Name: 一种通过非遗传光刺激研究 Ca2+ 传播的心脏微生理系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 了解基于材料的光刺激技术如何推进心脏微生理模型研究。该方法利用Ziapin2光转导器实现非遗传光刺激，可在不损伤组织的情况下精确控制心肌细胞活动，为心脏生理学和药物筛选提供可靠工具。

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作者们衷心感谢 Michael Rosnach 为图1和图3提供的插图，以及 William T. Pu 教授提供的 hiPSC 细胞。本研究得到了以下资助：KKP 获美国国家转化科学促进中心组织芯片联盟（NCATS Tissue Chips Consortium，项目号 UH3 TR003279）支持；FL 获意大利大学与研究部 PRIN 2022 项目（项目号 2022-NAZ-0595）支持；CB 和 GL 获 PRIN 2020 项目（项目号 2020XBFEMS）支持；GL 还获得了意大利科学基金项目（Fondo Italiano per la Scienza，项目号 FIS00001244）的支持。

本研究使用的人类多能干细胞（hiPSC）培养物为携带强力霉素（Dox）诱导型CRISPR/Cas9系统的野生型人类男性iPSC细胞系，该细胞系通过将CAGrtTA::TetO-Cas9导入AAVS1位点构建而成（Addgene：#73500）。本研究遵循波士顿儿童医院机构审查委员会批准的方案进行。在患者参与研究前，均已获得其知情同意。人类多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的生成按照先前所述方法诱导25,26，具体方案将在下一部分简要概述：
1. 人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞的生成与制备
<ol>
	<li>用 PBS 清洗在 T75 培养瓶中培养的 hiPSCs 一次。使用螯合剂 Versene 孵育 10–15 分钟以解离细胞，并将细胞接种至预先用 1% 非离子表面活性剂溶液处理过的生物反应器容器中，接种密度为每容器 5000 万个 iPSCs，培养基为 100 mL 添加了 10 µM ROCK 抑制剂 Y-27632 的 E8 培养基。</li>
	<li>设定以下生物反应器参数：搅拌速度 60 rpm，温度 37 °C，pH 值 7，覆盖气体（O2 和 CO2）流速为 3 标准升/小时。</li>
	<li>培养 1 天后，确认拟胚体（EB）直径已达到 100–300 µm，随后用基础 RPMI 培养基（RPMI 1640 培养基添加 B27（不含胰岛素））处理细胞，其中含 7 µM CHIR99021，持续 24 小时；之后更换为不含添加剂的基础 RPMI 培养基继续培养 24 小时。再加入含 5 µM IWR-1-endo 的基础 RPMI 培养基继续培养 48 小时，以启动向心肌细胞谱系的分化过程。48 小时后，将培养基换回基础 RPMI 培养基。</li>
	<li>分化第 7 天，使用添加了 1:1,000（v/v）人胰岛素的基础 RPMI 培养基培养细胞。每 2 天更换一次培养基，或当耗氧量超过 30% 时每天进行一次 50% 培养基更换。</li>
	<li>第 15 天，使用含有 HBSS、胶原酶 II（200 单位/mL）、HEPES（10 mM）、ROCK 抑制剂 Y-27632（10 µM）和 N-苄基-p-甲苯磺酰胺（BTS，30 µM）的胶原酶 II 溶液对生物反应器中的细胞进行酶解解离，持续 3 小时。操作时，先用预热的 HBSS 清洗已分化的 hiPSC-CM 拟胚体两次，然后将其置于胶原酶 II 溶液中（每 200 µL 拟胚体体积加入 12 mL 胶原酶 II 溶液），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，直至拟胚体完全解离为单细胞。</li>
	<li>通过向单细胞悬液中加入等体积的阻断缓冲液（不含 B27 和 DNase II 的 RPMI-1640，每毫升 RPMI-1640 中加入 6 µL DNase II）终止解离反应。计数已分化的 hiPSC-CMs，离心（200 × g，5 分钟），并通过在异丙醇中于 -80 °C 冷冻 24 小时后转移至液氮罐中保存，待后续接种使用。</li>
</ol>
2. 层状组织的构建
<ol>
	<li>将两层实验室胶带（一层白色，一层蓝色）粘贴至一张厚度为1 mm、透明、耐刮擦且耐紫外线的丙烯酸板上。使用CO₂激光切割机2 激光雕刻机，在亚克力板上切割出圆形（直径20 mm，以适配12 MW）以及按照矢量图形软件（如 CorelDraw）设计的芯片图案（3 x 7.5 mm 的正方形，每片芯片三个）；亚克力切割参数： 100 功率，20 速度， 和 1,000 PPI；胶带切割参数： 8 档功率，6 档速度， 和 1,000 PPI用镊子去除最内侧线条内的两层胶带，将芯片浸泡在纯漂白剂中30分钟至1小时，以去除切割产生的粗线和黑点，留下清晰的线条，然后将芯片置于烧杯中用流动的去离子（DI）水冲洗过夜或至少3小时。 
	注意：漂白时间不得超过2小时，否则会腐蚀侧壁上的粘合剂，导致明胶无法正常粘附。</li>
	<li>将芯片在洁净的70%乙醇中超声处理10分钟，将带有线槽结构（25 µm脊宽、4 µm槽宽、5 µm槽深）的聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）印章超声处理30分钟。将芯片和印章转移至通风橱内的洁净区域，在气流下干燥约1–2小时。</li>
	<li>称取1 g猪皮明胶（凝胶强度约175 g Bloom，A型）至50 mL离心管中。加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），充分混匀以确保明胶立即溶解。将离心管置于65 °C水浴中30分钟，完成溶解过程。同样，称取1 g微生物转谷氨酰胺酶（MTG）至另一50 mL离心管中。加入12.5 mL PBS，充分混匀后，将离心管置于37 °C水浴中30分钟，以确保MTG完全溶解。</li>
	<li>将明胶管超声处理15分钟，然后放回65 °C水浴中，备用。将MTG管放入干燥器中，管盖稍松，缓慢开启真空。观察MTG溶液在真空下释放气泡。脱气完成后，将MTG管放回37 °C水浴中。 
	注意：监控该过程，并调节真空度以避免剧烈沸腾。</li>
	<li>用干净的Parafilm覆盖网格片，将芯片放置在网格上，并将印章置于附近备用。向5 mL明胶溶液中加入5 mL MTG，用移液器小心吹打以避免产生气泡；随后迅速将明胶溶液滴加到芯片上，用量足以覆盖芯片区域（每片约0.5 mL）。然后，将带有线性图案的PDMS22 （线宽 25 µm，高度 5 µm，间距 4 µm）的印章置于顶部，并施加 200 g 的重物，以确保明胶图案与组织的长轴平行。所有芯片成型后，用玻璃罐覆盖，避免环境干扰，并使其交联过夜。 
	注意：混合溶液明胶-MTG 需在 5 小时内使用完毕&#160;分钟；否则，由于明胶交联程度较高，目标图案将发生改变。</li>
	<li>将芯片与PDMS印章的夹心结构转移至盛有PBS的新P150培养皿中，水合明胶30分钟至1小时，以促进PDMS印章与芯片的分离。去除芯片周围多余的未成型明胶，将清洁后的芯片转移至盛有PBS的新P150培养皿中。将PDMS印章保存于70%乙醇中。</li>
	<li>在通风橱中将芯片浸泡于乙醇中10分钟以进行灭菌。 
	注意：乙醇处理时间不得超过10分钟，否则长时间暴露可能导致明胶变形。</li>
	<li>将芯片转移至 PBS 中，浸泡 10 分钟，清洗 3 次。通过将 20 µg/mL 纤连蛋白与按 1:100 稀释的基底膜基质在培养基中混合，制备包被溶液（每孔约 0.5 mL）。将芯片置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 2 小时进行包被2 或在 4 °C 下过夜。</li>
	<li>解冻并接种细胞（8 × 105 每厘米的 hiPSC-CMs2在含 Y-27632（10 µM）的 RPMI 培养基中培养，24 小时后更换为不含 Y-27632 的 RPMI 培养基。</li>
	<li>细胞接种三天后，用镊子移除白色胶带。</li>
</ol>
3. 光换能器的合成与应用
注意：Ziapin2 根据先前发表的方法合成16,18，并直接加入培养基中作用于 hiPSC-CMs。
<ol>
	<li>向细胞培养物中加入 25 µM 的 Ziapin2，并在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 7 分钟。</li>
	<li>轻柔洗去多余的分子，并用新鲜培养基冲洗。</li>
</ol>
4. 活性检测
注意：Alamar Blue 是一种基于刃天青的检测方法，可穿透细胞并作为氧化还原指示剂来监测细胞活力。刃天青可溶于生理缓冲液，形成深蓝色溶液，可直接加入培养细胞中。具有活跃代谢活性的活细胞将刃天青还原为试卤灵，后者呈粉红色且具有荧光性。
<ol>
	<li>将细胞接种于已预先包被20 µg/mL纤连蛋白和1:100稀释的基底膜基质的96孔板中，轻轻振荡混匀，然后无菌条件下向每孔加入相当于孔体积10%的Alamar Blue染料。</li>
	<li>用Alamar Blue孵育细胞培养物4小时。</li>
	<li>按照先前所述方法，用光转导剂和溶剂（DMSO）处理细胞。通过光纤（青色，470 nm）施加光刺激（1 Hz脉冲光，持续1分钟），以评估Ziapin2内化及光照对hiPSC-CM细胞活力的影响。</li>
	<li>使用酶标仪在激发波长560 nm、发射波长590 nm条件下检测荧光信号。</li>
</ol>
5. 工程化层状心肌组织各向异性的评估
注意：本方案概述了一种利用免疫染色、共聚焦显微镜和细胞核分析来系统评估工程化层状心肌组织各向异性的方法27。
<ol>
	<li>用 PBS 多次洗涤底物，然后在含 0.05% (v/v) Triton X-100 的 4% (v/v) 多聚甲醛 PBS 溶液中固定 10 分钟。</li>
	<li>将样品在含 5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>在室温下用 Hoechst（1:500）孵育样品 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤后，将样品用抗荧光淬灭剂封片于显微镜载玻片上。让载玻片过夜干燥，并在 4 °C 下保存直至成像。</li>
	<li>使用转盘共聚焦显微镜以 20 倍放大倍数对样品进行成像。利用 FiJi 插件 OrientationJ Measure28 确定细胞的取向。</li>
</ol>
6. 光学图谱记录
注意：在接种于明胶模制组织芯片上的 hiPSC-CMs 培养 5 天后进行光学标测。
<ol>
	<li>进行本方案时，确保光学标测装置包含一个改装的双透镜显微镜，配备高速相机和激发光源——200 mW 汞灯。在指定的 Ca2+ 成像相机前放置二向色镜，以确保样品暴露于激发光下，并收集来自样品的发射荧光。&#160;</li>
	<li>将样品与 2 µM X-Rhod 1 在培养基中于 37 °C 孵育 30 分钟。 
	注意：仅在图像采集期间对样品进行光照，以避免染料发生光漂白。</li>
	<li>按照第 3 节所述方法孵育光转导器。</li>
	<li>用新鲜培养基清洗，并将芯片转移至不含酚红的 RPMI 1640 培养基中，该培养基补充有不含胰岛素的 B27 添加剂。</li>
	<li>将组织芯片置于温度可控的培养皿中，在生理温度（37 °C）下开始记录，以每秒 2.5 帧的帧率采集图像。</li>
	<li>进行光学起搏时，使用 LED 光源（465/25 nm）在组织一端施加&#160;光学点刺激，以实现 Ziapin2 刺激。通过位于组织 1 mm 外的时序控制光学纤维，以 0.5 Hz 或 1 Hz 的频率起搏组织。进行电起搏时，使用双极铂电极在矩形组织最远端的中心位置施加点刺激。此位置可确保 Ca2+ 波传播起始于组织宽度的中点，即矩形的短边方向。刺激参数应设置为频率 0.5 Hz、幅度 10 V、脉冲持续时间 100 ms。</li>
	<li>记录完成后，应用大小为 3 × 3 像素的空间滤波器，以提高信噪比。</li>
	<li>针对每次脉冲，在每个像素处确定 Ca2+ 波传导速度，计算其在 x 和 y 方向上的变化速率。为此，测量这两个方向上 Ca2+ 信号强度的空间梯度，并将其与信号传播的时间延迟相关联。通过结合这些方向上的变化速率，量化该波在细胞区域两个维度上的传播速度。</li>
</ol>
7. 数据导出与处理
<ol>
	<li>使用参考软件提取并分析数据。</li>
	<li>应用 3 × 3 像素的空间滤波器以提高信噪比。</li>
	<li>将钙瞬变（Ca2+ transient, CaT）信号提取为特定手动选定的兴趣区域（ROI）的平均值。</li>
	<li>在中央 50 × 50 像素（≈ 25 mm2）的兴趣区域（ROI）内测量 CaT 参数。</li>
	<li>针对每个 CaT，分析其幅度、上升时间（tpeak）、最大衰减速率时间（Max Decay Slope）以及瞬变信号衰减 90% 所需时间（Decay Time90）。</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>使用适当的统计检验（如正态性检验）评估数据分布的正态性，以确定应采用参数检验还是非参数检验方法。</li>
	<li>对于连续性数据或分类数据，分别采用学生t检验或Mann-Whitney U检验来评估两种条件之间的统计学显著性。当比较两组以上时，根据数据的前提假设选择单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis检验，并随后进行适当的事后检验以识别具有显著性差异的组间两两比较结果。</li>
</ol>

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CB、GL 和 FL 是专利号为 EP 3802491（2020年7月2日）的“PHOTOCHROMIC COMPOUNDS&#34;”的发明人。

该方法为推进心脏研究提供了一个可靠的平台，有助于深入理解心肌组织的复杂动态，为长期研究开辟了新的可能性 体外 可能带来新治疗策略的心脏机制研究。为确保该方法的成功，至关重要的是重现一个高度模拟的微生理环境 体内 人类心脏的生理条件。因此，在设计和排列组织时必须仔细考虑，以复制心肌结构的天然各向异性，这对于正常的电传导和收缩功能至关重要。关键因素包括芯片图案的精确激光切割、漂白处理的时间控制以及明胶溶液黏度的调控，这些因素对于制备均匀的组织模具必不可少。此外，使用纤连蛋白和GelTrex（生长因子减少型基底膜基质）对芯片进行准确包被，对于细胞的有效黏附及后续组织形成至关重要。 
此外，必须严格控制光激活剂（即 Ziapin216,18）的孵育时间和浓度，以确保其充分内化。彻底洗去多余的分子对于防止非特异性效应至关重要。建议始终进行细胞活力检测，以评估该分子是否对细胞产生有害影响。如果光激活剂的内化效果不理想，可考虑延长孵育时间或使用...

利用光刺激活细胞和组织正成为生物医学研究中的重要突破，可实现无接触刺激，并具有精确的时间和空间分辨率1,2,3,4,5,6。使细胞对光敏感的领先技术之一是光遗传学，该技术通过基因改造使细胞表达光敏感离子通道或泵7,8。该方法在调控活体组织内细胞方面已展现出显著效果；然而，其依赖病毒介导的基因转移，限制了其在科研和临床应用中的广泛推广。
为了克服这一局限性，有机和无机材料已被用作光敏换能器，以开发非遗传性、基于材料的光介导刺激技术9,10。近年来，有机纳米结构光换能器11,12,13,14,15在触发多种细胞反应方面已展现出显著成效，其应用涵盖神经元、心肌细胞和骨骼肌细胞等。
本文提出使用偶氮苯衍生物Ziapin216,17,18，用于研究工程化层状心肌组织中的Ca2+传播。该分子的两亲性结构可实现对细胞质膜的精确定位，而其偶氮苯核心可在光照下发生异构化，从而引起构象变化16,17,18。在心肌细胞中，这种反式到顺式的异构化会改变质膜厚度，引发一系列效应，产生动作电位，进而触发兴奋-收缩耦联过程19,20,21。
此外，我们描述了一种用于心肌组织各向异性生长的工程化平台的制备过程22，并详细说明了用于光学触发和监测其活性的实验装置，特别关注组织内Ca2+动态的获取23,24。最后，我们将所获得的信号与通过电刺激得到的信号进行比较，后者被视为参考标准。总体而言，本方案强调了新型光响应换能器在推动我们对心肌细胞行为理解方面的作用，尤其是在工程化组织背景下的应用。

<table><tbody><tr><td>alamarBlue 细胞活力检测试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td>细胞活力检测</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含胰岛素）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9056-50G</td><td>用于细胞染色</td></tr><tr><td>BrainVision Analyzer 软件&amp;nbsp;</td><td>Brain Products</td><td>https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/</td><td>数据导出与处理</td></tr><tr><td>BTS</td><td>Sigma</td><td>203895-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>透明抗刮擦且抗紫外线的亚克力板，12&quot; x 12&quot; x 0.01 英寸</td><td>McMaster Carr</td><td>4076N11</td><td>组织芯片制备</td></tr><tr><td>II 型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington</td><td>CLS-2 / LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DNase II</td><td>VWR</td><td>89346-540</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>VWR</td><td>47743-654</td><td>包被</td></tr><tr><td>猪皮来源明胶，凝胶强度 175，A 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-100G</td><td>组织芯片制备</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-无，hESC-合格，低生长因子基底膜基质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>包被</td></tr><tr><td>HBSS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>H1399</td><td>用于细胞染色</td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72564</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液（PFA）</td><td>VWR</td><td>100503-917</td><td>用于细胞染色</td></tr><tr><td>PBS，无菌，500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>组织芯片制备</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870127</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>光学图谱分析</td></tr><tr><td>Versene 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>螯合剂</td></tr><tr><td>VWR 通用实验室标签胶带</td><td>VWR</td><td>89098-058</td><td>组织芯片制备</td></tr><tr><td>X-Rhod-1 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X14210</td><td>光学图谱分析</td></tr></tbody></table>

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（ca2+）传导的心脏微生理系统

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

体外心脏微生理模型在科学研究、药物开发和医学应用中具有高度可靠性。尽管科学界已广泛接受这些系统，但由于缺乏非侵入性刺激技术，其长期稳定性仍受到限制。光换能器提供了一种高效的刺激方法，具有无线操作、高时间与空间分辨率的优势，同时可最大限度地减少刺激过程中的侵入性。在本研究中，我们介绍了一种完全基于光学的方法，用于刺激并检测体外心脏微生理模型的活动。具体而言，我们通过在三维生物反应器悬浮培养中生成的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）构建了具有层状各向异性的工程化组织。我们采用一种名为Ziapin2的两亲性偶氮苯衍生物作为光换能器进行刺激，并使用一种Ca2+荧光染料（X-Rhod 1）来监测系统的响应。结果表明，Ziapin2能够在不损害组织完整性、细胞活力或功能行为的前提下，实现对系统中Ca2+响应的光调控。此外，我们还证明了这种基于光的刺激方法在分辨率方面可与当前金标准——电刺激相媲美。总体而言，该实验方案为Ziapin2及材料介导的光刺激技术在心脏研究中的应用开辟了广阔的前景。

开发并实施了一种多步骤流程，用于利用激光图案化、明胶 molding 和细胞接种技术相结合的方法来构建工程化层状心肌组织。该技术最初由 McCain 等人22 和 Lee 等人24 建立，本研究在其方案基础上进行了重新实现，以构建工程化层状微组织。该流程结合了基于激光的精确图案化以提供结构引导，采用明胶作为支架材料，并通过可控的细胞接种来创建仿生的组织环境。（图 1）。
纸基底的制备包括将两层实验室标签胶带（一层白色，一层蓝色）粘附到1 mm厚的丙烯酸基底上，为后续步骤提供坚固的基础，并在制造过程中实现精确的可视化和操作（图1A）。采用激光图案化技术在基底上实现所需的芯片几何结构，优化的参数确保了精确的烧蚀效果，同时不损伤丙烯酸基底（图1B）。选择性去除胶带层暴露基底的特定区域，以便进行后续处理。将由猪皮来源明...

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

体外心脏微生理模型在科学研究、药物开发和医学应用中具有高度可靠性。尽管此类模型已被广泛……

该研究旨在通过整合基于材料的光刺激方法，推动体外心脏微生理模型的发展。研究重点在于克服现有模型在寿命和刺激侵入性方面的局限性，为研究心脏生理学、改进药物筛选流程以及促进疾病建模应用提供可靠的工具。近年来，生物刺激技术的进步为实现精确的非侵入性细胞调控提供了有力支持。光遗传学通过基因改造来调控细胞活性，而新兴的基于材料的光换能器则提供了非基因手段的替代方案。该技术在研究和调控神经元、心肌细胞以及骨骼肌细胞等多种应用中实现了重大突破。目前的实验挑战包括实现对深层组织的稳定光照递送、优化光换能器的生物相容性和稳定性，以及提高基于光刺激技术的精确性。此外，在维持细胞存活率和功能的同时，将这些方法整合到复杂的生物系统中，仍然是一个关键难题。本实验方案解决了心脏微生理模型中对非侵入性精确刺激技术的研究空白。通过使用基于材料的光转导器（如 Ziapin2），该方法克服了传统电刺激和光遗传学技术的局限性，能够在保持组织活力和功能的同时，实现更优的时间和空间控制。我的研究发现将通过引入一种非侵入性的、基于材料的光刺激技术，推动相关领域的研究进展，该技术能够更精确地控制心肌组织中的细胞活动。这种方法无需进行基因改造，为心脏功能建模、疾病机制研究以及更有效的治疗策略开发提供了一种通用工具。首先，将两层实验室胶带（一层白色，一层蓝色）粘附到一块厚度为1毫米的透明、耐刮擦且抗紫外线的丙烯酸板上。根据设计意图，用激光切割机在胶带上切割出芯片图案，然后使用二氧化碳激光雕刻机将亚克力板切割成圆形。用镊子移除最内侧线条内的两层胶带。将芯片浸泡在纯漂白剂中30分钟至1小时，以去除切割产生的粗线和黑斑，留下清晰的线条，并将芯片置于烧杯中用流动的去离子水冲洗过夜或至少3小时。将带有线性沟槽结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章芯片在洁净的70%乙醇中超声处理30分钟。将芯片和印章转移至通风橱内的洁净区域，在气流下干燥约一至两小时。接着，将新配制的明胶超声处理15分钟，然后放回65°C水浴中，待用。将微生物转谷氨酰胺酶（MTG）管放入干燥器中，管盖稍拧松，缓慢开启真空以去除气泡。脱气完成后，将MTG管放回37°C水浴中。然后用洁净的Parafilm覆盖网格板，并将芯片放置在网格上。将PDMS印章放置在附近以备使用。取五毫升MTG加入五毫升明胶溶液中，用移液器小心混合，避免产生气泡。随后，迅速将约0.5毫升的明胶混合物分装到每块芯片上，确保混合物覆盖整个芯片区域。将带有线条图案的PDMS印章置于上方，并施加200克重物，以确保明胶沿组织的长轴方向形成图案。所有芯片成型后，用玻璃罐覆盖，避免环境干扰，并使其交联过夜。将芯片与PDMS印章的夹心结构转移至盛有PBS的新P150培养皿中，水合明胶30分钟至1小时，以促进PDMS印章与芯片的分离。去除芯片周围多余的未凝固明胶后，将洁净的芯片转移至盛有 PBS 的新 P150 培养皿中。将 PDMS 印模保存在 70% 乙醇中。为对芯片进行灭菌，需在生物安全柜中将其浸入乙醇中 10 分钟。将芯片转移至 PBS 中，浸泡 10 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。对于包被溶液，将 20 微克/毫升的纤连蛋白与 Geltrex 按 1:100 的比例在无补充物的培养基中混合。将该溶液加入芯片中，在 37°C 和 5% CO₂ 的培养箱中孵育 2 小时进行包被。将人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞在含有10 µM Y-27632的RPMI培养基中解冻并接种。24小时后，更换为不含Y-27632的RPMI培养基。细胞接种三天后，使用镊子小心地从芯片上移除白色胶带。准备光学图谱装置，该装置由改装的双透镜显微镜组成，配备高速相机和200毫瓦汞灯作为激发光源。在指定的钙成像相机前放置二向色镜。进行光刺激起搏时，使用LED光源在组织一端进行光学点刺激，以激活光换能器Ziapin2。通过一根距离组织一毫米的、时间可控的光纤，以0.5或1赫兹的频率刺激组织。将样品在含有2微摩尔X-Rhod-1的培养基中于37摄氏度孵育30分钟。用新鲜培养基洗涤芯片后，将其转移至不含酚红的RPMI 1640培养基中，该培养基添加了不含胰岛素的B-27和HEPES。将组织芯片置于设定为生理温度的温控培养皿中，并以每秒2.5帧的帧率开始记录。在0.5赫兹或1赫兹的光刺激下，钙波传播成功实现可视化，具有清晰的空间和时间分辨率，传导速度计算约为4.5厘米每秒，与生理数值一致。钙瞬变参数包括幅度、上升时间、最大衰减速率、斜率和衰减时间，在光刺激与电刺激之间定量相似，证实了功能反应的可比性。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种通过非遗传光刺激研究 Ca2+ 传播的心脏微生理系统

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。...

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健康与缺血状态下双向电学与光电接口 离体 大鼠心脏

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