在奥沃 患者来源的急性淋巴细胞白血病 （ALL） 细胞的异种移植 （PDX-ALL）

这项研究的范围是癌症生物学，重点是确定治疗癌症的治疗策略。卵内患者来源的异种移植物急性淋巴细胞白血病模型受到大约 10 天的相对较短的实验窗口的限制，限制了对急性淋巴细胞白血病进展或超过此时间范围的药物反应的长期研究。该协议建立了一种快速、具有成本效益的方法，用于卵内异种移植患者来源的急性淋巴细胞白血病细胞，包括 B 细胞和 T 细胞谱系。

该协议代表了白血病研究中临床前药物筛选、机制研究和潜在个性化医疗方法的有前途的工具。将探讨使用已建立的卵内异种移植模型进行临床前应用的可行性。首先，将采购的鸡蛋转移到湿度约为 50% 至 60% 和温度为 39 摄氏度的加湿滚动孵化器中。

受精后将卵子在这个孵化器中孵化 10 天。将血样转移到无菌的 50 毫升离心管中，并使用两体积的 PBS 将每个样品稀释 3 倍。将样品与密度梯度培养基一起离心后，从界面收集单核细胞的血沉棕黄层，并将其转移到新的无菌 15 毫升管中。

向试管中加入 10 毫升 PBS，并将试管以 300 G 离心 5 分钟以去除剩余的血清成分。将沉淀的细胞重悬于补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中。使用血细胞计数器计算细胞数量。

将细胞重悬于FBS中由10%DMSO组成的冷冻培养基中。使用台盼蓝排除测定评估细胞活力，并将细胞冷冻在零下 80 摄氏度并储存在液氮中。接下来，使用 Lipofectamine 3000 将 150 万个 HEK 293 T 细胞与所需的质粒载体共转染，并将转染的细胞孵育两天。

从孔中收获含有慢病毒的上清液，并通过 0.45 微米过滤器过滤以去除碎屑。将过滤后的病毒上清液转移到离心管中，并在 4 摄氏度下以 20， 000 G 离心两小时。对于标记，将每毫升 B 细胞前体 SEM 和 T 细胞 MOLT3 细胞系以及患者来源的 B 或 T 急性淋巴细胞白血病细胞接种到含有 RPMI 1640 和 10% FBS 的六孔板中。

在荧光显微镜下观察 mCherry 标记的细胞。第10天，在光照下检查雏鸡胚胎的脉管系统以评估胚胎活力，用70%乙醇轻轻清洗每个鸡蛋的表面。使用手钻钻入每个鸡蛋的气室，形成一个直径约两厘米的小窗口。

用透明胶带密封创建的窗口，并将鸡蛋放回 5% 二氧化碳孵化器中。在第11天，使用34号针头将1000万mCherry标记的急性淋巴细胞白血病细胞注射到发育中胚胎的血管中。密封窗口后，将卵子放回 5% 二氧化碳培养箱中，并每天监测胚胎活力。

在第 15 天，从胚胎中解剖血管。将它们放在载玻片上，并使用配备荧光功能的解剖显微镜拍摄成功的异种移植物。使用带有 32 号针头的无菌注射器从鸡胚胎的脉管系统中采集血液。

将血液转移到含有肝素的1.5毫升无菌管中，并在4摄氏度下以226G离心10分钟。用人 FITC CD10 和人 PE CD19 抗体标记 B 细胞急性淋巴细胞白血病细胞，用人 FITC CD4 和人 PE CD8 抗体标记 T 细胞急性淋巴细胞白血病细胞，在 4 摄氏度的黑暗中标记 30 分钟。使用含有1%BSA的PBS洗涤标记的细胞两次，并使用流式细胞术进行分析注射后四天，SEM和MOLT3细胞系的血管定植清晰可见，证实成功植入发育中的鸡胚胎脉管系统。

患者来源的 B-all 和 T-all 细胞在注射后 4 天在血管中显示出强烈的荧光信号，表明脉管系统中活跃的定植和增殖。流式细胞术显示，与注射后 6 小时收集的对照相比，注射后 4 天注射 SEM 的胚胎和患者来源的 B-all 细胞中 CD10/CD19 阳性细胞显着增加。同样，在注射后 4 天，注射 MOLT3 的胚胎和患者来源的 T-all 细胞中的 CD4/CD8 阳性细胞显着升高。