的严重感染而臭名昭著。对其进行快速、准确的检测……

我的研究聚焦于呼吸系统疾病与感染。我将探讨该领域内正在发展的前沿技术以及整个研究领域存在的空白。此处讨论的关键技术包括下一代测序、CRISPR、单细胞RNA测序以及类器官分析模型。这些技术在标准心脏疾病的诊断方面具有明确的应用价值，并有助于开发更有效的治疗方法。本实验方案旨在实现对鲍曼不动杆菌的快速且特异性的检测，克服当前诊断方法中存在的局限性，例如耗时较长且依赖培养的技术。[旁白] 首先，根据标准设计原则，使用引物设计工具设计12对引物。通过4条上游引物和3条下游引物组合形成12对引物对。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的Primer-BLAST工具，评估每对引物的特异性和扩增效率。随后，以LbaCas12a CRISPR RNA的支架序列为固定序列，设计CRISPR RNA（即向导RNA或gRNA），并插入靶标特异性片段，确保原间隔序列邻近基序（PAM）位于非互补链的5'端。为构建阳性重组质粒，首先使用上游和下游引物组合扩增鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的16S rDNA片段。按照屏幕上所示配制50微升PCR反应体系。在PCR仪上设置相应的PCR扩增循环条件。对阳性PCR产物进行纯化后，将其克隆至经BamHI和SalI酶切处理的PUC57载体中。用灭菌的双蒸水将阳性重组质粒进行10倍系列稀释。将稀释后的质粒于-20°C保存，以备后续实验使用。接下来，将不含引物的复溶缓冲液、鲍曼不动杆菌的上游和下游引物以及双蒸水混合，总体积为465微升。涡旋混匀后短暂离心，再转移至RPA试剂盒中的酶反应管。充分混匀后，加入25微升280毫摩尔/升的醋酸镁。随后，取1微升含有10⁷拷贝/微升的阳性重组质粒，加入含有不同引物对的溶液A中。在39°C下孵育20分钟。然后使用RPA纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。将纯化后的产物在1%琼脂糖凝胶中以120伏电压电泳10分钟，选择条带最亮且最宽的引物对。为优化RPA扩增体系，在保持其他反应组分浓度不变的前提下，调整溶液A的终体积为465微升。然后加入适量无RNA酶的双蒸水，使引物终浓度达到指定值，并进行孵育。对RPA产物纯化并进行电泳后，通过分析条带强度和分布，确定最佳引物浓度和孵育时间。配制溶液B时，将单链DNA报告探针、CAST12a反应缓冲液、CRISPR RNA CAST12a及双蒸水混合，终体积为15微升。向溶液B中加入5微升重组酶聚合酶扩增（RPA）产物，充分混匀至均一状态。将样品放入荧光定量PCR仪中。进行特异性检测时，使用参考DNA提取试剂盒或通过将细菌在水中煮沸的方法，获取多种物种的DNA模板。以水作为空白对照。将10纳克（或1微升）的DNA模板加入含有上游和下游引物的溶液A中。然后加入25微升280毫摩尔/升的醋酸镁。充分混匀后于39°C孵育20分钟。孵育结束后，取5微升反应产物加入溶液B中并混匀。将样品放入荧光定量PCR仪中。设置检测通道为FAM，于39°C每分钟读取一次荧光信号，共持续60分钟。为评估基于RPA-CRISPR CAST12a检测平台的灵敏度，使用稀释至每微升1至10⁷拷贝的阳性重组质粒作为反应模板。以水作为空白对照。将质粒加入溶液A，加入醋酸镁后按前述方法孵育。孵育结束后转移至溶液B，读取荧光信号。结果表明，引物对F3-R3在重组酶聚合酶扩增中效果最佳，在琼脂糖凝胶电泳中显示出最亮且最密集的条带。扩增的最佳引物浓度确定为0.44微摩尔，最佳反应时间为20分钟。CRISPR RNA1的荧光强度随时间逐渐增强，而CRISPR RNA2无此现象，因此选择CRISPR RNA1用于鲍曼不动杆菌的检测。特异性分析证实，该鲍曼不动杆菌检测系统仅能特异性识别鲍曼不动杆菌DNA，对其他细菌DNA样本未观察到荧光信号。该系统最低可检测到每微升1拷贝的DNA，具有高度灵敏性。侧向流动试纸条实验进一步验证了该检测方法的高特异性，未与其他细菌种类发生交叉反应。该鲍曼不动杆菌检测方法成功检测出从每微升10⁷拷贝至单拷贝浓度范围内的DNA，证实其在紫外光下具有良好的稳健性。

rapid-specific-detection-acinetobacter-baumannii-infections-using

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a 的系统快速、特异性地检测 鲍曼不动杆菌 感染

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。...

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。...

扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter...

可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法

我们提出了一种将重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a系统相结合的方案，用于DNA病毒的痕量检测，并构建了便携式智能手机显微镜，结合人工智能辅助分类，实现现场DNA病毒检测。...

基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

我们描述了一种利用基于mini-Tn7的表达系统，在已构建的外排泵缺陷型鲍曼不动杆菌（Acinetobacter...

表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统&#45;缺陷型细菌菌株与单拷贝&#45;单拷贝基因表达系统

多种细菌性病原体可引起呼吸道感染，若未能准确检测并及时治疗，可能导致严重的健康问题。通过环介导等温扩增技术 对这些病原体进行快速且准确的检测，有助于在临床环境中有效管理和控制呼吸道感染。...

基于微流控芯片的环介导等温扩增技术快速检测引起下呼吸道感染的细菌性病原体

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。...

基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense...

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

本文介绍一种简单快速的检测蜜蜂病原体（如Lotmaria passim和Nosema...

现场检测锥虫科寄生虫和Nosema ceranae的DNA：基于碱裂解联合RPA/CRISPR/Cas12a系统的方法

了解基于重组酶聚合酶扩增与Cas12a的检测系统，用于快速、特异性识别鲍曼不动杆菌感染。该方法灵敏度达每微升一个拷贝，为临床诊断提供高效替代方案。

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

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