Name: 建立背根神经节培养的 体外 模型：研究癌症-神经串扰的补充方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T16:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 了解建立小鼠背根神经节三维整体培养与二维分散培养的方法，用于研究肿瘤-神经相互作用及神经引导的癌细胞侵袭机制。该方案可从单只小鼠同时获得组织水平与单细胞数据。

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本研究得到了加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research，项目编号：PJT-178274）（LMM）的运营资助，安大略省研究生奖学金（LCBO）以及巴西高等教育人员改善协调机构（Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel - Brazil，CAPES）奖学金（资助代码：001）（ERP）的支持。LMM 是女王大学遗传学与分子医学领域的 Bracken 讲席教授。部分图像使用 Biorender 软件生成。

所有小鼠实验均经皇后大学动物护理委员会办公室审查并批准（方案编号 2524）。动物的饲养和安乐死以获取组织的过程均遵循加拿大动物护理委员会以及英国研究中动物替代、优化与减少国家中心（National Centre for the Replacement, Refinement &amp;#38; Reduction on Animals in Research）的伦理指南。在本方案中，我们使用了从 C57BL/6 动物分离的组织，但也成功应用了其他基因型，包括 Rag2IL2Rγc 基因敲除动物。第 1 至第 6 部分可在经表面消毒的实验台上的洁净环境中进行（见图 1），而第 7 至第 9 部分必须在生物安全柜中操作。为了便于理解，我们绘制了相关步骤的示意图（图 1）。
1. 储备液的配制
<ol>
	<li>配制木瓜蛋白酶溶液和胶原酶IV/分散酶II溶液。将木瓜蛋白酶溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为30 U/mL；分装为1 mL等份，于-20 °C保存。将IV型胶原酶溶于PBS中至1.25 mg/mL，分散酶II溶于PBS中至2.5 mg/mL，分装为1 mL等份，于-20 °C保存。</li>
	<li>配制含补充成分的Neurobasal培养基（F12），添加2% B27补充剂（50倍浓缩液）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）（100倍浓缩液）。</li>
	<li>配制含1%青霉素-链霉素（100倍浓缩液）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。 
	注意：为支持细胞初始存活和贴壁，使用添加10% FBS的F12培养基有助于提高培养体系的建立效率。然而，FBS也会促进非神经元细胞（包括成纤维细胞）的增殖。可采用低血清或无血清培养条件（例如仅添加B27的F12培养基）以减少背根神经节（DRG）培养及与癌细胞共培养体系中非神经元细胞的生长，但可能影响细胞存活率，尤其是解离后的神经元培养。当收集DRG条件培养基以评估其对癌细胞行为的影响时，也应考虑使用无血清培养基。</li>
</ol>
2. 准备背根神经节解剖所需的试剂和材料（图1A）
<ol>
	<li>将手术器械进行高压灭菌。用70%乙醇对解剖显微镜表面消毒，并置于洁净工作台上备用。</li>
	<li>向两个10 cm培养皿中各加入6–8 mL HBSS-Pen-Strep（步骤1.3），置于冰上。 
	注意：这些培养皿将用于收集解剖后的脊柱。根据解剖脊髓的数量，可能需要额外的培养皿。</li>
	<li>向一个15 mL锥形管中加入8–10 mL HBSS-Pen-Strep，并置于冰上。</li>
	<li>向一个3 cm培养皿中加入3 mL HBSS-Pen-Strep，并置于冰上。 
	注意：步骤2.3中准备的15 mL离心管将用于收集背根神经节（DRG）以进行解离，而步骤2.4中的3 cm培养皿将用于收集用于整体装片模型的DRG。</li>
</ol>
3. 准备背根神经节整体培养所需的试剂和材料
注意：本节中的某些步骤可能需要过夜准备。尽管任何类型的组织培养板均可用于背根神经节（DRG）培养，但本方案中的体积和操作步骤已针对8孔玻璃底培养板优化，以获得最佳成像质量。8孔玻璃底培养板、移液器吸头和Matrigel在使用过程中应始终保持在冰上。
<ol>
	<li>使用前在 4 °C 下过夜（或至少 3 小时）解冻 Matrigel 溶液。确保 Matrigel 始终置于冰上。</li>
	<li>将移液器吸头和 8 孔玻璃底培养皿于 -20 °C 预冷过夜，以尽量减少 Matrigel 粘附在吸头上，并防止 Matrigel 在培养板中过早聚合。</li>
	<li>将添加了补充物的培养基（步骤 1.2）在 37 °C 水浴中预热。</li>
</ol>
4. 准备分离背根神经节培养所需的试剂和材料
<ol>
	<li>将木瓜蛋白酶溶液和胶原酶IV/分散酶II溶液（步骤1.1）在37 °C水浴中解冻，直至准备使用。 
	注意：每只解剖的小鼠需使用一份（1 mL）木瓜蛋白酶溶液和一份（1 mL）胶原酶IV/分散酶II溶液。</li>
	<li>预热添加补充物的培养基（步骤1.2）。</li>
</ol>
5. 收集脊柱（图1B）并解剖背根神经节（图1C）
<ol>
	<li>通过异氟烷过量麻醉后行颈椎脱位法处死4至8周龄小鼠。将已处死的动物俯卧位放置，并剃除其体表毛发，重点剃除脊柱区域的毛发（图1B，步骤1,2）。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒动物背部，并清除任何松散的毛发，使用纸巾从尾部向头颅方向擦拭，以防止毛发污染解剖过程。</li>
	<li>使用灭菌剪刀沿剃毛后的背侧表面从尾部至头颅做一直线切口。用钝头镊子将切口两侧的皮肤向两边拉开，暴露脊柱（图1B，步骤3）。</li>
	<li>为防止毛发污染，使用一套新的镊子和剪刀，在脊柱基部（尾端）做一横向切口（图1B，步骤4）。</li>
	<li>在脊柱两侧各做两条平行的纵向切口以释放脊柱。用镊子轻轻提起脊柱，去除周围结缔组织（图1B，步骤5）。</li>
	<li>为完全游离脊柱，于脊柱顶端（靠近头颅端）做一切口。将脊柱转移至预冷的含HBSS-青霉素-链霉素的10 cm培养皿中，置于冰上（步骤2.2）（图1C，步骤6）。 
	注意：可先将所有脊柱收集于同一个10 cm培养皿中，再逐个转移至另一培养皿进行后续解剖操作，较为方便。</li>
</ol>
6. 解剖背根神经节（DRGs）
<ol>
	<li>使用弹簧剪去除脊柱周围残留的结缔组织，暴露椎骨（图1C，步骤7）。这有助于更清晰地观察椎骨，并便于沿中线进行切割。将修整后的脊柱收集至一个新的预冷的10 cm培养皿中（步骤2.2）。</li>
	<li>逐个将修整后的脊髓转移至显微镜载物台上进行解剖。使用弹簧剪沿矢状面小心地将脊柱切开（图1D，步骤8）。</li>
	<li>使用尖头镊子将脊髓从脊柱中取出，双侧暴露沿脊神经根分布的背根神经节（DRG）（图1D，步骤9）。 
	注意：此步骤需格外小心，若操作过于粗暴，可能导致DRG随脊髓一同被移除。</li>
	<li>用弹簧剪切断脊神经，并去除DRG周围的结缔组织（图1D，步骤10）。 
	注意：此步骤中去除结缔组织可减少DRG培养中的碎片污染。</li>
	<li>使用尖头镊子轻轻牵拉DRG，将其从背根中分离出来。对于整体装片培养，将DRG置于3 cm培养皿中（步骤2.4已准备）（图1D，步骤11）。其余DRG收集至15 mL锥形管中（步骤2.3已准备），用于后续解离。 
	注意：整个解剖过程中，培养皿和离心管应始终保持在冰上。</li>
	<li>重复步骤6.4至6.5，直至所有DRG均被分离。对其他脊柱样本重复上述所有步骤。 
	注意：小鼠根据品系不同具有30–31对DRG，因此每只动物最多可获得60个DRG。若仅从腰段脊髓收集DRG，则可获取10个DRG。使用同一只动物的DRG建立两种培养模型，可降低实验内变异，确保互补实验之间结果的一致性和可比性。 
	注意：所有DRG分离后的操作均须在生物安全柜中进行。</li>
</ol>
7. 背根神经节整体培养（图2）
<ol>
	<li>使用预冷的枪头（步骤 3.2），将 2 µL 冰冷的 Matrigel 滴加至置于冰上的 8 孔玻璃底培养板的每个孔中，形成液滴（图 2A，步骤 1）。为防止在加入背根神经节（DRG）前 Matrigel 过早聚合，每次仅滴加一个液滴。为避免划伤载玻片表面，在将培养板置于冰上之前，先将其放入一个 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>使用尖头镊子将一个 DRG 转移至干燥的培养皿中，并轻轻移动以去除多余的 HBSS，从而防止将 DRG 加入 Matrigel 液滴时进一步稀释 Matrigel。随后将 DRG 转移至 Matrigel 液滴中（图 2A，步骤 2）。 
	注意：使用尖头镊子轻轻将 DRG 推入 Matrigel 液滴中，确保 DRG 完全浸没并位于液滴中央。</li>
	<li>对每个加入 Matrigel 液滴的 DRG 重复步骤 7.1 至 7.2。</li>
	<li>将 8 孔玻璃底培养板置于湿润的培养箱中，在 37 °C 下孵育 5 分钟，使 Matrigel 聚合（图 2A，步骤 3）。</li>
	<li>小心地向每个孔中加入 200 µL 预热的含补充物的培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育（图 2B，步骤 4）。每 72 小时更换一次新鲜的含补充物的培养基。</li>
	<li>使用明场显微镜每天监测 DRG，评估其存活状态及神经突的生长情况（图 2C 和 图 3）。 
	注意：存活状态可通过神经突长度和密度的增加来判断。可随时间连续采集图像，以展示 DRG 细胞突起的发育过程（图 3）。</li>
</ol>
8. 背根神经节离体培养（图4）
注意：可使用任何多孔板来接种解离的背根神经节（DRG）神经元。然而，在本方案中使用了8孔玻璃底培养皿，因为其可提供更佳的细胞汇合度，并为免疫荧光分析提供更优的成像质量。
<ol>
	<li>用胶原蛋白包被培养板
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，制备浓度为 50 µg/mL 的酸化 I 型胶原蛋白工作液，溶剂为无菌的 0.01 M HCl。</li>
		<li>将 100 µL I 型胶原蛋白溶液加入 8 孔玻璃底培养板的每个孔中。倾斜并轻轻旋转培养板，确保胶原蛋白溶液均匀覆盖每个孔的底部表面。将培养板置于 37 °C 恒湿培养箱中孵育 1 小时，以确保 I 型胶原蛋白充分聚合。 
		注意：在孵育期间，可继续进行步骤 8.2 和 8.3。</li>
		<li>孵育结束后，用移液器轻轻吸出各孔中未聚合的残余 I 型胶原蛋白溶液。每孔用 100 µL PBS 清洗一次，再吸去多余的 PBS，仅保留一层薄薄的液体，以防止胶原蛋白干燥。 
		注意：8 孔玻璃底培养板可保留在生物安全柜中，直至分离的背根神经节（DRG）准备好进行接种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶消化
	<ol>
		<li>将含有已提取 DRG 的 15 mL 离心管（步骤 6.5）在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使 DRG 沉淀。用移液器小心吸除 HBSS 溶液。</li>
		<li>用预热的补充培养基清洗 DRG，轻轻敲击离心管以确保充分洗涤，然后以 200 × g 离心 5 分钟，使 DRG 沉淀。</li>
		<li>吸除培养基，加入 1 mL 木瓜蛋白酶（Papain）溶液（图 4A，步骤 1）。轻轻混匀后，在 37 °C 组织培养箱中孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻摇动离心管一次。</li>
		<li>20 分钟后，加入 4.5 mL 补充培养基，轻轻混匀以中和木瓜蛋白酶。将离心管以 400 × g 离心 5 分钟，使 DRG 沉淀。用移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>加入 1 mL IV 型胶原酶/Dispase II 溶液，在 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻摇动离心管一次（图 4A，步骤 1）。</li>
		<li>20 分钟后，加入 4.5 mL 补充培养基，轻轻混匀以中和 IV 型胶原酶/Dispase II 溶液。将离心管以 400 × g 离心 5 分钟，使 DRG 沉淀。用移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>加入 2 mL 补充培养基，并加入 DNase I 至终浓度为 0.2 mg/mL。此时 DRG 已充分消化，可能呈现为松散的团块（图 4A，步骤 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>机械解离
	<ol>
		<li>用 1000 µL 带滤芯的移液枪头轻轻吹打 DRG，上下吹吸 4–5 次（图 4A，步骤 2）。</li>
		<li>使用 200 µL 移液枪头进行第二次吹打，上下吹吸 4–5 次。此步骤后，样品呈浑浊状，仍可见少量组织团块（图 4A，步骤 2）。</li>
		<li>将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤至 50 mL 锥形管中。逐步用 10 mL 培养基冲洗细胞筛，确保所有细胞完全滤过（图 4A，步骤 3）。</li>
		<li>以 1,000 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。吸除上清液，将细胞重悬于 500 µL 补充培养基中（图 4A，步骤 4）。</li>
		<li>从 8 孔玻璃底培养板的各孔中去除残余的 PBS。将分离的 DRG 悬液分配至已包被胶原蛋白的各孔中。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的恒湿培养箱中孵育。根据需要添加更多培养基，并每 48 小时更换为新鲜的补充培养基（图 4B，步骤 5）。 
		注意：可使用血细胞计数板或细胞计数仪结合台盼蓝染色对分离的 DRG 细胞进行计数，以确保每孔接种的细胞数量一致。本实验方案中，每孔接种约 1 × 105 个细胞。</li>
		<li>使用明场显微镜观察 DRG 来源的细胞，评估细胞活力及神经突生长情况（图 4C 和 图 5）。 
		注意：神经元表现为边界清晰的圆形胞体，通常需要 24 小时或更长时间才能贴壁；而非神经元细胞通常先于神经元沉降。接种后约 24 小时可观察到部分神经突生长，随培养时间延长，神经突生长在 7 天内逐渐增加。在加入癌细胞并建立共培养体系前，分离的 DRG 细胞及整体 DRG 组织需预先孵育 72 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 准备癌细胞悬液并建立共培养体系
注意：可使用多种贴壁癌细胞。共培养的培养基和细胞数量取决于细胞系。我们建议在实验前进行预实验，以确定细胞收集时间以及最佳的细胞接种数量。本方案基于人胰腺癌细胞系 PanC1 和 MiaPaCa2，以及前列腺癌细胞系 DU-145 的使用。
<ol>
	<li>用无血清培养基洗涤细胞，并加入2 mL胰蛋白酶/10 cm培养皿，消化约3分钟。</li>
	<li>加入6 mL完全培养基中和胰蛋白酶，轻轻吹打数次以确保形成单细胞悬液。使用血细胞计数板和台盼蓝染色对细胞进行计数。</li>
	<li>将癌细胞以2 × 105&#160;个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中（步骤1.2）。 
	注意：最佳细胞密度可能因细胞大小、倍增时间以及共培养持续时间而异，可根据需要进行调整。</li>
	<li>全组织DRG与癌细胞共培养（图6B）
	<ol>
		<li>吸除8孔玻璃底培养板中全组织DRG培养物的培养基。</li>
		<li>将200 µL癌细胞悬液（步骤9.3）轻轻吹加至含有全组织DRG的Matrigel液滴表面。 
		注意：此操作可确保癌细胞在液滴周围均匀分布。注意避免移液枪头接触Matrigel液滴，以免扰动结构。</li>
		<li>将共培养板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育。每天更换培养基：先用200 µL预温的完全培养基轻柔洗涤一次，再向每孔加入300 µL完全培养基。 
		注意：使用移液器轻柔吸除旧培养基，避免扰动DRG与癌细胞的共培养体系。随着时间推移，共培养体系逐渐变得更加复杂和有序，也更易受到外界扰动，可能影响细胞间相互作用及共培养结构的完整性。</li>
		<li>每隔24小时使用明场或荧光显微镜观察共培养情况，评估癌细胞行为及与神经元的相互作用（图6C）。 
		注意：观察频率可根据实验时间线及关注的细胞相互作用进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解离DRG与癌细胞共培养（图6C）
	<ol>
		<li>吸除8孔玻璃底培养板中解离培养物的培养基。</li>
		<li>将200 µL癌细胞悬液（步骤9.3）轻柔地加入每孔中。后续孵育、培养基更换及观察步骤同全组织共培养（步骤9.4.3和9.4.4）。 
		注意：为更清晰地观察细胞过程及癌细胞-神经元相互作用，可按照制造商说明书向培养体系中添加荧光细胞标记物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案介绍了建立背根神经节（DRG）原代神经二维（2D）和三维（3D）培养及其与癌细胞共培养应用的改进方法。该方案在先前方法的基础上进行了提升，能够同时平行建立2D和3D两种模型。由于2D和3D模型使用来自相同动物的原代神经同时建立，因此最大限度地减少了个体间和实验间的变异，使得两种模型的数据更易于比较或整合，从而有助于对细胞行为和复杂组织反应进行互补性观察。本方案进一步优化了神经解剖和解离条件，以在添加肿瘤细胞前最大程度地促进神经突生长及神经微环境的成熟。我们还提供了额外的方法学细节，以应对常见的技术难题，减少污染，并提高培养建立的效率，确保实验条件的可重复性，并拓展该方案在不同实验模型中的适用性。在这方面，我们已成功利用该方案从多种遗传背景的小鼠中建立神经培养，并在野生型近交系或远交系（如C57BL/6、CD-1）以及免疫缺陷动物（如Rag2IL2Rγc KO）中获得了类似成功，证实了该方法具有广泛的适用性。
尽管将完整脊神经节（DRG）包埋于Matrigel液滴中进行整体封片可实现在复杂的三维环境中研究生物学机制，但分离的DRG培养则使我们能够观察单个细胞的行为与结构，...

肿瘤通过局部侵袭以及区域或远处转移而发生播散，是癌症相关死亡的主要原因。尽管研究多集中于肿瘤细胞经血管或淋巴管途径扩散，但在许多实体瘤中，包括胰腺癌1,2、前列腺癌3、头颈部肿瘤4、乳腺癌5和结直肠癌6，均常观察到肿瘤细胞的神经侵袭现象。近年来，大量研究揭示了神经在促进肿瘤生长与进展中的新兴作用，并作为肿瘤播散的途径，推动转移灶的形成7,8。在此背景下，癌症神经科学作为一个重要的研究领域应运而生，通过阐明肿瘤细胞与周围神经系统（PNS）基本组分之间的相互作用，为肿瘤学提供了新的研究视角，这些相互作用可能参与上述过程8,9。
周围神经系统（PNS）由外周神经和神经节组成，这些是包含多种细胞类型的异质性结构，包括大小和功能各异的神经元、施万细胞及其他胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、黑色素细胞以及形成局部脉管系统的血管内皮细胞10。PNS是肿瘤微环境（TME）的关键组成部分，癌细胞与神经之间可通过直接的物理接触或间接释放神经营养因子、神经递质、生长因子及其他信号分子进行双向通讯，从而促进神经侵袭并推动更具侵袭性的表型发展8。
体外模型可用于表征参与神经维持和修复过程的机制，并越来越多地被用于研究神经细胞与癌细胞之间的细胞相互作用11,12。一种常用的体外模型是将提取的小鼠背根神经节（DRG）与肿瘤细胞进行共培养11。这些模型通常采用解离的DRG细胞进行二维（2D）单层培养，以在体外研究神经元生物学，并已被用于模拟周围神经系统（PNS）中的细胞相互作用13,14。然而，2D培养缺乏神经微环境的复杂性，难以真实再现其体内结构。周围神经元或神经节的三维（3D）整体装片提供了一种替代方案，能更有效地模拟周围神经的生理状态，从而更全面地反映神经与环境之间的相互作用15,16,17,18。然而，该模型的异质性限制了对细胞间相互作用的可视化或定量分析，且此类模型更适用于观察周围神经的整体反应，而非深入探究特定的细胞间相互作用及对刺激的机制性响应。因此，显然解离神经元培养与整体装片培养具有互补性，平行评估2D与3D模型是同时分析刺激对整体效应及单个细胞反应影响的最佳策略。
本方案描述了生成互补的解离（二维）和整体（三维）神经培养物的方法，可用于在细胞和组织水平上评估神经细胞与癌细胞之间的相互作用，相较于仅使用单一类型培养的方法，能够更全面地揭示这些相互作用1,13。这些模型可用于观察和评估细胞过程，包括神经细胞形态和神经突生长，以及肿瘤细胞对神经元分泌的趋化因子（如神经营养因子）的反应，以及感觉神经元与肿瘤细胞之间的双向通讯。此外，该模型还允许探索肿瘤细胞与神经微环境中其他组分（如免疫细胞、成纤维细胞和胶质细胞）之间可能存在的相互作用。我们以活细胞染色或免疫荧光成像为例，重点展示了这些模型在随时间动态研究神经-癌细胞相互作用中的应用，用以说明评估或量化细胞间相互作用及反应的方法。综合而言，利用这些方法所获得的结果将加深我们对神经系统如何促进癌症生长与扩散的理解，并有助于开发针对这些机制的干预策略。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Progene</td><td>71-229483-ULT</td><td>用于过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>8孔玻璃底板载玻片</td><td>IBidi，德国慕尼黑</td><td>80807</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 细镊子</td><td>Fine Science Tools，美国福斯特城</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools，美国福斯特城</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools，美国福斯特城</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图案镊子</td><td>Fine Science Tools，美国福斯特城</td><td>91121-12</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools，美国福斯特城</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D8662-500ML</td><td>用于溶解酶</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩）</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>17504044</td><td>在F12培养基中以2%浓度使用</td></tr><tr><td>牛I型胶原蛋白</td><td>康宁公司，美国纽约</td><td>354231</td><td>用于包被板，工作液浓度为50 &amp;micro;g/mL，溶于 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>C4-BIOC</td><td>用 PBS 溶解至 1.25 mg/mL，分装，-20 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏，巴塞尔，瑞士</td><td>4942078001</td><td>用 PBS 溶解至 2.5 mg/mL，分装，-20 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏公司，巴塞尔，瑞士</td><td>11284932001</td><td>最终浓度添加&amp;nbsp; 解离过程中 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国</td><td>F1051</td><td>在F12培养基中以10%浓度使用</td></tr><tr><td>HBSS（Hank氏平衡盐溶液）</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>H6648-500ML</td><td>用含1%青霉素-链霉素的溶液配制</td></tr><tr><td>基质胶生长因子减少型</td><td>康宁公司，美国纽约</td><td>356231</td><td>4℃解冻 &amp;deg;4°C 过夜，置于冰上</td></tr><tr><td>Ham/F-12 营养混合物</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>N6658-500ML</td><td>制备添加物培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>罗氏公司，巴塞尔，瑞士</td><td>10108014001</td><td>用 PBS 溶解至 30 U/mL，分装，-20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩液）</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国</td><td>P4333-100ML</td><td>在培养基中以1%浓度使用</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国</td><td>T8154-100ML</td><td>评估细胞活力</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州</td><td>12605-028</td><td>用于收集癌细胞</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-微管蛋白III抗体</td><td>Abcam（英国剑桥）</td><td>AB15568</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>美国马萨诸塞州，赛默飞世尔科技公司</td><td>A-11008</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州</td><td>A-21442</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>A-21245</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>NeuN 抗体</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国</td><td>MAB377</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;荧光染料 &amp;和探针&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂（Phalloidin）</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>R37110</td><td>稀释比例 1:40</td></tr><tr><td>CellTrace 钙黄绿素红-橙</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>C34851</td><td>使用细胞示踪剂在荧光显微镜下观察神经元</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>H3570</td><td>稀释比例 1:5000</td></tr></tbody></table>

建立 体外 背根神经节培养模型：探究癌症-神经相互作用的互补方法

Establishing In Vitro Models of Dorsal Root Ganglia Culture: Complementary Approaches for Investigating Cancer-Nerve Crosstalk

神经系统对肿瘤微环境的贡献，以及神经侵袭作为癌症扩散途径的重要性，正日益受到关注。癌细胞与神经元之间的相互作用可促进癌细胞在神经周围及神经内侵袭，这是多种癌症的共同特征，且常伴随不良的临床预后。体外模型可用于研究神经元与癌细胞之间的双向相互作用，为理解癌症扩散机制并探索干预策略提供了重要工具。
在此，我们描述了一种小鼠背根神经节（DRG）分离的实验方案，以及整体组织培养和解离单层培养体系的建立方法，可用于随时间观察神经元形态及神经突的生长情况。将完整的DRG置于Matrigel中进行整体培养，可在更接近体内异质性环境的条件下维持神经结构及其对刺激的反应能力 体内 神经，而分离的神经培养则更便于评估细胞间的直接相互作用。一旦建立背根神经节（DRG）培养，即可加入癌细胞以构建共培养体系，用于观察癌细胞对神经突生长及神经形态变化的影响。此外，还可评估癌细胞在神经源性信号作用下，或在促生长或抑生长条件下随时间推移的生长或运动能力变化，并可视化癌细胞与神经突起直接接触所产生的效应。 
由于两种共培养模型可同时构建，本方案能够更全面地揭示癌症细胞与神经元相互作用的影响，并有助于比较不同处理条件，整合来自细胞水平和完整神经节水平的信息。该方案将促进神经-肿瘤相互作用的研究，可用于多种应用，包括细胞信号传导研究、药物筛选，或肿瘤-神经微环境异质性及肿瘤沿神经扩散机制的研究。

本方案描述了原代小鼠背根神经节（DRG）来源细胞的分离方法，以及两种互补培养模型的建立：解离的DRG培养和整体安装的DRG培养，这两种模型使我们能够在不同复杂程度下研究神经细胞与癌细胞之间的相互作用。本方案的一个关键优势在于，两种类型的培养物均可来自同一动物的DRG，从而最大限度地减少个体间和实验间的变异性，并使各模型产生的信息更易于整合，从而更全面地揭示细胞动态及细胞间相互作用。这些培养模型可适用于多种应用，但本文重点介绍其在癌症-神经相互作用研究中的应用。
本方案提供了一种高效的流程，用于背根神经节（DRG）的解剖、提取，并将具有活性的DRG与癌细胞进行共培养，同时保持DRG结构完整性，并最大化DRG来源细胞的存活率（图1）。然而，由于在初始解剖步骤中可能携带毛发残留，DRG培养物容易受到污染，从而影响长期培养的成功率，因此防止污染的策略至关重要。在完成初始切口后、尚未直接接触DRG前，更...

本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。

神经系统对肿瘤微环境的贡献以及神经侵袭作为癌症扩散途径的重要性正在被……

我们的研究聚焦于癌症与神经之间的相互作用，利用三维背根神经节（DRG）外植体和二维解离培养体系，定量分析神经引导的肿瘤迁移，并测试限制二者相互作用的分子策略。通过本方案，我们建立了源自同一只小鼠的互补性三维和二维DRG培养模型，优化了神经突的生长，并证实癌细胞沿神经突延伸方向的侵袭能力增强。针对现有模型在重现复杂细胞水平相互作用及完整神经结构方面存在的不足，我们通过构建互补的二维与三维DRG培养体系予以解决。本方案可从单只小鼠获得配对的三维组织块和二维神经元培养物，保留了组织的角向结构特征，支持高通量成像，减少了动物使用量，并使我们在一次实验中同时获取组织水平和单细胞水平的数据。本模型提出了若干待解问题：背根神经节（DRG）分泌的哪些因子驱动了肿瘤侵袭？神经元活动、年龄和基因型如何影响这一过程？靶向神经营养因子受体是否能够抑制神经突导向的癌症扩散？实验开始时，将已处死的小鼠俯卧放置。剃除毛发，重点剃除脊柱区域的毛发以暴露背部表面。用70%乙醇喷洒动物背部。使用纸巾从尾部向头骨方向擦拭，以去除松散的毛发，并防止解剖过程中污染。使用一把灭菌的剪刀，从尾部沿背侧中线向颅骨方向做一条直线切口。用钝头镊子将切口两侧的皮肤向两边拉开，暴露脊柱。现在更换一把新的剪刀和镊子，以避免污染，并在脊柱的尾端做一条横向切口。然后在脊柱两侧各做一条平行的纵向切口，以释放脊柱。用镊子轻轻提起脊柱，并去除周围的结缔组织。为完全游离脊柱，需在靠近颅骨的脊柱顶端做一切口。将脊柱转移至预冷的含有青霉素-链霉素的10厘米HBSS培养皿中，置于冰上。接着使用弹簧剪去除脊柱上残留的结缔组织，暴露椎骨。将修整后的脊柱转移至显微镜载物台上。使用弹簧剪沿矢状面小心地切开脊柱。用尖头镊子将脊髓从脊柱中取出，以暴露脊神经根部的背根神经节。使用弹簧剪剪断脊神经。然后去除背根神经节周围的结缔组织。使用尖头镊子，从背根中轻轻取出背根神经节。进行整体培养时，将背根神经节放入含有青霉素-链霉素的HBSS的3厘米培养皿中，并置于冰上保存。将八孔玻璃底培养板置于冰上的10厘米培养皿中，使用预冷的移液器吸头向每个孔中加入2 µL预冷的Matrigel。为防止过早聚合，每次仅移取一滴。接着，用细头镊子将一个背根神经节放置于干燥的培养板上。轻轻涡旋以去除多余的HBSS。然后将洁净的背根神经节转移至Matrigel液滴中。待所有神经节转移至液滴后，将玻璃底培养皿置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育5分钟，使Matrigel聚合。接下来，向每个孔中小心加入 200 µL 温热的完全培养基。将玻片置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育。每天使用明场显微镜观察背根神经节的神经突生长情况和细胞活力。将含有汇集的背根神经节的15毫升锥形管在室温下以200G离心5分钟。用移液管吸出HBSS后，用预热的完全培养基冲洗神经节，并轻轻敲击。然后在200G下再次离心5分钟，以沉淀背根神经节（DRGs）。加入一毫升木瓜蛋白酶溶液以替换原有培养基。轻轻混匀后，在37摄氏度的组织培养孵箱中孵育20分钟，每5分钟轻轻振荡一次。随后，加入10毫升添加了补充物的培养基以中和木瓜蛋白酶，并轻轻混匀。在400 × g条件下离心5分钟，使背根神经节沉淀。用移液器吸出上清液后，加入1毫升IV型胶原酶与Dispase II混合溶液，再次孵育。加入4.5毫升含补充物的培养基以中和酶溶液，轻轻混匀后离心。吸出上清液后，加入5毫升添加了补加物的培养基。然后加入DNase I，使其终浓度达到0.2毫克/毫升。此时背根神经节应呈现为松散的团块状，表明消化已完全。进行机械解离时，使用1,000微升带滤膜的移液枪头，通过上下吹打4至5次来重悬神经节溶液。更换为200微升移液枪头，再次上下吹打4至5次进行重悬。将所得的浑浊悬液经70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。然后用10毫升培养基逐渐冲洗滤网，以确保细胞完全转移。将过滤后的细胞悬液在1,000×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除沉淀中的培养基，并将细胞沉淀重悬于500微升含补充物的培养基中。移除八孔玻璃底培养板各孔中残留的 PBS。将解离后的背根神经节悬液加入胶原包被的孔中，进行孵育。每日使用明场显微镜观察背根神经节来源的细胞，评估细胞活力及神经元突起生长情况。若需将完整的小鼠神经节与癌细胞共培养，首先吸除八孔玻璃底培养板上全 mount DRG 培养物中的培养基。使用移液器，将 200 µL 癌细胞悬液轻柔地加入含有 Matrigel 滴和背根神经节的孔中。将共培养载玻片置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中孵育。每天更换培养基：用 200 µL 预热的完全培养基洗涤一次，然后加入 300 µL 新鲜培养基。对于解离神经节与癌细胞的共培养，从八孔玻璃底培养板中吸除解离背根神经节（DRG）培养物的培养基。然后在孵育前，轻轻将200微升癌细胞悬液分配至每个孔中。在缺乏补充因子的情况下，DRG的建立效率较低，且神经突的延伸显著减少。来自较年长动物的完整脊神经节（DRG）样本产生的神经突延伸较少且更为清晰，胶质细胞极少，有利于观察神经癌细胞的相互作用。采用两步酶解法解离DRG神经元可获得更高的神经元回收率。培养24小时内，雪旺细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等非神经元细胞变得明显，而源自DRG细胞的神经突在72小时后进一步增多。在Matrigel包被的Transwell小室中接种的癌细胞在孵育24小时后向HEC293细胞侵袭，但不向DRG神经元侵袭。将整体DRG培养物浸入Matrigel液滴中，可使神经突向外通过基质延伸至周边区域。通过将DRG精确置于液滴中央位置，可在不超出边界的情况下实现最大程度的神经突延伸。癌细胞在与含有背根神经节（DRG）的Matrigel滴共培养12小时后趋于稳定。共培养72小时后，癌细胞已侵入Matrigel并朝向神经节迁移，观察到背根神经节细胞突起与癌细胞之间的直接相互作用。将解离的DRG来源细胞与癌细胞共培养，可实现对单个细胞间相互作用的详细可视化观察。

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