一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca²⁺）传导的心脏微生理系统

该研究旨在通过整合基于材料的光刺激方法，推动体外心脏微生理模型的发展。研究重点在于克服现有模型在寿命和刺激侵入性方面的局限性，为研究心脏生理学、改进药物筛选流程以及促进疾病建模应用提供可靠的工具。近年来，生物刺激技术的进步为实现精确的非侵入性细胞调控提供了有力支持。

光遗传学通过基因改造来调控细胞活性，而新兴的基于材料的光换能器则提供了非基因手段的替代方案。该技术在研究和调控神经元、心肌细胞以及骨骼肌细胞等多种应用中实现了重大突破。目前的实验挑战包括实现对深层组织的稳定光照递送、优化光换能器的生物相容性和稳定性，以及提高基于光刺激技术的精确性。

此外，在维持细胞存活率和功能的同时，将这些方法整合到复杂的生物系统中，仍然是一个关键难题。本实验方案解决了心脏微生理模型中对非侵入性精确刺激技术的研究空白。通过使用基于材料的光转导器（如 Ziapin2），该方法克服了传统电刺激和光遗传学技术的局限性，能够在保持组织活力和功能的同时，实现更优的时间和空间控制。

我的研究发现将通过引入一种非侵入性的、基于材料的光刺激技术，推动相关领域的研究进展，该技术能够更精确地控制心肌组织中的细胞活动。这种方法无需进行基因改造，为心脏功能建模、疾病机制研究以及更有效的治疗策略开发提供了一种通用工具。首先，将两层实验室胶带（一层白色，一层蓝色）粘附到一块厚度为1毫米的透明、耐刮擦且抗紫外线的丙烯酸板上。

根据设计意图，用激光切割机在胶带上切割出芯片图案，然后使用二氧化碳激光雕刻机将亚克力板切割成圆形。用镊子移除最内侧线条内的两层胶带。将芯片浸泡在纯漂白剂中30分钟至1小时，以去除切割产生的粗线和黑斑，留下清晰的线条，并将芯片置于烧杯中用流动的去离子水冲洗过夜或至少3小时。

将带有线性沟槽结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章芯片在洁净的70%乙醇中超声处理30分钟。将芯片和印章转移至通风橱内的洁净区域，在气流下干燥约一至两小时。接着，将新配制的明胶超声处理15分钟，然后放回65°C水浴中，待用。

将微生物转谷氨酰胺酶（MTG）管放入干燥器中，管盖稍拧松，缓慢开启真空以去除气泡。脱气完成后，将MTG管放回37°C水浴中。然后用洁净的Parafilm覆盖网格板，并将芯片放置在网格上。

将PDMS印章放置在附近以备使用。取五毫升MTG加入五毫升明胶溶液中，用移液器小心混合，避免产生气泡。随后，迅速将约0.5毫升的明胶混合物分装到每块芯片上，确保混合物覆盖整个芯片区域。

将带有线条图案的PDMS印章置于上方，并施加200克重物，以确保明胶沿组织的长轴方向形成图案。所有芯片成型后，用玻璃罐覆盖，避免环境干扰，并使其交联过夜。将芯片与PDMS印章的夹心结构转移至盛有PBS的新P150培养皿中，水合明胶30分钟至1小时，以促进PDMS印章与芯片的分离。

去除芯片周围多余的未凝固明胶后，将洁净的芯片转移至盛有 PBS 的新 P150 培养皿中。将 PDMS 印模保存在 70% 乙醇中。为对芯片进行灭菌，需在生物安全柜中将其浸入乙醇中 10 分钟。

将芯片转移至 PBS 中，浸泡 10 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。对于包被溶液，将 20 微克/毫升的纤连蛋白与 Geltrex 按 1:100 的比例在无补充物的培养基中混合。将该溶液加入芯片中，在 37°C 和 5% CO₂ 的培养箱中孵育 2 小时进行包被。

将人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞在含有10 µM Y-27632的RPMI培养基中解冻并接种。24小时后，更换为不含Y-27632的RPMI培养基。细胞接种三天后，使用镊子小心地从芯片上移除白色胶带。

准备光学图谱装置，该装置由改装的双透镜显微镜组成，配备高速相机和200毫瓦汞灯作为激发光源。在指定的钙成像相机前放置二向色镜。进行光刺激起搏时，使用LED光源在组织一端进行光学点刺激，以激活光换能器Ziapin2。

通过一根距离组织一毫米的、时间可控的光纤，以0.5或1赫兹的频率刺激组织。将样品在含有2微摩尔X-Rhod-1的培养基中于37摄氏度孵育30分钟。用新鲜培养基洗涤芯片后，将其转移至不含酚红的RPMI 1640培养基中，该培养基添加了不含胰岛素的B-27和HEPES。

将组织芯片置于设定为生理温度的温控培养皿中，并以每秒2.5帧的帧率开始记录。在0.5赫兹或1赫兹的光刺激下，钙波传播成功实现可视化，具有清晰的空间和时间分辨率，传导速度计算约为4.5厘米每秒，与生理数值一致。钙瞬变参数包括幅度、上升时间、最大衰减速率、斜率和衰减时间，在光刺激与电刺激之间定量相似，证实了功能反应的可比性。