使用光谱共聚焦显微镜进行高重成像，以最大限度地减少非特异性组织荧光

我们优化了IBEX工作流程，结合肝素阻断和光谱检测，抑制嗜酸性粒细胞丰富的人体组织中的背景。自体荧光和嗜酸性粒细胞颗粒结合遮蔽了真实信号。我们以两者为目标，以实现干净的高plex映射。

首先，用抹片在玻璃玻片上画一个圆圈，围绕已固定的组织形成疏水屏障。向每组组织加入约100微升PBS以使其重新水合，并在室温下孵育载片约两分钟，以冲洗出最佳切割温度的化合物。用吸附式玻璃巴斯德移液器从组织周围抽取PBS。

然后向每个组织加入100微升阻断缓冲液，并在室温湿度舱中孵育一小时。现在用移液器抽吸阻断缓冲液。在每张纸纸中加入100微升染色剂，并将载玻片置于冰箱内有盖湿度舱中，以4摄氏度孵育一夜。

同样，准备仅用一个荧光团染色的切片，并用一个阴性对照组，不加染色，以定义荧光团光谱和组织自发荧光。吸取染色混合物后，用PBS洗三次组织，每次洗完后吸入该液体。将样品安装在显微镜上进行成像。

使用明场或微分干涉对比模式聚焦样品。然后切换到荧光模式，并根据实验需求配置光谱采集参数。为实验中使用的荧光团分配合适的激光器。

选择与所选激光线对应的分束器。启用所有探测器捕获完整的发射光谱，并将图像采集分辨率调整至预定义的某个分辨率。或者选择最大分辨率。

将针孔尺寸调整为一个面积单位，以实现最佳光学截面。采集前先优化激光设置。使用涂满所有标记的切片，开始低激光功率的连续扫描模式。

调整每个探测器的主增益和激光强度，直到所有标记都能以良好的信背景比识别。微调激光强度，并在单染色和多染色部分之间反复交替，直到所有荧光团信号都可见且无过饱和。在采集软件中启用图块功能，并定义组织周围的图块采集区域，以确保图像覆盖。

优化组织中心的瓦片采集区域的焦点。识别独特的结构特征，如一组细胞以可识别的排列方式，作为后续成像对齐的参考。现在启用Z堆栈功能，并导航到Z堆栈标签页。

在中心标签下，将切片数设为至少六个，切片间隔不少于一微米。点击中心按钮，将上一步确定的当前焦点设置为堆栈的中间切片。点击开始实验按钮启动图像采集。

拍摄完成后，右键点击图片缩略图，选择“另存为”。选择文件位置并命名图片。将图像数据备份到安全存储。使用平铺区域采集时相同的优化设置进行图像反混合。

从每个单染色对照组捕捉快照以获得真实信号谱，从未染色对照组捕捉背景或自发荧光。这些图像专门用于光谱解混。通过检查未染色对照中强度和形态是否缺失或等同于背景水平，以及标记定位是否符合其预期的细胞模式（如膜、核、细胞质或分泌分布）来确认所选区域是否代表真实信号。

在软件中打开快照。点击“unmixing”标签，在“unmixing tools”标签下选择一个区域选择工具，围绕正信号绘制感兴趣区域或ROI，生成该区域的频谱。将每个生成的光谱与相应荧光团的理论发射光谱进行比较。

确保该区域准确代表真实信号。根据荧光团的身份为每个光谱命名，并保存到光谱数据库中。接着，加载铺砌图像并打开解混工具。

使用加号键将每个荧光团的参考光谱添加到除混合列表中。点击线性解混按钮，分离频谱信号并保存未混入的图像。在排气柜中准备漂白剂。

用微型刮刀将10毫克硼氢化锂直接倒入干烧杯中。小心地向烧杯中加入10毫升超纯水，搅拌直到化合物完全溶解。使用玻璃巴斯德移液器向每个组织切片加入约100微升新鲜制备的漂白液，并在室温下在排气柜内培养15分钟。

如果漂白的明亮紫消亡，请小心将载玻片转移到落射荧光显微镜，选择“斑驳滤镜”。聚焦样品并以最大功率照射。现在使用5倍物镜以获得更大的照明场，并完全降低舞台，以防止滑套与物镜或外壳接触。

最后，用玻璃巴斯德移液器将硼氢化锂溶液从每个井中倒出，然后返回原来的漂白溶液烧杯。用稀释缓冲液洗三次载玻片，每次洗涤时孵育约三分钟。加入抗体混合物，并按照之前演示的做法染色样本。

在未处理的鼻息肉组织中，CD3、CD4和CD20染色在嗜酸性粒细胞丰富区域表现出强烈的非特异性颗粒荧光。而真正的膜定位信号则存在较低强度。用5%脱脂牛奶预处理未能完全阻断非特异性荧光，也降低了荧光团如AF 532的信号强度。

Dab预处理减少了CD20、CD3和CD4的非特异性荧光，但也降低了包括DAPI和AF 532在内多个通道的真实信号强度。肝素预处理有效阻断非特异性结合，同时保持CD3、CD4、CD20和DAPI的高信号强度。肝素以浓度依赖性方式阻断非特异性信号，10单位时实现完全抑制，且在高浓度下未观察到有害影响。

三轨成像装置缩短了采集时间，但引入了串扰，包括AF 594透入PE通道，并因多激光激发增强组织自发荧光。光谱成像几乎消除了所有背景和串扰，同时缩短了采集时间并改善了信号与背景比。对人类鼻息肉的光谱IBEX成像显示了由EpCAM标记的上皮结构。

免疫细胞如CD3阳性和CD20阳性淋巴细胞，以及表达CD31和CD34的血管。肝素处理消除颗粒结合而不降低信号，维持IBEX周期内强烈的背景抑制。光谱解混可减少透光，自发荧光则提升背景信号，显著加快多面板采集速度，相较多轨共焦点更快。

这使得强大的空间蛋白质组学和具有挑战性的组织得以支持准确的细胞状态映射和邻域层面分析。