Name: 经结膜入路注射大鼠视神经 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: 了解经结膜入路注射大鼠视神经的微创技术，用于神经纤维瘤病1型治疗研究。该方法通过钝性分离暴露视神经，直接注射腺相关病毒EGFP或染料，实现可视化精准递送，减少手术创伤并提高基因治疗效率。

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作者感谢Gilbert Family Foundation对本项目的资助。

所有动物实验程序均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会办公室批准。本研究由吉尔伯特家族基金会资助（资助编号 913012）。实验使用了4至12周龄、体重100至400 g的雄性和雌性斯普拉格-道利大鼠。所用试剂和设备的详细信息见《材料表》。
1. 麻醉
<ol>
	<li>使用异氟烷气体吸入法对大鼠进行麻醉。将动物放入诱导室，将蒸发器调节至4%–5%以诱导麻醉，2%–3%用于维持麻醉。 
	注意：若需同时使用局部麻醉剂，请遵循机构相关指南。</li>
	<li>在继续操作前，通过评估足底回缩反射是否消失来确认麻醉深度。</li>
	<li>将人工泪液凝胶涂抹于眼表。</li>
</ol>
2. 定位
<ol>
	<li>诱导麻醉后，将动物置于加热垫上，保持侧卧位。使用鼻罩维持麻醉状态。</li>
	<li>将眼眶置于手术显微镜下进行定位。</li>
</ol>
3. 手术暴露
<ol>
	<li>用有齿镊在颞下象限夹住结膜（图1）。</li>
	<li>使用Westcott剪刀做放射状结膜切口，然后在鼻下象限切开滕囊筋膜（图1）。采用钝性分离法去除覆盖的眶内组织。</li>
</ol>
4. 视神经的分离
<ol>
	<li>使用有齿镊将眼球向鼻侧旋转，并让助手将脊髓钩插入颞下象限以分离视神经（图1）。注意避免损伤眶下静脉和眼外肌。</li>
	<li>用棉签或镊子进行钝性分离，去除覆盖的眶内组织和滕氏筋膜&#160;，以暴露视神经及其鞘膜。</li>
</ol>
5. 注射
<ol>
	<li>使用连接至10 µL或1 mL注射器的33 G针头刺入视神经鞘（图1）。</li>
	<li>在直视下将不同浓度的腺相关病毒-eGFP或印度墨水染料注射至视神经内，以确保物质直接注入神经组织。</li>
	<li>为评估AAV-eGFP，注射含有AAV病毒颗粒的10 µL悬液（2 × 1013 载体基因组（vg）/mL，总剂量为2 × 1011 vg）。 
	注意：研究人员可根据实验需求注射其他染料或染色剂。</li>
</ol>
6. 术后步骤
<ol>
	<li>将结膜复位于角巩膜缘处，以覆盖切口部位，并在结膜上涂抹抗生素软膏（图1）。</li>
	<li>让动物从麻醉中恢复，并监测其是否有任何感染迹象。</li>
</ol>
7. 染色
<ol>
	<li>注射后第7天处死动物 通过 CO2 窒息后颈椎脱位11 遵循伦理准则。解剖视神经。</li>
	<li>将视神经固定于4%多聚甲醛中，并用浓度递增的蔗糖溶液冲洗。将冷冻模具包埋于OCT包埋剂与20%蔗糖按2:1配制的溶液中。在液氮中快速冷冻样本，于-80 °C保存，并切片至7 μm厚度。</li>
	<li>在室温下，用免疫细胞化学（IHC）缓冲液和3%牛血清白蛋白封闭视神经冰冻切片30分钟。将切片与用IHC缓冲液稀释的大鼠抗GFP一抗在室温下孵育2小时。</li>
	<li>室温下，将切片在IHC缓冲液中与山羊抗大鼠二抗孵育1小时。在二抗孵育期间，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对切片进行染色，以显示细胞核。用PBS充分漂洗切片后，使用封片剂封片。</li>
</ol>
8. 成像
<ol>
	<li>使用直立式共聚焦显微镜系统对标记的切片进行成像。</li>
	<li>具体而言，使用405 nm紫激光观察DAPI标记，使用488 nm青蓝激光观察GFP。 
	注意：不同共聚焦显微镜系统的用户应针对各激光参数（如激光功率、强度/增益、背景/噪声滤波）进行优化。使用20倍物镜采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>Korn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+neuroprotective+effects+of+methylprednisolone+and+surgical+decompression+in+a+rodent+model+of+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy.</a> Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).</li>
<li>Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+attenuation+of+GABA+sensitivity+in+the+maturing+myelin-deficient+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve.</a> Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C6+cell+injection+into+the+optic+nerve+of+long-evans+rats%3A+A+short-term+model+of+optic+pathway+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas.</a> Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).</li>
<li>Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+optic+nerve+head+biomechanics+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma.</a> J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).</li>
<li>Ellouze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+allotopic+expression+of+the+human+mitochondrial+ND4+prevents+blindness+in+a+rat+model+of+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction.</a> Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).</li>
<li>Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-preconditioned+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+rescue+optic+nerve+axons+via+differential+roles+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+an+optic+nerve+compression+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model.</a> Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally-invasive+Technique+for+Injection+into+Rat+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve.</a> J Vis Exp. (99), e52249(2015).</li>
<li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+mulitple+injections+into+the+mamallian+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve.</a> Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).</li>
<li>Yan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+optic+nerve+transection+in+rats%3A+A+model+established+with+a+new+operative+approach+to+assess+secondary+degeneration+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (128), e56272(2017).</li>
<li>Han, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+progenitor+cell+grafts+in+immunocompromised+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats.</a> Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).</li>
<li>Tang, Y., Gutmann, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+Type+1-associated+optic+pathway+gliomas%3A+Current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Manag+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects.</a> Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).</li>
<li>Pan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+biomimetic+polydopamine+nanocomposite+scaffold+promotes+optic+nerve+regeneration+through+modulating+inhibitory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).</li>
<li>Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-protection+and+neuro-regeneration+of+the+optic+nerve%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions.</a> Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+within+artificial+Schwann+cell+graft+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat.</a> Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).</li>
</ol>

无相关披露。

本文介绍了一种无需皮肤切口即可获取大鼠视神经以进行实验研究的新方法。由于无需切开皮肤且操作步骤较其他技术更少，该方法具有操作高效以及降低感染和出血风险的潜在优势8,9。该技术还采用了一种新颖的方法，即使用大鼠脊髓钩分离视神经，以避免对神经及周围组织造成损伤。
该技术的关键步骤包括：制作足够大的角膜缘切口以进入结膜下间隙，使用脊髓钩分离视神经，以及使用细针穿刺视神经鞘并将物质注入视神经。操作时需注意旋转脊髓钩以充分分离神经。当视神经未能清晰暴露时，可能需要多次插入钩子以确保神经被成功分离，此时可使用棉签轻轻去除神经鞘周围的结缔组织，以改善视野。在体型较大、眶内脂肪较多的动物中，该技术的暴露难度可能更高。在这些情况下，由助手协助牵拉周围组织以获得充分暴露会有所帮助。注射过程中必须直接观察视神经，确保针头垂直穿过神经鞘，这有助于提高注射的成功率。
该技术基于 Raykova 等人以及 Hallas 和 Wells 之前的研究所建立8,9。Raykova 等人描述了通过上方入路接触大鼠视神经的方法，即在眶缘上方做皮肤切口并横断上眶肌8。尽管该方法可暴露视神经，但需横断一条眼外肌，出血风险较高，且需缝合皮肤切口。类似地，Hallas 和 Wells 描述了一种通过侧方入路进入大鼠眼眶以到达视神经的方法9。他们采用侧方皮肤切口，随后做结膜侧方切口，并使用牵拉缝线旋转眼球以暴露视神经9。与上方入路相似，该技术涉及皮肤切口，因而需要伤口闭合，且存在较高的感染和出血风险8,9。本文所介绍的经结膜技术避免了皮肤和肌肉切口的需要，从而降低了出血和感染的风险，并因无需缝合皮肤切口而提高了操作效率。该手术造成动物痛苦极小，耐受性良好，且无需长期使用镇痛或抗炎药物。经结膜技术与先前发表的技术在表1中进行了比较和对照。
本研究中所介绍技术的局限性包括：使用脊髓钩分离视神经存在一定的学习曲线，但一旦掌握，该技术可实现高效且无创的神经分离。操作显微镜的使用经验对于该技术至关重要。尽管存在学习曲线，但由于步骤较少且无需缝合伤口，相较于其他已发表的方法，该技术更易于掌握8,9。必须仔细进行钝性解剖以暴露视神经及其鞘膜，因为邻近血管和肌肉组织可能发生出血。在体型较大的大鼠中，由于眼眶内脂肪/组织增多，暴露较大范围的视神经可能更为困难，但通过细致操作，通常可通过钝性解剖去除这些组织，从而改善神经的可视化效果。未来的研究可进一步探讨该技术在其他模型系统（如小鼠）中的应用，并可直接比较其在视神经暴露方面的手术效率与其他技术的差异。
该技术可供其他需要对大鼠视神经进行实验研究的科研团队使用。本研究所展示的实验是更大规模项目的一部分，旨在开发在1型神经纤维瘤病（NF1）大鼠模型中向视神经递送CRISPR基因校正的方法。该项目的最终目标是寻找能够直接向NF1患者视神经递送基因治疗的途径，以预防威胁视力的视神经胶质瘤的发生12。在本研究中，向视神经注射了印度墨水染料或AAV-eGFP载体，以确认物质可被成功递送至视神经，并证明该载体能够穿透视神经组织。
该技术可被其他研究者更广泛地应用，因为可能需要进入视神经或注射新型治疗药物，以治疗多种威胁视力的疾病，包括视神经肿瘤、Leber遗传性视神经病变等退行性疾病、外伤性视神经病变、青光眼以及视神经炎等自身免疫性疾病13,14。例如，Singh 等人描述了将 C6 胶质瘤细胞注射到大鼠视神经中，通过皮肤切口进入神经，建立神经纤维瘤病1型的模型3；Kwon 等人采用侧方皮肤入路进入视神经，用于研究视神经受压及干细胞介导的再生6；Negishi 等人则进入大鼠视神经以植入施万细胞移植物，作为视神经再生的模型15。本文所介绍的技术可为上述这类需要进入大鼠视神经以回答多种实验问题的研究，提供一种更高效且更安全的方法。
总之，本研究证明了采用小规格针头方法进入视神经的有效性，并能够在无需皮肤切口的情况下穿透神经鞘膜。代表性图像显示，腺病毒载体成功穿透了视神经。该技术可应用于再生医学、肿瘤学以及遗传性视网膜疾病中的多种视神经相关实验。

大鼠是研究视神经疾病（包括青光眼、外伤性视神经病变、遗传性视神经病变、脱髓鞘疾病以及视神经肿瘤）的重要实验模型,2,3,4,5,6,7。然而，由于眼眶体积较小且存在丰富的血管性眶内组织，对视神经进行实验性注射和操作往往较为困难。
先前描述的两种用于实验操作大鼠视神经的技术，分别采用眶上入路或侧方经皮入路进入眼眶8,9Raykova 等人描述了通过上眼眶皮肤切口将染色微珠注入视神经的方法8尽管他们的技术是有效的，但它需要&#160;止血以及暴露时对牵引缝线的需求，而采用此入路时这些操作可能更具挑战性8另一组研究人员同样描述了一种通过外侧皮肤切口进入眼眶的方法。他们成功地通过该方法对视神经进行了注射，但需要进行止血和伤口缝合。9尽管这些技术是用于实验研究视神经的有效方法，但二者均需进行皮肤切口，需要止血，并进行伤口缝合。这些步骤存在感染风险，且由于需要缝合伤口，可能延长麻醉时间。8,9,10.
鉴于先前所述技术的局限性，本研究旨在描述一种更高效且创伤更小的视神经暴露方法，以用于实验研究。该方法采用脊髓钩来分离视神经，类似于临床上使用肌钩分离眼外肌及附属眼组织的手术技术。此技术可适用于需要暴露大鼠视神经的多种研究场景，包括药物递送和基因治疗等。
本文描述了一种利用脊髓钩经结膜途径进入大鼠眼眶和视神经以进行实验研究的新方法。

<table><tbody><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542</td><td>1:10,000 稀释，用于冰冻切片染色</td></tr><tr><td>AAV 病毒颗粒</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td>用于视神经注射的载体</td></tr><tr><td>Aqua-Mount 封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td>用于冰冻切片染色后的封片</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Research Products International Corp</td><td>9048-46-8</td><td>用于冰冻切片染色过程</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>1:1,000 稀释，用于冰冻切片染色</td></tr><tr><td>异氟烷气体</td><td>Primal Healthcare</td><td>66794-017-10</td><td>用于麻醉的气体</td></tr><tr><td>Leica TCS SPE 直立共聚焦显微镜系统&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>用于注射</td></tr><tr><td>Microm HM505E 冰冻切片机&amp;nbsp;</td><td>Microm</td><td>M-HM360 fom Marshall Scientific</td><td>用于组织切片</td></tr><tr><td>大鼠抗GFP抗体&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>338002</td><td>1:500 稀释，用于冰冻切片染色</td></tr><tr><td>脊髓钩</td><td>F.S.T</td><td>10162-12</td><td>用于分离视神经的钩状工具</td></tr><tr><td>十微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>CAL 803901</td><td>用于注射</td></tr><tr><td>33 号针头</td><td>JBP</td><td>JBP3308B</td><td>用于注射</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 包埋剂&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td>用于冰冻模具处理</td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E1809</td><td>用于夹持结膜</td></tr><tr><td>Westcott 弯曲肌腱剪</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E3323-R</td><td>用于制作结膜切口</td></tr></tbody></table>

经结膜途径向大鼠视神经注射

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

大鼠是研究视神经疾病的重要模型，包括遗传性、创伤性、肿瘤性及自身免疫性等疾病。由于眼眶较小且周围眶内组织血管丰富，对大鼠视神经进行实验操作和注射具有较大挑战性。以往的技术通常采用皮肤切口，这种方法感染风险较高，且需要缝合伤口。本研究旨在描述一种独特、创伤更小且可能更高效的进入大鼠视神经的方法。该方法采用结膜下切口，并结合大鼠脊髓钩来分离视神经，以进行实验性注射。在这些实验中，将腺病毒载体注射入视神经，旨在为未来实现直接基因治疗递送提供技术基础。该技术也可供其他需要进入大鼠视神经开展实验研究的研究人员使用，包括药物递送和视神经损伤研究。

使用该技术对大鼠视神经注射的代表性实验结果如图2所示。在本示例中，采用上述经结膜技术，通过连接10 µL注射器的33 G针头将腺相关病毒-eGFP（AAV-eGFP）注射至大鼠视神经。这些结果来自一项实验，该实验利用此技术研究视神经注射，旨在最终通过AAV在神经纤维瘤病1型（NF1）大鼠模型中向视神经递送CRISPR校正。为优化注射技术，实验中联合使用了染料与AAV载体。动物在视神经注射后7天被处死。随后解剖视神经，并用抗GFP抗体标记，以便通过共聚焦显微镜成像，确认物质已成功穿透视神经鞘并进入视神经组织。抗体染色证实了物质成功导入视神经，在共聚焦显微镜下呈现绿色荧光，如图2A所示。在部分病例中，若物质未能完全穿透视神经鞘，或沿针道发生外流，则染色信号出现在视神经鞘边缘而非神经实质内，如图2C所示。
<img alt="临床环境下使用医疗器械逐步取出耳垢的过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：手术步骤顺序图。（A）用有齿镊夹住结膜，并使用Westcott剪刀行角膜缘环形切开。（B）打开Tenon筋膜并钝性分离后，在Westcott剪刀辅助下暴露眶部。（C）插入脊髓钩并用于分离视神经。（D）钝性分离覆盖的眶内组织后，使用脊髓钩暴露视神经。（E）使用33 G针头穿刺视神经鞘，向视神经内注射腺病毒或染料。（F）将眼球复位于眶内，并将结膜重新覆盖于环形切口处。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="视神经中AAV-eGFP表达的荧光显微镜图像；标注视交叉，DAPI染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2: 成功注射 AAV-eGFP（绿色）后 7 天大鼠视神经的代表性荧光共聚焦全景图像，显示在视交叉附近的神经元被载体转导. (A视神经核以 DAPI 标记（蓝色）。箭头所示 ONH 表示视神经头或神经的眶端，而视交叉端标记为“chiasm”。B) 大鼠视神经从眼眶至视交叉段包埋于冷冻切片冰块中的照片。在眼眶后方立即注入墨汁（注射部位以黑色箭头标示），以确定视神经的方向。C) 注射AAV-eGFP（绿色）7天后的大鼠视神经全景荧光图像，显示注射未成功，大部分病毒载体可能已从神经束中溢出，转导了视神经鞘。视神经细胞核用DAPI标记（蓝色）。ONH表示位于神经视网膜后方的视神经乳头，白色箭头指示注射部位。Chiasm及白色箭头指向视交叉方向。比例尺 = 400 μm 在 (A）和 200 μm 在 (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>变量</td>
			<td colspan="3">手术入路</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>经结膜</td>
			<td>上方</td>
			<td>外侧</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮肤切口</td>
			<td>无</td>
			<td>有</td>
			<td>有</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>结膜切口</td>
			<td>有</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显微镜</td>
			<td>使用</td>
			<td>使用</td>
			<td>使用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上眶部肌肉离断</td>
			<td>无</td>
			<td>有</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牵引缝线</td>
			<td>无</td>
			<td>有</td>
			<td>有</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脊髓钩</td>
			<td>使用</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮肤缝合</td>
			<td>无</td>
			<td>有</td>
			<td>有</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究与既往发表的大鼠视神经分离技术的比较。 通过结膜下、上方及外侧入路，对是否需要皮肤切口、结膜切口、手术显微镜、上眶肌离断、牵拉缝线、脊髓钩以及皮肤缝合等变量进行比较。

本方案描述了一种采用经结膜入路注射大鼠视神经的独特技术。

大鼠是研究视神经疾病的重要模型，包括遗传性、创伤性、肿瘤性及自身免疫性等疾病。

本研究旨在为神经纤维瘤病1型患者开发更有效的视神经治疗递送方法。我们的方案重点探索用于实验研究的大鼠视神经更佳的入路技术。该方案具有微创优势，无需进行皮肤切口。[演示者] 首先，使用有齿镊在下颞象限夹住结膜。用Westcott剪刀做放射状结膜切口，然后在下鼻象限切开腱膜筋膜。采用钝性分离去除覆盖的眶内组织。用有齿镊将眼球向鼻侧旋转。助手将脊髓钩插入下颞象限以分离视神经。使用镊子或棉签进行钝性分离，去除残留的眶内组织和腱膜筋膜，暴露视神经及其鞘膜。使用连接10微升或1毫升注射器的33号针头刺入视神经鞘。在直视下将不同浓度的腺相关病毒EGFP或印度墨水染料注入视神经，确保物质直接注入神经内。将结膜复位至角膜缘，覆盖切口部位。该图展示了采用经结膜注射技术将腺相关病毒EGFP成功与不成功递送至大鼠视神经的结果。成功的视神经注射在神经组织内产生广泛的绿色荧光信号，表明腺相关病毒EGFP载体有效穿透。不成功的注射仅在视神经外缘显示绿色信号，提示物质发生泄漏而未进入神经组织。

transconjunctival-approach-for-injection-into-the-rat-optic-nerve

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

经结膜入路注射大鼠视神经

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一种通过高渗盐水注射诱导大鼠青光眼的技术

直接注射至大鼠视神经在再生研究中具有重要价值。我们展示了一种微创技术，可实现对大鼠视神经的直接注射，且无需打开颅骨。采用该方法可最大限度减少手术并发症，并加快术后恢复。...

微创大鼠视神经注射技术

以下报告介绍了如何使用适当的染料、接触镜片和激光参数来复制非动脉炎性前部缺血性视神经病变（rNAION）的啮齿类动物模型。同时，我们还揭示了评估rNAION病灶的适当步骤 体内.

非动脉炎性前部缺血性视神经病变的啮齿类动物模型（rNAION）

视网膜下注射是将大分子治疗剂（如蛋白质和病毒载体）递送至光感受器和视网膜色素上皮层的最常用技术。本文介绍了一种在小鼠中可有效靶向视网膜下腔、造成最小附带损伤且恢复时间较快的替代方法。...

一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

本方案旨在演示一种可在新生大鼠和小鼠整个新生儿期使用的可重复静脉给药途径。该操作对于希望主要通过静脉给药方式模拟新生儿护理单元中药物给药情况的临床前啮齿类动物研究具有重要意义。...

一种新生啮齿类动物眶后静脉注射模型

本方案描述了一种通过中央角膜切口和长隧道进入前房的大鼠前房注射技术。该注射方法可最大限度地降低意外组织损伤的风险，从而提高操作的精确性和可重复性。...

大鼠眼内注射技术：低不良反应风险

本文介绍了利用术中可视化技术来控制注射部位和视网膜脱离范围的大鼠视网膜下注射方法。...

大鼠视网膜下注射与视网膜脱离的术中可视化

本研究介绍了一种将治疗剂递送至成年大鼠视网膜和视神经的方法。此外，还提出了一种独特的组织获取方法，可自上而下整体切取成年大鼠的视神经和视网膜。...

成人鼠眼部药物递送与先进组织获取

了解经结膜入路注射大鼠视神经的微创技术，用于神经纤维瘤病1型治疗研究。该方法通过钝性分离暴露视神经，直接注射腺相关病毒EGFP或染料，实现可视化精准递送，减少手术创伤并提高基因治疗效率。

经结膜途径向大鼠视神经注射

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