基于 DNA 条形码的多重免疫荧光成像分析来自基因重编程小鼠黑色素瘤的 FFPE 标本
2025年6月6日
该方案为设计用于小鼠 FFPE 黑色素瘤组织基于 DNA 条形码的成像的多重免疫荧光抗体面板提供了分步指南。我们还描述了一个使用开源工具的图像分析管道，用于生成对小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。
我们提出了一种开发和验证多重免疫荧光组合的方案，以研究小鼠FFPE组织，并通过研究用递送血浆DNA的纳米颗粒处理的黑色素瘤模型的样本来证明其实用性，编码用于重新编程肿瘤微环境的免疫信号。该领域缺少与小鼠福尔马林固定石蜡包埋FFPE组织兼容的严格开发和验证的多重免疫荧光方案。
福尔马林固定石蜡包埋可长期保留组织形态，易于处理和储存，并能够创建组织微阵列，以便在一张载玻片上查看多个标本。
空间蛋白质组学成像将增强复杂肿瘤微环境的可视化和分析，最终有助于预测免疫反应，从而有助于开发更好的治疗方法。
我们将使用该协议来改进跨更多肿瘤类型和不同免疫器官的小鼠肿瘤模型的空间分析。
[旁白]首先，将FFPE组织载玻片在60摄氏度下烘烤过夜。第二天，在室温下冷却载玻片10分钟，然后开始脱蜡和再水化。接下来，将载玻片在二甲苯溶液中孵育两次，每次五分钟以除去石蜡，然后通过将载玻片通过 100% 乙醇移动两次，每次五分钟来使组织再水化。将载玻片依次放入 90%、70%、50% 和 30% 乙醇溶液中，各 5 分钟。用蒸馏水清洗载玻片两次，每次五分钟。进行抗原修复，然后使用新鲜的漂白溶液漂白组织两次，间隔 45 分钟，然后进行抗体染色。接下来，使用塑料室在 4 摄氏度下进行抗体染色过夜。染色后，取出塑料室并收集先前应用的抗体混合物。在染色缓冲液中洗涤载玻片两次，每次两分钟。将载玻片在装有 40 毫升染色后固定溶液的染色罐中孵育 10 分钟，然后用 PBS 冲洗 3 次，每次 2 分钟。现在将载玻片转移到冰冷的甲醇中五分钟，然后用PBS冲洗。在湿度室下将 200 微升最终固定溶液涂抹在每张载玻片上。在室温下孵育20分钟后，再次在PBS中洗涤载玻片三个循环，每个循环2分钟。如果立即成像，请使用无绒纸巾擦拭组织周围的载玻片。使用流通池组装设备按压流通池 30 秒。如果稍后成像，请将载玻片储存在不将流通池应用到4摄氏度的储存缓冲液中。准备好成像时，将载玻片从储存缓冲液转移到 PBS 中 10 分钟，然后再应用流通池。接下来，根据所需的成像周期制备磨合 DMSO 缓冲液。制备成像循环总数所需的报告储备溶液。将 250 微升报告储备液和每个报告液 5 微升移液到标记的黑色或琥珀色 1 毫升微量离心管中。将溶液转移到黑色 96 孔板上，并用胶箔密封。现在启动成像设备并使用仪器管理器设置参数和曝光时间。将报告板放入设备中，然后将载玻片放入显微镜支架中开始成像。获取染色组织的图像。安装最新版本的数字病理分析软件。单击创建项目，然后选择项目空间的目标文件夹。接下来，单击添加图像，然后单击选择文件。然后导航到由多重免疫荧光成像生成的 QuP TIFF 文件。将图像类型设置为荧光，保留默认设置，然后单击导入。如果使用 QuPath，请双击新图像以打开工作区，然后按“文件”和“保存”定期跟踪项目更改。使用工具栏中的亮度和对比度工具切换标记可见性和查看设置。使用画笔或魔杖工具在整个组织切片周围绘制注释。将此注释定义为完整组织，同时排除不应分析的覆盖皮肤或区域。按住 ALT 键可创建负注释或收缩边界。现在，通过单击“注释”选项卡并按“对象”，然后按“注释”，然后单击“复制所选注释”来选择注释。打开 SOX 10 通道，然后使用 ALT + 画笔/棒工具缩小重复的注释以定义肿瘤区域。现在选择完整的组织注释。然后转到“对象”，然后转到“注释”和“展开注释”。将膨胀半径设置为 1 微米，然后单击运行。将此新注释重命名为“Full Tissue Expansion”。选择肿瘤注释，右键单击，然后选择“在层次结构中插入”。重新选择肿瘤注释，然后转到对象、注释，现在单击反转。将此新注释定义为 Stroma 并对所有组织切片重复此作。要运行单元格分割，请单击“图像”选项卡以查找像素宽度和图像高度。从 GitHub 下载 StarDist 扩展。将 QuPath 扩展StarDist.jar文件导入 QuPath。还可以从 GitHub 下载 StarDist groovy 脚本文件和模型文件。对于每个组织切片，选择肿瘤和基质注释。在设置栏中，单击“自动化”，然后单击“脚本编辑器”以打开脚本界面。打开与图像像素大小相对应的相应 StarDist 细胞分割脚本。出现提示时，选择 StarDistcellsegmodel.pb 进行细胞分割。细胞分割后保存图像，然后依次点击测量、导出测量值，选择相应的图像，并将导出类型设置为细胞，将分隔符设置为.csv。选择输出文件位置，然后点击填充以包含相关指标。对于要用于聚类或表型分析的每个谱系标记，选择一个要导出的平均值。对于蛋白质组学数据的归一化，请打开导出的 CSV 文件并截断列标题以仅保留标记名称。安装最新版本的 R & R Studio 后，从 GitHub 下载标记规范化 .r 脚本并运行它以根据核大小过滤掉单元格。对每个标记执行最小/最大归一化。完成后，保存包含规范化数据的新 CSV 文件。通过蛋白质凝胶电泳确认抗体DNA条形码偶联，在重链区域显示额外的条带。用 4-1BBL/IL-12 纳米颗粒和全身抗 PD1 处理的 B16-F10 侧腹肿瘤的多重免疫荧光成像显示，跨肿瘤切片显示出不同的免疫标志物表达。与修拉表型相比，FlowSOM 聚类识别出更广泛的标记表达强度，最大强度差异约为 0.7 和 0.5。FlowSOM 表型还将更多数量的巨噬细胞分为 M1 和 M2 亚型。巨噬细胞密度的定量表明，与 Seurat 相比，FlowSOM 检测到的 M1 和 M2 巨噬细胞密度更高，而 Seurat 将更多的巨噬细胞归类为其他。空间分析表明，M2巨噬细胞和自然杀伤细胞在治疗后的平均最小距离最高，M1巨噬细胞在CD8 T细胞周围更为普遍。
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概述
本协议为设计用于基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织的多重免疫荧光抗体面板提供了逐步指南。它还描述了使用开源工具生成小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境空间蛋白质组学洞察的图像分析流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 病理学
背景
- 多重免疫荧光允许在组织样本中可视化多个目标。
- 基于DNA条形码的成像提高了检测的特异性和敏感性。
- 理解肿瘤免疫微环境对于开发有效的治疗方法至关重要。
- 开源工具为研究人员提供了可访问的图像分析。
研究目的
- 提供创建抗体面板的综合协议。
- 使研究人员能够分析黑色素瘤的免疫景观。
- 促进在空间蛋白质组学研究中使用开源工具。
使用的方法
- 设计多重免疫荧光抗体面板。
- 在小鼠FFPE黑色素瘤组织上进行基于DNA条形码的成像。
- 使用开源图像分析工具。
- 生成关于肿瘤免疫微环境的洞察。
主要结果
- 成功设计了用于黑色素瘤组织的多重抗体面板。
- 有效地成像和分析了免疫微环境。
- 关于肿瘤生物学的空间蛋白质组学洞察。
- 展示了开源工具在研究中的实用性。
结论
- 该协议为研究黑色素瘤的研究人员提供了宝贵的资源。
- 多重免疫荧光可以揭示肿瘤微环境中的复杂相互作用。
- 开源工具增强了先进成像技术的可访问性。
常见问题
Executive Industry Relevance
DNA-barcode-based multiplex immunofluorescence imaging enables high-dimensional spatial proteomics in FFPE specimens, addressing a critical need for robust immune microenvironment analysis in preclinical oncology models. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking by quantifying cell phenotypes and spatial relationships in genetically reprogrammed murine melanoma. The protocol's compatibility with widely available FFPE samples enhances translational continuity and portfolio decision-making in immuno-oncology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of immune and tumor cell phenotypes in situ.
- Supports functional target validation by quantifying protein expression and cell interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-content spatial proteomics data.
- Improves predictive confidence for immunologic pathway modulation in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Provides a framework for designing and validating multiplex antibody panels for FFPE tissues.
- Standardizes quantitative imaging outputs for reproducible downstream analysis.
- Enables scalable screening of immune-modulating interventions in tissue microarrays.
- Supports reliable evaluation of nanoparticle-delivered genetic payloads in tumor models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with disease-relevant murine melanoma models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation using FFPE specimens.
- Enables risk-adjusted advancement of immuno-oncology candidates based on spatial biomarker data.
- Supports translational biomarker development by quantifying immune contexture in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics analysis of FFPE tissues, supporting both early target validation and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via multiplexed protein detection in tissue context.
- Screening: Delivers standardized, quantitative imaging outputs for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides cell segmentation, phenotyping, and spatial metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges preclinical findings to clinical relevance by leveraging FFPE compatibility and spatial biomarker quantification.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline for diverse FFPE-based immuno-oncology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune microenvironment studies.
- Operational Value: Standardizes multiplex imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing high-content spatial data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immuno-oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and validation for FFPE tissues.
- Needs access to DNA-barcode-based imaging instrumentation and open-source computational tools.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- May require adaptation of antibody panels for different tissue types or disease models.
- Dependent on the availability of well-characterized antibodies and validated image analysis pipelines.
