Name: 体内 影像学揭示了关节内白细胞的迁移行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习利用体内成像技术在小鼠II型胶原诱导性关节炎模型中观察白细胞迁移行为。该方法可实时追踪免疫细胞在发炎关节中的动态，为炎症研究和治疗策略开发提供重要依据。

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Y.M. 的研究工作由日本促进科学振兴会（JSPS）科研资助项目 [资助编号 JP22K08531、JP25K02574]、日本医疗研究开发机构（AMED）[资助编号 25bm1423033]、持田纪念医药研究基金会、JCR 前沿研究促进资助项目以及三菱基金会资助。

所有动物实验均经圣玛丽安娜医科大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：TG240926-2 和 TG250801-2），并依照机构及国家相关指南进行。
1. 关节炎小鼠模型的制备
注意：关节炎的动物模型为理解该疾病的发病机制以及开发新疗法提供了有价值的工具14。尽管多种小鼠关节炎模型各有其独特的优势与局限性，但II型胶原诱导性关节炎（CIA）模型已被广泛应用于类风湿关节炎（RA）发病机制的研究中14。在本节中，我们描述了CIA关节炎模型的实验方案（所需试剂与仪器见图1）。
<ol>
	<li>将牛II型胶原蛋白用0.05 M乙酸稀释至终浓度为4 mg/mL，于4 °C下振荡过夜以制备稀释液。</li>
	<li>为制备乳剂，将胶原蛋白稀释液（4 mg/mL溶于0.05 M乙酸）与完全弗氏佐剂（CFA）按1:1比例加入玻璃注射器中混合，所得乳剂中胶原蛋白终浓度为2 mg/mL。手动剧烈混合约20分钟。此过程会产生热量，因此需将装有乳剂的玻璃注射器置于冰上冷却。制备过程中可用烧杯检查乳剂的稠度。 
	注意：剩余的胶原蛋白稀释液应储存于-80 °C，可用于第二次免疫。</li>
	<li>将乳剂转移至配备26 x 1/2 G针头的1 mL玻璃注射器中，并在免疫前保持置于冰上。</li>
	<li>通过腹腔注射给予8周龄DBA1/J小鼠（雄性或雌性）美托咪啶（0.3 mg/kg）、咪达唑仑（4 mg/kg）和维托啡（5 mg/kg）进行麻醉。 
	注意：转基因小鼠通常具有C57BL6背景。在C57BL6小鼠中诱导胶原诱导性关节炎（CIA）通常使用鸡源胶原蛋白；然而，C57BL6小鼠中CIA的发生率和严重程度低于DBA/1J小鼠。若使用C57BL6背景的转基因小鼠，建议先进行预实验以评估CIA的发生率和严重程度。</li>
	<li>使用电动剪毛器剃除尾部周围毛发，以备免疫接种。</li>
	<li>沿尾背部皮下区域（靠近尾根部）缓慢注射100 µL乳剂（含200 µg胶原蛋白）（图2）。</li>
	<li>于第21天重复步骤1.2至1.6进行第二次免疫（图2）。</li>
</ol>
2. 关节炎临床评分的评估与足爪厚度的测量
注意：关节炎的临床评分和足垫厚度测量对于评估疾病活动性至关重要。通常在首次免疫后每1-3天进行一次关节炎临床评分和足垫厚度测量。
<ol>
	<li>关节炎临床评分：记录每只小鼠四只足的评分总和。采用以下评分标准： 
	0 = 正常 
	1 = 一个脚趾出现红斑和肿胀 
	2 = 两个脚趾出现红斑和肿胀，或踝关节出现红斑和肿胀 
	3 = 超过三个脚趾出现红斑和肿胀，或两个脚趾及踝关节出现肿胀 
	4 = 踝关节、足部和脚趾出现红斑及严重肿胀，并伴有畸形。 
	注：肿胀的踝关节定义为足部厚度大于 4 mm。</li>
	<li>足部厚度测量：使用数显游标卡尺测量每只足的厚度。以每只小鼠四只足的平均厚度作为测量值。</li>
</ol>
3. 在体 关节成像
注意：体内关节成像使我们能够在活体小鼠中观察白细胞向关节内的迁移，并分析其在组织中的行为。为了可视化细胞，可使用经基因工程改造、在特定细胞中表达荧光蛋白的转基因小鼠，以及通过静脉注射抗细胞标志物抗体的小鼠。所用材料如图3所示。
<ol>
	<li>通过腹腔注射对诱发关节炎的小鼠进行麻醉，药物包括美托咪啶（0.3 mg/kg）、咪达唑仑（4 mg/kg）和维托啡（5 mg/kg）。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除小鼠腿部毛发，并辅以脱毛膏（&#60;60 秒）清除残留毛发。避免长时间使用，以防皮肤刺激。</li>
	<li>用湿润的纱布擦除脱毛膏（图 4A）。确保完全去除毛发，以避免成像区域出现不必要的自发荧光。如有需要，可重复操作。</li>
	<li>在麻醉期间，向双眼涂抹无菌角膜润滑剂，以防止角膜干燥或发生溃疡。</li>
	<li>在手术显微镜下，使用显微剪刀沿皮肤做约 1 cm 的切口（图 4B）。 
	注意：此步骤至关重要。手术操作可能诱发白细胞（尤其是中性粒细胞）的募集。应避免任何可能引起伪影的组织损伤。由于关节炎关节存在血管生成，这些关节容易出血。为成功完成手术，可能需要多次练习。</li>
	<li>将患有关节炎的关节置于塑料板上（图 4C）。 
	注意：可使用组织粘合剂帮助固定小鼠腿部。本研究使用黏土将玻璃盖片固定在塑料板上。</li>
	<li>在成像区域覆盖约 1 mL 含磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5% 琼脂糖溶液（图 4D）。 
	注意：确保琼脂糖已冷却，以防止组织损伤，从而避免诱发白细胞向成像区域募集。</li>
	<li>将样本置于显微镜载物台上。 
	注意：在长时间成像过程中，使用加热垫维持小鼠体温。</li>
	<li>调整共聚焦显微镜参数（激光功率、增益、偏移、位置等）。此处使用配备 25 倍水浸物镜（NA 1.1）的共聚焦显微镜，激光激发波长设为 488 nm、561 nm 和 640 nm，发射光收集波长分别为 488.0 nm、561.6 nm 和 638.5 nm。
	<ol>
		<li>检查显微镜的扫描速率。采用 512 × 512 的像素分辨率，5 层光学切片，Z 轴步进为 4 µm，循环时间为 15 秒，以便在足够的时间范围内分析单个运动细胞，获得有意义的数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定合适成像位置后，开始图像采集。 
	注意：若使用抗细胞标志物抗体标记白细胞，应在成像开始前 3 分钟静脉注射抗体。为实现血管可视化，可同时注射量子点、CD31 抗体或葡聚糖。例如，每只小鼠注射约 2 µg 针对中性粒细胞的 Ly6G 抗体和针对 T 细胞的 CD4 抗体，以及约 80 µg 的 680-250k 葡聚糖用于血管染色。抗体和葡聚糖通常溶于 100 µL 无菌 PBS 中。需注意某些抗体可能导致白细胞耗竭，因此应确认所选抗体不会降低白细胞数量。</li>
	<li>使用 NIS-Elements 图像分析软件（版本 6.20.00）中的通用分析 3（GA3）模块处理共聚焦显微镜获取的 ND2 文件图像。进行血管区域提取和背景扣除。完成所有时间帧的处理后，将图像导出为视频。 
	注意：作为分析的一部分，需统计黏附和外渗的细胞数量。</li>
	<li>成像结束后，根据实验设计决定让动物恢复（作为存活手术）或实施人道安乐死。若计划让动物存活，应轻柔关闭手术切口，并按照机构动物护理指南提供适当的术后护理。 
	注意：本研究中，所有动物在成像结束后立即依据机构和国家指南实施人道安乐死。</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>以均值 ± 均值标准误（SEM）表示数据。两组间比较采用 Student t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。当 p 值 &#60; 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。 
	注：所有分析均使用 GraphPad Prism 10 版本完成。</li>
</ol>

<ol><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+rheumatic+diseases%3A+pathogenic+role+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications.</a> Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).</li>
<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Murooka, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-infected+T+cells+are+migratory+vehicles+for+viral+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination.</a> Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+function+and+fate+of+neutrophils+in+sterile+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair.</a> Science. 358 (6359), 111-116 (2017).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Miyabe, Y., Kim, N. D., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+chemokine+control+of+neutrophil+migration+in+vivo+in+a+murine+model+of+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studying chemokine control of neutrophil migration in vivo in a murine model of inflammatory arthritis.</a> Methods Enzymol. 570, 207-231 (2016).</li>
<li>Miyabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C5a+receptor+is+the+key+initiator+of+neutrophil+adhesion+igniting+immune+complex-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement C5a receptor is the key initiator of neutrophil adhesion igniting immune complex-induced arthritis.</a> Sci Immunol. 2 (7), eaaj2195(2017).</li>
<li>Sadik, C. D., Miyabe, Y., Sezin, T., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+C5a+as+an+initiator+of+neutrophil-mediated+autoimmune+inflammation+of+the+joint+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The critical role of C5a as an initiator of neutrophil-mediated autoimmune inflammation of the joint and skin.</a> Semin Immunol. 37, 21-29 (2018).</li>
<li>Miyabe, Y., Miyabe, C., Mani, V., Mempel, T. R., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+complement+receptor+C5aR2+transports+C5a+to+initiate+neutrophil+adhesion+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Atypical complement receptor C5aR2 transports C5a to initiate neutrophil adhesion and inflammation.</a> Sci Immunol. 4 (35), eaav5951(2019).</li>
<li>Kohl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igniting+the+flame+in+arthritis%3A+C5aR2+controls+endothelial+transcytosis+of+C5a%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Igniting the flame in arthritis: C5aR2 controls endothelial transcytosis of C5a.</a> Sci Immunol. 4 (35), eaax0352(2019).</li>
<li>Miyabe, Y., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+and+BLT1+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTB4 and BLT1 in inflammatory arthritis.</a> Semin Immunol. 33, 52-57 (2017).</li>
<li>Miyabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+of+lysophosphatidic+acid+receptor+1+for+development+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Necessity of lysophosphatidic acid receptor 1 for development of arthritis.</a> Arthritis Rheum. 65 (8), 2037-2047 (2013).</li>
</ol>

Y.M. 收到了中生北控生物科技股份有限公司的资助/研究支持。

体内关节成像与传统的终点研究不同，能够前所未有地揭示活体小鼠中动态的生物学过程。例如，该技术使我们能够理解四种不同的趋化因子受体——C5aR1、BLT1、CCR1 和 CXCR2——如何协同作用，启动中性粒细胞向关节炎炎症关节的募集10,11。此外，体内成像还揭示了C5aR2在将C5a从组织运输至血管腔过程中的一种新功能作用12。
然而，在使用该方法时需考虑若干关键步骤和局限性，具体如下。（i）手术挑战：手术操作可能引发白细胞（尤其是中性粒细胞）向关节内募集。此外，由于血管生成，关节炎关节易于发生出血。为尽量减少因组织损伤和出血造成的干扰，实施手术时需要大量练习并采用精细的操作技术。（ii）分析滚动白细胞的局限性：白细胞迁移级联反应通常包括四个步骤：（1）沿血管壁顺血流方向滚动，（2）在内皮细胞上停止，（3）爬行以寻找合适的迁移位点，以及（4）穿越内皮进入炎症组织（即跨内皮迁移，TE...

由于白细胞是来源于骨髓的血液细胞，必须进入组织才能引发炎症1。调控这一过程是开发新型抗炎治疗手段的关键环节2。通常情况下，白细胞迁移至炎症组织发生在毛细血管后微静脉中，并遵循黏附级联反应：首先，自由流动的白细胞被血管壁捕获；随后，白细胞沿血管壁顺血流方向滚动，继而在内皮细胞上发生黏附停滞，脱离黏附状态后，在血管表面向各个方向爬行，以寻找适宜的位点进行跨内皮迁移（TEM），最终进入组织内的特定区域1,3。
这些不同的步骤受到多种分子信号的共同调控，包括选择素（介导滚动）、整合素（介导停滞和爬行）以及趋化因子（CAs，介导停滞、可能参与爬行及跨内皮迁移）3趋化因子（CAs）通过七次跨膜的G蛋白偶联趋化因子受体（CARs）激活白细胞，并在黏附级联反应中发挥关键作用，包括上调整合素亲和力（导致细胞停滞）以及诱导跨内皮迁移（TEM）。然而，TEM的具体机制尚未完全阐明。传统的终点检测研究以及 体外 实验尚未揭示CA-CAR信号如何动态调控白细胞的迁移行为 体内.
成像技术的最新进展为活体动物中免疫细胞迁移提供了前所未有的观察视角，极大加深了我们对免疫细胞迁移分子调控机制的理解 体内4,5,6. 例如，该技术阐明了中性粒细胞向组织炎症部位（如热损伤引起的肝损伤）迁移的分子调控机制7 以及激光皮肤损伤8因此，我们已着手研究调控中性粒细胞迁移至关节炎症部位的分子机制9。该 体内 此处描述的关节成像研究表明，补体成分C5a受体1（C5aR1）对于启动中性粒细胞与关节内皮细胞的黏附、进而引发关节内炎症至关重要。C5aR1介导了整合素依赖性的中性粒细胞停滞与铺展，随后由白三烯B4受体介导跨内皮迁移（TEM），并由CC趋化因子受体1（CCR1）驱动中性粒细胞爬行。CXC趋化因子受体2（CXCR2）则在炎症关节中中性粒细胞跨内皮迁移的后期阶段发挥作用。10此外， 体内 关节成像揭示了关节内Ⅲ型超敏反应的新范式，其中C5a作为炎症的启动因子，而在当前Ⅲ型超敏反应的范式中，组织驻留细胞在炎症过程中发挥更为重要的作用10,11.
此外，我们应用了关节的体内成像技术来研究C5a在关节内的分子动态。在野生型小鼠中，加载到关节组织的C5a被迅速转运至血管腔内；而在C5aR2缺陷型小鼠中，C5a则完全滞留在滑膜组织中12。这些数据表明，表达于关节内皮细胞上的C5aR2可将C5a转运至血管腔内，这一过程对于关节中依赖C5aR1的中性粒细胞黏附至关重要13。
体内关节成像适用于所有炎症性关节炎模型，可实现长期观察（通常数小时），尽管深层组织（&#62;1 mm）的可视化效果可能因所用显微镜的不同而受限。综上所述，该技术为研究白细胞的迁移行为以及炎症关节内的分子动态提供了强有力的工具。我们分享此体内关节成像方案，以支持从事炎症关节相关研究的科研团队。

<table><tbody><tr><td>29 G × 1/2&quot;</td><td>Terumo</td><td>SS-10M2913</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 乙酸</td><td>富士胶片</td><td>016-18835</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 塑料注射器</td><td>顶部</td><td>19531</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 注射器（用于润滑脂）</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>18 G × 1 1/2&quot;</td><td>Terumo</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>26 G × 1/2&quot;</td><td>Terumo</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>680-250 kDa 葡聚糖</td><td>Biotium</td><td>80135</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>牛II型胶原蛋白</td><td>胶原蛋白研究中心</td><td>K42</td><td></td></tr><tr><td>黏土</td><td>德比卡</td><td>93186</td><td></td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;rsquo;完全弗氏佐剂（CFA）</td><td>Chondrex</td><td>7001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>尼康</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami Glass IND.,Ltd</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>数字滑动卡尺</td><td>Mitsutoyo</td><td>500-180-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（15 mL）</td><td>康宁</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（50 mL）</td><td>康宁</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗小鼠Ly6G抗体</td><td>Biolegend</td><td>127606</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5070</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>NAPOX</td><td>MA-48-2</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器和连接器</td><td>Tsubasa Industry Co., Ltd&amp;nbsp;</td><td>S7P</td><td></td></tr><tr><td>润滑脂</td><td>东丽道康宁有机硅</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>理发剪</td><td>Wahl</td><td>WA5109</td><td></td></tr><tr><td>理发剪</td><td>Wahl</td><td>9966</td><td></td></tr><tr><td>脱毛剂&amp;egrave;我</td><td>Kracie</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>明治</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Sandoz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>湿润纱布</td><td>日本制纸克雷西亚株式会社</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 图像分析 6.20.00</td><td>尼康</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管中的PBS（50 mL）</td><td>岛津诊断公司</td><td>5913</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的抗小鼠CD4抗体</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>塑料板</td><td>康宁</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Prism 10.3.1</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Muto Pure Chemicals Co.,Ltd</td><td>5115</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Olympus</td><td>VMZ</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Vetorphale&amp;nbsp;</td><td>明治</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

In Vivo Imaging Uncovers the Migratory Behavior of Leukocytes within the Joints

白细胞是由骨髓产生的血液细胞，必须迁移至组织中以介导炎症反应。因此，调控这种迁移过程成为开发减轻炎症的新型治疗策略的关键环节。传统的终点式研究无法让我们充分解析白细胞的迁移行为 体内然而，成像技术的最新进展为活体动物中免疫细胞迁移提供了前所未有的洞察，极大地加深了我们对免疫细胞迁移分子调控机制的理解。 
在此，我们提供一个详细的方案 体内 使用小鼠 II 型胶原诱导性关节炎（CIA）模型进行关节成像。将小鼠用溶于完全弗氏佐剂的 II 型胶原进行免疫，通过临床评分和足爪厚度测量监测关节炎进展。在关节炎高峰期，对白细胞进行可视化观察 体内 使用共聚焦显微镜对表达荧光蛋白的转基因小鼠，或对经静脉注射荧光标记抗体及高分子量Dextran以标记血管的野生型小鼠进行成像。通过精细的手术暴露关节，应用琼脂糖并正确固定腿部，可实现稳定的长时间成像，通常可持续数小时。该方法可实现实时分析炎症关节内白细胞的停滞、爬行及跨内皮迁移过程。 
本方案对于研究关节炎及其他炎症性疾病中白细胞迁移的研究团队具有重要价值。它也可作为靶向免疫细胞迁移的治疗策略进行临床前评估的平台。

在第0天和第21天，将8周龄的雄性DBA/1J小鼠用牛II型胶原蛋白与完全弗氏佐剂（CFA）按1:1比例配制的乳剂进行免疫。在第0至42天期间，每隔1-3天进行一次关节炎临床评分和足爪厚度测量。通常在第28天左右开始出现关节炎症状，关节炎临床评分和足爪厚度在第35天左右达到峰值（图5A-C）。DBA/1J小鼠在第35天时胶原诱导性关节炎（CIA）的发生率通常超过90-100%（图5A）15。
相比之下，在第0天和第21天，对8周龄雄性C57BL6小鼠以1:1的比例注射含有鸡II型胶原和完全弗氏佐剂（CFA）的乳剂进行免疫。C57BL6小鼠在胶原诱导性关节炎（CIA）中的发病时间和关节炎高峰期与DBA/1J小鼠相似15。然而，C57BL6小鼠在CIA中的发病率和关节炎临床评分显著低于DBA/1J小鼠<su...

体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。

白细胞是由骨髓产生的血液细胞，必须迁移至组织中以介导炎症反应。控制这种迁移过程，……

由于白细胞是由骨髓产生的血细胞，因此必须进入组织才能引发炎症。调控这一过程是开发新型抗炎治疗手段的关键环节。通常情况下，白细胞迁移至炎症组织发生在毛细血管后微静脉，并遵循黏附级联反应，该过程始于自由流动的白细胞被血管壁捕获。随后沿血管壁向下游方向滚动。在内皮上停滞。因此，通过黏附并在血管表面各个方向爬行，以寻找合适的位置，进而穿过内皮迁移至组织内的特定部位。引发炎症反应。这些不同的步骤受到包括趋化因子在内的一系列分子信号的调控。趋化因子通过ZP Cs激活白细胞，并在细胞迁移级联过程中发挥关键作用。因此，以往的终点研究和体外实验未能揭示趋化因子及其趋化因子受体信号通路如何动态调控白细胞在体内的迁移行为。近年来，成像技术的进步为活体动物中免疫细胞迁移提供了前所未有的观察视角，极大提升了我们对免疫细胞在体内分子调控机制的理解。近期，我们已应用该技术研究调控中性粒细胞迁移至关节炎症部位的分子机制。因此，我们的活体关节成像建立了关节内Ⅲ型超敏反应的新范式。在当前Ⅲ型超敏反应的范式中，补体成分C5a作为炎症的启动因子，而组织驻留细胞在炎症过程中发挥更为重要的作用。因此，活体关节成像是一种有价值的技術，可用于揭示白细胞迁移行为以及炎症关节内的分子动态变化。因此，我们分享这一用于活体关节成像的实验方案，以支持研究炎症关节中该过程的研究团队。将牛II型胶原溶于0.05摩尔的乙酸中，于4摄氏度下振荡过夜，制备胶原稀释液；随后在玻璃注射器中按1:2的比例将胶原稀释液与完全弗氏佐剂混合形成乳剂。也可手动混合约20分钟。此过程会产生热量，因此需将装有乳剂的玻璃注射器置于冰上冷却。在免疫前对小鼠进行麻醉。使用剪毛器理顺尾部毛发，以备免疫接种。在尾部基部附近的皮下空间缓慢注射100微升乳剂。关节炎的临床评分和足爪厚度测量对于评估疾病活动性至关重要。通常在首次免疫后每隔一至三天进行一次关节炎临床评分和足爪厚度测量。关节炎临床评分为此评分是每只小鼠四只脚爪评分的总和。评分记录如下：0分为正常。一种表现为单个脚趾的红斑和肿胀。第二种表现为两个脚趾的红斑和肿胀，或踝关节的红斑和肿胀。第三种表现为三个以上脚趾的红斑和肿胀，或两个脚趾及踝关节的肿胀。4级表现为踝关节、足部和脚趾出现红斑、严重肿胀并伴有畸形。因此，足爪厚度的测量采用数字游标卡尺测量每只足爪的厚度。每只小鼠的足爪厚度取四只足爪厚度的平均值。将小鼠麻醉后，使用剪毛器修剪小鼠腿部毛发。用脱毛膏去除残留的毛发，并用湿润的纱布擦去脱毛膏。在双眼上涂抹无菌角膜润滑剂，以防止角膜干燥并降低角膜振颤的风险。在手术显微镜下，使用显微剪刀沿皮肤做一厘米切口。用含PBS的1.5%琼脂糖覆盖成像区域。将样品置于显微镜载物台上。调节共聚焦显微镜的设置，包括激光功率、增益、偏移和位置。确定合适的位置后，开始图像采集。胶原诱导性关节炎（CIA）的典型实验结果。通常在第28天左右开始出现关节炎症状，关节炎临床评分和足爪厚度在第35天左右达到峰值。在DBA/1小鼠中，到第35天时CIA的发病率通常高达90%至100%。此处左侧视频显示的是对照组小鼠的关节，右侧视频显示的是CIA小鼠的关节。在这些视频中，绿色细胞代表Ly6G阳性中性粒细胞，橙色细胞代表CD4阳性T细胞，白色区域对应血管。第35天时，可以明显观察到血管外的Ly6G阳性中性粒细胞数量多于CD4+T细胞。这些中性粒细胞具有高度运动性，在炎症关节内向多个方向活跃移动。此处展示的是关节活体成像的代表性分析结果。左侧的图表显示了新黏附的中性粒细胞数量，而右侧的图表显示了在30分钟记录期间新迁移的中性粒细胞数量。在关节炎关节中，新黏附和新迁移的中性粒细胞数量均显著高于对照关节中的观察值。综上所述，我们介绍了当前用于关节活体成像的实验方案，该方法能够在生理和病理条件下，对活体小鼠中白细胞的迁移行为进行高分辨率、实时的可视化观察。该技术使我们能够直接观察免疫细胞在炎症组织内的相互作用，以及它们如何黏附于血管壁、迁移进入组织，并协调炎症反应。通过这种方法，我们可以捕捉到利用传统组织学或体外方法无法观察到的动态细胞行为。将该成像系统与定量分析及分子标记物相结合，我们能够揭示驱动关节炎发生与进展的关键通路。重要的是，这些体内观察所获得的见解不仅加深了我们对免疫细胞动态行为的理解，而且为发现新的治疗靶点提供了科学依据。随着该技术的不断发展，以及越来越多的研究人员对方法进行改进和优化，我们相信体内成像将成为研究复杂免疫介导疾病的重要平台，并成为连接基础免疫学与转化医学及临床研究的有力桥梁。最终，我们希望这一方法能够在不久的将来，为类风湿关节炎及其他慢性炎症性疾病的创新疗法开发作出贡献。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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股骨窗室模型 在体 内 小鼠骨髓中的细胞追踪

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非侵入性 体内 利用可激活荧光成像探针进行炎症性基质金属蛋白酶活性的荧光光学成像

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学习利用体内成像技术在小鼠II型胶原诱导性关节炎模型中观察白细胞迁移行为。该方法可实时追踪免疫细胞在发炎关节中的动态，为炎症研究和治疗策略开发提供重要依据。

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

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