Name: 使用光谱共聚焦显微镜进行高重成像，以最大限度地减少非特异性组织荧光 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解IBEX高重成像工作流程，结合肝素阻断与光谱检测技术，有效抑制嗜酸性粒细胞丰富人体组织中的自发荧光和非特异性结合，实现清晰的空间蛋白质组学分析。

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我们感谢Andrea Radtke博士和Ziv Yaniv博士在IBEX平台的引入和迭代过程中提供的支持。感谢João Bronze de Firmino博士和Mouhanad Babi博士在显微镜使用和故障排查方面的协助，以及麦克马斯特大学先进光学显微中心提供显微镜设备的使用权限。感谢Tina Walker、Jianping Wen和Rangana Talpe Guruge提供的技术支持。本研究得到了由加拿大卫生研究院感染与免疫研究所（CIHR-III）、加拿大卫生研究院循环与呼吸健康研究所（CIHR-ICRH）以及加拿大过敏、哮喘与免疫学基金会（CAAIF）联合资助的经同行评审的食品过敏研究基金的支持。本研究还获得了加拿大卫生研究院（PJT-198169；JFEK）、J.P. Bickell基金会医学研究基金（JFEK）、加拿大过敏、哮喘与免疫学基金会（JFEK、MJ）、加拿大过敏与临床免疫学会（VO、MJ）、Schroeder基金会（JFEK、SW、MJ）、Food Allergy Canada（JFEK、SW、MJ）、ALK Abello A/S公司（JFEK、MJ）、Zych家族（SW、MJ）、Buckrell家族（JFEK）、安大略省研究生奖学金（SD）以及麦克马斯特大学健康科学学士项目（VO）的资助。

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<li>Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+immunofluorescence+detection+limits+in+whole+paraffin-embedded+formalin+fixed+tissues+using+hyperspectral+confocal+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging.</a> J Microscopy. 234 (2), (2009).</li>
<li>Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmixing+for+ultra-high-plex+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging.</a> Nat Comm. 13 (1), (2022).</li>
<li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Cytometry.</a> Cyt Part A. 91 (2), (2017).</li>
<li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nat Med. 20 (4), (2014).</li>
<li>Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+Imaging+for+the+Study+of+Human+Diseases%E2%80%94Applications+and+Data+Analysis+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies.</a> Front Immunol. 10, (2019).</li>
<li>Goltsev, Y., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging.</a> Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).</li>
<li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nat Protoc. 16 (8), (2021).</li>
<li>Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Spectral+Imaging+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Spectral Imaging Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2635, (2023).</li>
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</ol>

JFEK 和 MJ 收到来自 ALK Abello A/S 的资助。JFEK 收到来自 Merida Biosciences 的咨询费。

Spectral IBEX 是 IBEX 方案的一种改进，成功解决了免疫荧光成像中的两个关键问题：非特异性结合和自发荧光。通过对嗜酸性极强的组织使用肝素处理，并结合光谱解混技术以消除自发荧光及通道间的光谱重叠，显著提高了真实信号相对于背景的检出率。单次扫描即可捕获所有标记物，缩短了采集时间，可能提高 IBEX 循环的速率。尽管在缺乏光谱检测器的情况下可采用传统共聚焦采集结合计算解混方法，但仍推荐使用全光谱检测，因其可最大化灵敏度、几乎完全消除串色，并将每轮成像时间缩短一半。本文提供了 Spectral IBEX 的详细实验方案，包含建议、注意事项及相关数据，以支持在多种研究环境中实施各类 IBEX 模式。
组织自发荧光是荧光成像的主要限制因素。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）等固定和包埋方法会显著增强组织的自发荧光，从而限制了任何荧光成像技术在大量以FFPE组织块形式长期保存的临床样本中的应用37。此外，某些组织本身具有极强的自发荧光（如肝脏、脾脏、鼻息肉等），使用传统显微镜方法无法将真实信号与背景自发荧光区分开来，导致发射波长范围相...

组织由多种具有特定功能的细胞组成，这些细胞有序地形成三维结构，并通过相互作用协调维持生命所必需的生物学过程。当细胞组成或组织结构受到破坏，干扰了这些相互作用并损害组织稳态时，便会导致病理状态的发生1。要理解人类健康与疾病背后的生物学机制，必须了解众多特化细胞类型在组织内的定位方式及其相互作用规律。
在转录组、表观基因组和蛋白质组水平上，单细胞分析技术的进步揭示了高度多样化的特化细胞类型。2,3 单细胞RNA测序和光谱流式细胞术等技术能够检测用于表征这些异质性细胞群体所需的大量参数。然而，这些方法缺乏空间信息，因为细胞必须从其原始组织环境中解离成单细胞悬液4,5。因此，尽管已鉴定出与多种疾病状态相关的细胞类型，但它们在组织内的相互作用及其在疾病持续发展中的作用仍不明确。
为解决其中一些局限性，已开发出多种空间组学技术，可在捕获组织内细胞异质性的同时，保留每个细胞的空间位置信息6。例如，基因转录可通过在组织切片上以光栅化点阵形式扩增RNA（如Visium）来检测，或通过使用靶向特定基因组合的RNA杂交探针，并在单细胞分辨率下成像（如Xenium）来实现7,8。这些方法在追踪组织内的转录模式和调控机制方面具有较好效果。然而，转录谱通常与蛋白质表达的相关性较差，而蛋白质表达更能直接反映细胞的功能能力9。蛋白质表达可通过与荧光染料偶联的特异性抗体进行识别，并利用荧光显微镜检测10,11。传统荧光显微镜最多可实现六种以上此类抗体-荧光染料偶联物的独立成像。然而，这些荧光染料的激发和发射光谱存在重叠，导致难以确定任一成像通道中荧光信号的确切来源12。
迭代漂白扩展多重性（Iterative Bleaching Extends multipleXity，IBEX）是一种高通量成像方法，旨在克服荧光显微镜的这一局限性13,14,15。IBEX 使用硼氢化锂（LiBH4）在成像后化学失活荧光染料，从而使同一组织样本可在重新成像前再次使用偶联荧光染料的抗体进行染色。IBEX 能够保持组织完整性，允许多轮成像，理论上可在同一组织切片上可视化无限数量的标记物。通过对获取的图像进行计算对齐，可在单细胞分辨率下实现组学水平的表征，同时保留空间信息以揭示细胞微环境。这些数据还可提示潜在的细胞间相互作用，但需通过其他技术手段加以验证16。IBEX 是一种开源方法，兼容市售的荧光染料，并得到一个国际研究者社区的支持，该社区已验证相关试剂并公开共享数据，以促进方法的可及性、快速推广和高质量数据的生成17,18。
在本研究中，我们设计了一种改进的IBEX方案，旨在克服该技术的两个主要挑战：组织自发荧光和荧光素偶联抗体探针的非特异性结合（统称为背景信号）。当组织内源性荧光分子在激发后发射的光与抗体偶联荧光素所产生的目标信号发生重叠时，即产生自发荧光19,20。荧光素偶联抗体的脱靶或非特异性结合会导致不表达目标蛋白的细胞或结构产生荧光信号21,22。这些假象可能导致错误地判断某细胞表达了某种标志物，而实际上并未表达，从而干扰计算分析和细胞类型鉴定的准确性。通过结合基于肝素的电荷中和脱靶信号方法、全光谱采集以及计算解混，光谱IBEX显著减少了信号串扰，提高了信噪比（SBR），并将每轮成像时间缩短了一半。

<table><tbody><tr><td>2N 硫酸（H2SO4）溶液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>500 mL 烧杯</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>Bcl-6 - Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>561525</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>台式解剖显微镜</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD11c - Alexa Fluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>561352</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD138/Syndecan-1 - PE</td><td>BioLegend</td><td>356503</td><td>稀释倍数 1:200</td></tr><tr><td>CD20 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53020282</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD21 - Alexa Fluor 532</td><td>NovusBio</td><td>NBP2-60733AF532</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD23 - PE</td><td>BioLegend</td><td>338507</td><td>稀释倍数 1:200</td></tr><tr><td>CD3 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>100320C0</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD31 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303134</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD34 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>103400C0</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD38 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303523</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD4 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>300520</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD45 - Alexa Fluor 532</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>58045942</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>353113</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>铬矾-明胶粘合剂</td><td>Newcomer Supply</td><td>1033A</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具（Cryomold）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC9511236</td><td>较大样本亦可使用货号 50-465-347</td></tr><tr><td>DAPI 校准玻片</td><td>Agar Scientific</td><td>AG2273</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液，1 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>稀释倍数 1:3000</td></tr><tr><td>E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>147307</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594</td><td>BioLegend</td><td>324228</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>Eppendorf 管或 Falcon 管</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>FoxP3 - eFluor 660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50577382</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>磨砂端显微镜载玻片</td><td>ChemScience</td><td>GEW45-2575-W</td><td></td></tr><tr><td>GL7 - Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53590282</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>10KU</td></tr><tr><td>HLA-DR - PE</td><td>NovusBio</td><td>NB100-77855PE</td><td>稀释倍数 1:200</td></tr><tr><td>人源 TruStain FcX（Fc 受体阻断液）</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>湿盒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>带盖冰桶</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>IgD - Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>348215</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>IL4Ra/CD124 - PE</td><td>BioLegend</td><td>144803</td><td>稀释倍数 1:200</td></tr><tr><td>Imaris 文件转换器</td><td>OXFORD instruments</td><td>N/A</td><td>将任意图像文件格式转换为 .ims 格式（https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter）</td></tr><tr><td>异戊烷（2-甲基丁烷）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>Ki-67 - Alexa Fluor 488</td><td>BD Biosciences</td><td>558616</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 细致任务擦拭纸，单层</td><td>Kimtech Science</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>大型（例如 25 cm 长）镊子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>液氮</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>硼氢化锂（LiBH4）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>222356</td><td></td></tr><tr><td>MECA-79 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53603680</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>显微镜载玻片盖玻片 No.1 22x50 mm</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>超纯水（Milli-Q 水）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>MUC2 - Alexa Fluor 488</td><td>NovusBio</td><td>NB120-11197AF488</td><td>稀释倍数 1:100</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 带孔盖玻片培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>疏水笔（PAP pen）</td><td>abcam</td><td>AB2601</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）溶液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验室现有或常用者均可</td></tr><tr><td>SimpleITK Imaris 扩展插件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于对齐不同轮次图像的软件（https://github.com/niaid/imaris_extensions）</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980</td><td>ZEISS Microscopy</td><td>N/A</td><td>本研究中使用的成像系统</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>ZEISS Microscopy</td><td>N/A</td><td>用于图像采集后处理的软件</td></tr></tbody></table>

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

High-plex Imaging using Spectral Confocal Microscopy to Minimize Non-specific Tissue Fluorescence

高度多重成像技术能够在原生组织环境中研究功能多样的细胞及其微环境。迭代漂白扩展多重性（Iterative Bleaching Extends Multiplexity, IBEX）是一种循环免疫标记与荧光团失活技术，可在同一组织切片上实现多个标志物的可视化。所获取的图像可进一步分析，以获得单细胞数据，用于定义细胞簇、其空间定位及邻近的细胞类型。对这些数据的解读依赖于区分真实标志物表达与荧光显微镜固有背景信号的能力。光谱IBEX（Spectral IBEX）是IBEX方案的一种改进，结合了光谱共聚焦检测与计算解混技术，并引入肝素阻断以减少基于电荷的非靶向结合。该组合可提高信噪比，抑制组织自发荧光，降低串色干扰，同时相较于传统的多通道共聚焦成像缩短了采集时间。在人鼻息肉组织（一种以高嗜酸性粒细胞含量和强自发荧光为特征的模型）中的应用表明，在六轮成像中可稳定检测26个标志物，涵盖结构、免疫及细胞状态等多个层面。该工作流程生成高维度、空间分辨的蛋白质组学信息，能够捕捉复杂的组织结构和细胞微环境。综上，这一优化策略为多重成像提供了一种稳健且广泛适用的方法，特别适用于自发荧光和非特异性染色限制传统方法应用的组织样本。

免疫荧光成像技术面临的两个基本挑战是荧光素偶联抗体探针的非特异性结合以及组织自发荧光。本方案旨在帮助区分真实信号与背景信号，以优化多重免疫荧光技术。
肝素封闭可减少非特异性荧光团结合，同时保留信号
粒细胞因其高强度的非靶向荧光而臭名昭著，这种荧光并不符合标记物预期的形态学分布26,27。例如，在慢性鼻窦炎患者的鼻息肉组织中，使用膜淋巴细胞标记物CD3、CD4和CD20进行染色后，所有检测通道均显示出强烈的信号，并呈现出意料之外的颗粒状形态（图1A，黄色箭头）。鼻息肉组织富含嗜酸性粒细胞，这些荧光细胞中典型的双叶核结构表明嗜酸...

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。

高度多重成像技术能够在天然组织环境中研究功能多样化的细胞及其生态位。迭代漂白……

我们优化了一种IBEX工作流程，该流程结合肝素封闭与光谱检测，以抑制富含嗜酸性粒细胞的人体组织中的背景信号。自发荧光和嗜酸性粒细胞颗粒结合会掩盖真实信号。我们同时针对这两方面进行处理，以实现清晰的高重标记成像。首先，使用防蜡笔（pap pen）在载玻片上围绕固定好的组织画一个圆，以形成疏水屏障。向每份组织中加入约 100 µL 的 PBS，使其重新水化，并在室温下孵育约 2 分钟，以洗去包埋用的最佳切割温度化合物（optimal cutting temperature compound）。使用吸液玻璃巴斯德吸管从组织周围吸除 PBS。然后向每份组织中加入 100 µL 封闭缓冲液，在湿盒中室温孵育 1 小时。现在用移液器吸除封闭缓冲液。向每份组织中加入 100 µL 染色混合液，将玻片置于加盖的湿盒中，在 4 °C 冰箱内过夜孵育。同样，制备仅用一种荧光染料染色的切片以及未加任何染料的阴性对照，以确定荧光染料的光谱和组织自发荧光。吸除染色液后，用 PBS 洗涤组织三次，每次洗涤后均吸除液体。将样本置于显微镜载物台上进行成像。使用明场或微分干涉差（DIC）模式对样品进行聚焦。然后切换至荧光模式，并根据实验需求设置光谱采集参数。为实验中使用的荧光染料选择合适的激光器。选择与所选激光谱线相对应的分光器。启用所有探测器以捕获完整的发射光谱，并将图像采集分辨率调整为预设分辨率之一，或选择最高分辨率。将针孔大小调整为一个面积单位，以获得最佳的光学切片效果。在采集前优化激光设置。使用一张经所有标记物染色的切片，以低激光功率开始连续扫描模式。调节每个检测器的主增益以及激光强度，直至所有标记物均能以良好的信号与背景比被识别。精细调整激光强度，并在单染和多染切片之间反复交替优化，直至所有荧光信号均可见且无过饱和现象。在采集软件中启用拼图功能，并围绕组织定义拼图采集区域，以确保完整的图像覆盖。在组织中心区域优化切片采集区域的焦距。识别一个独特的结构特征，例如一组排列清晰可辨的细胞，作为后续成像轮次中对齐的参考依据。现在启用Z轴层叠成像（Z-stack）功能，并切换到Z轴层叠成像选项卡。在中心选项卡下，将切片数量设置为至少六个，切片之间的间隔不少于一微米。单击中心按钮，将上一步确定的当前焦点位置设为图像堆栈的中间切片。单击开始实验按钮以启动图像采集。采集完成后，右键单击图像缩略图，选择“另存为”，选择文件保存位置并命名图像。将图像数据备份至安全存储设备中。使用在拼接区域采集期间所应用的相同优化设置对图像进行解混。拍摄每份单染对照样本的图像，以获取真实的信号光谱，同时拍摄未染色对照样本的图像，以获取背景信号或自发荧光。仅将这些图像用于光谱拆分。通过检查未染色对照中信号强度和形态是否缺失或与背景水平相当，并确认标记物的定位符合其预期的细胞分布模式（如膜定位、核定位、胞质定位或分泌性分布），来验证所选区域代表真实的信号。在软件中打开快照图像。点击解混选项卡，选择解混工具选项卡下的其中一个区域选择工具，在阳性信号周围绘制感兴趣区域（ROI），以生成该区域的光谱。将每个生成的光谱与相应荧光染料的理论发射光谱进行比较。确保该区域准确代表真实信号。根据荧光染料的种类为每个光谱命名，并将其保存至光谱数据库中。接下来，加载拼接图像并打开光谱分离工具。使用加号按钮将每种荧光染料的参考光谱添加到解混列表中。点击线性解混按钮以分离光谱信号，并保存解混后的图像。在通风橱中配制漂白溶液。使用微型刮勺，将10毫克硼氢化锂直接称量至一个干燥的烧杯中。小心加入10毫升超纯水至烧杯中，并搅拌至化合物完全溶解。使用玻璃巴斯德移液管，向每个组织切片中加入约100微升新配制的漂白溶液，然后将载玻片置于通风橱内室温下孵育15分钟。如果溴化溴化吡啶染料发生漂白，请小心将玻片转移至落射荧光显微镜，并选择dappy滤光片。对样本进行调焦，并以全功率照射。现在使用5倍物镜以获得更大的照明视野，并将载物台完全降低，以防止玻片与物镜或镜筒之间发生任何接触。最后，使用玻璃巴斯德移液管将每个孔中的硼氢化锂溶液倾倒出来，并倒回原始的漂白溶液烧杯中。用稀释缓冲液洗涤载玻片三次，每次洗涤孵育约三分钟。加入抗体混合液，并按照之前所示方法对样本进行染色。未经处理的鼻息肉组织经CD3、CD4和CD20染色后，在嗜酸性粒细胞富集区域显示出强烈的非特异性颗粒状荧光，而真实的膜定位信号则以较低强度存在。使用5%脱脂牛奶预处理未能完全阻断非特异性荧光，同时也降低了AF 532等荧光染料的信号强度。使用Dab预处理可降低CD20、CD3和CD4的非特异性荧光，但同时也降低了包括DAPI和AF 532在内的多个通道的真实信号强度。肝素预处理能有效阻断非特异性结合，同时保持CD3、CD4、CD20和DAPI的高信号强度。肝素以浓度依赖的方式阻断非特异性信号，在10单位时达到完全抑制，且在更高浓度下未观察到不利影响。三通道成像设置缩短了采集时间，但引入了串扰，包括AF 594渗漏至PE通道，以及由于多次激光激发导致的组织自发荧光增强。光谱成像几乎消除了所有背景信号和串扰，同时减少了采集时间并提高了信噪比。对一个人类鼻息肉进行光谱IBEX成像，揭示了由EpCAM标记的上皮结构。CD3阳性与CD20阳性的淋巴细胞等免疫细胞，以及表达CD31和CD34的血管。肝素处理消除了颗粒结合，同时不降低信号强度，可在IBEX循环中持续保持强烈的背景抑制。光谱解混可最大限度减少信号串扰，降低自发荧光，提高信噪比，并显著加快多色面板的采集速度，相较于多通道共聚焦成像具有明显优势。这能够实现强大的空间蛋白质组学分析，并支持对具有挑战性的组织进行精确的细胞状态定位和邻近水平分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用光谱共聚焦显微镜进行高重成像，以最大限度地减少非特异性组织荧光

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