Name: 用于药物筛选的三维脑肿瘤球体代谢分析的进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-05T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解利用Seahorse技术对三维胶质瘤球状体进行代谢分析的方法，以评估药物反应并揭示肿瘤耐药机制。该平台为癌症研究提供了强有力的工具，有助于开发更有效的治疗策略。

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本研究由国家自然科学基金资助，项目编号为82471329和82001248。

注意：所有试剂和耗材的完整规格详见材料表。
1. 二维细胞培养
<ol>
	<li>在无菌条件下，将U87细胞培养于添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）中。当细胞融合度达到80%时，进行常规传代操作。 
	注意：在整个培养过程中，需密切监测细胞状态，凡出现异常生长或形态学改变的细胞，均应排除于后续实验之外。</li>
	<li>将U87细胞接种至10 cm细胞培养皿中，置于37 °C、含5%（v/v）CO2及90–95%相对湿度的无菌细胞培养箱中孵育。 
	注意：应定期更换培养基，以维持最佳生长条件。</li>
</ol>
2. 三维细胞球体的形成
<ol>
	<li>实验准备
	<ol>
		<li>在开始实验操作前，先查阅 图1 中的完整实验流程。 
		注意：整个实验过程中必须严格遵守无菌操作技术，以确保细胞健康并防止污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞消化与计数
	<ol>
		<li>从细胞培养皿中移除用过的培养基，并用9 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗U87细胞三次（每次3 mL）。将使用过的试剂弃置于20–25%（v/v）的次氯酸钠溶液中，以灭活所有生物活性物质。</li>
		<li>向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶溶液，在37 °C下孵育2–3分钟。在显微镜下观察到所有细胞脱落后，加入2 mL预热至37 °C、含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基以中和胰蛋白酶。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在200 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL含10% FBS的DMEM培养基中。轻柔吹打混匀，确保形成均匀的细胞悬液。随后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行计数，并记录初始细胞数量。 
		注意：在洗涤和添加培养基过程中应轻柔操作细胞，避免机械损伤。可通过控制吹打力度防止气泡产生，以免影响细胞活力和计数准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞悬液稀释
	<ol>
		<li>将未使用的培养基预热至37 °C。将细胞悬液在室温（RT；25 ± 2 °C）下静置30分钟。</li>
		<li>根据初始细胞计数结果，用含10% FBS的DMEM将细胞悬液稀释至终体积20 mL，确保细胞总数约为200,000个。 
		注意：在最终稀释前，应轻柔吹打细胞悬液以防止细胞沉降。未使用的培养基保持在37 °C，细胞悬液则在室温下孵育。若需接种96孔板，每孔1,500个细胞，则应准备22 mL总体积以预留损耗。稀释后的细胞悬液转移至50 mL无菌离心管中并充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超低吸附96孔板中接种细胞
	<ol>
		<li>使用200 µL移液器充分混匀最终细胞悬液。沿孔壁缓慢向透明圆底超低吸附96孔板的每孔加入200 µL悬液（每孔1,500个细胞）。 
		注意：为提高效率，建议使用多通道移液器。</li>
		<li>所有孔加样完成后，弃去剩余的细胞悬液，以防污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心
	<ol>
		<li>用封口膜严密封闭培养板，防止离心过程中发生泄漏。在200 × g 条件下离心2分钟，使细胞沉降至各孔底部形成细胞团。</li>
		<li>从离心机中取出培养板，小心移除封口膜，随后将培养板放入37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 代谢检测板的多聚-D-赖氨酸包被
注意：代谢分析微孔板是一种专门设计用于在细胞外通量分析期间促进细胞球状体黏附的特殊微孔板。
<ol>
	<li>将 5 mg 多聚-D-赖氨酸溶解于 50 mL 无菌水中，配制包被溶液。充分混匀。</li>
	<li>向代谢检测板的每孔中加入 30 µL 包被溶液。通过轻轻振荡或吸除多余液体，确保无气泡产生。</li>
	<li>将板在室温下孵育 20 分钟，并加盖。吸除包被溶液，再用 200 µL 无菌水洗涤各孔两次。</li>
	<li>将板在空气中干燥至少 30 分钟，然后在 37 °C 无 CO2 条件下加热 30 分钟，以稳定包被层。</li>
	<li>向每孔中加入 175 µL 预热的培养基，并将板置于 37 °C 无 CO2 培养箱中，直至准备进行细胞球体转移。</li>
</ol>
4. 监测类球体生长
<ol>
	<li>培养5天后，将球状体培养板转移至高内涵成像系统。</li>
	<li>配置成像参数：将温度设置为37 °C，CO2浓度设置为5%，并调整培养板类型、通道和焦距范围。</li>
	<li>使用配备10倍物镜和成像软件的共聚焦显微镜获取球状体图像。</li>
	<li>识别含有完整球状体的孔（例如图2A-C），记录其位置以备转移；排除含有不规则球状体的孔（例如图2D）。&#34;</li>
</ol>
5. 类球体处理
注意：对成熟的三维球状体进行药物处理，以评估其代谢反应。
<ol>
	<li>类球体分组
	<ol>
		<li>将完整的类球体分配至两个组： 
		对照组：6 个重复孔 
		处理组：6 个重复孔（非诺贝特处理）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物溶液配制
	<ol>
		<li>用新鲜预热的培养基配制非诺贝特工作液，浓度为最佳浓度（例如 100 µM）。 
		注：处理组先用 100% DMSO 重悬配制为储存液，随后用新鲜预热的培养基稀释。对照组给予与药物处理样本中相同的终浓度 DMSO（0.1% v/v）。终浓度通过剂量-反应实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换培养基
	<ol>
		<li>沿孔壁缓慢吸出每孔 100 µL 培养基。 
		注：避免接触孔底，以防扰动类球体。</li>
		<li>向对照孔中加入 100 µL 新鲜培养基。</li>
		<li>向处理孔中加入 100 µL 非诺贝特工作液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理后培养
	<ol>
		<li>将培养板轻轻放回 37 °C、5% CO2 培养箱中，继续培养 72 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>形态学评估
	<ol>
		<li>在完成第 4 步的成像程序后，评估类球体的完整性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞球体的转移
<ol>
	<li>小心地将含有球状体的低吸附培养板从成像系统中取出，并置于生物安全柜内的无菌表面上。将预先包被多聚赖氨酸的检测板并排放置，以便进行转移。</li>
	<li>剪切20 µL移液器吸头的尖端，以利于轻柔吸取细胞球状体而不造成损伤。</li>
	<li>从孔底轻柔地逐个吸取完整的球状体，并将其转移至细胞培养板的对应孔中，静置20秒使其沉降。在10×显微镜下观察，若无漂浮碎片，则确认球状体已成功贴附。</li>
	<li>对所有球状体重复上述操作，并通过步骤4中所述的成像系统验证转移效率。</li>
</ol>
7. 代谢检测
<ol>
	<li>样品脱气
	<ol>
		<li>将经药物处理的类球体检测板放入预平衡的 37 °C 水化室中，水化室中不含 CO2。 
		注意：在严格环境控制下持续脱气 1 小时，以确保代谢测量的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂制备与药物给药
	<ol>
		<li>在 1 小时脱气期间，同步进行试剂制备并加载药物。 
		注意：本实验的主要目标是评估线粒体应激；所有操作步骤必须严格围绕此目标进行。不同类型的实验必须遵循特定的实验方案，以确保数据的准确性和可靠性。</li>
		<li>药物制备：使用以下化合物： 
		寡霉素（线粒体复合物 V 抑制剂） 
		羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP，解偶联剂） 
		鱼藤酮（复合物 I 抑制剂）与抗霉素 A（复合物 III 抑制剂）的混合物 
		&#8203;注意：药物来源于本研究所使用的线粒体应激检测试剂盒。部分化合物具有生物危害性；必须严格遵守生物安全规程（包括个人防护装备和应急准备）。</li>
		<li>药物配制
		<ol>
			<li>按照表 1所示方法配制粉末药物的储备液。</li>
			<li>将储备液稀释至表 2中指定的工作浓度。 
			注意：溶液需充分涡旋或振荡，以确保浓度梯度的均匀性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将化合物加载至检测探针板 
	注意：检测探针板为一次性耗材，内含用于实时测量氧气和 pH 的生物传感器探针。
	<ol>
		<li>探针板活化（必须在加载化合物前完成）： 
		注意：为确保传感器活化，请至少在使用前 12 小时完成以下步骤：
		<ol>
			<li>向水化板的每个孔中加入 200 µL 校准液。</li>
			<li>小心地将检测探针板放置于水化板上，确保所有探针完全浸入校准液中。</li>
			<li>将组装好的装置置于 37 °C 无 CO2 的培养箱中孵育 12–24 小时，以活化传感器。 
			注意：探针未完全浸没或水化不足会导致测量漂移（OCR 误差 ±15%）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用多通道或电子移液器将精确体积的液体加入各孔，避免孔边缘残留液滴。 
		注意：由于无需急性药物刺激，应遵循标准加载顺序。</li>
		<li>加载完成后，将探针板放置于稳定表面上，防止运输过程中发生扰动。 
		注意：加载准确性对结果有显著影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软件配置
	<ol>
		<li>启动软件并选择线粒体应激测试检测方案。</li>
		<li>根据预设的实验分组进行分组设置。</li>
		<li>设置文件名并点击 开始运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测探针板的校准
	<ol>
		<li>根据系统提示，轻柔地将加载完成的探针板插入仪器插槽中。</li>
		<li>启动校准程序（15–20 分钟）。保持环境稳定，避免振动。</li>
		<li>校准完成后立即移除水化板（按照屏幕提示操作）。 
		注意：校准前需先移除板盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D 类球体的代谢谱分析
	<ol>
		<li>将脱气后的 3D 类球体检测板转移至仪器测量插槽。通过确认以下几点确保其与探针阵列精确对齐：（i）板角与插槽导轨匹配；（ii）A1 孔与定位位置对齐；（iii）板与仪器表面之间无可见间隙。</li>
		<li>点击 开始 以启动线粒体应激检测（持续时间约 1.5 小时）。全程监控仪器参数。 
		注意：测量前需移除 3D 类球体检测板的板盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>成像分析
		<ol>
			<li>将 3D 类球体检测板转移至高内涵成像系统。 
			注意：图像采集方法如步骤 4 所述。成像结果显示，大多数类球体保持完整，而少数在转移过程中受到损伤，如图 3所示。</li>
			<li>使用 Harmony 软件 5.2 版本，按照步骤 7.7.1.3–7.7.1.7 分析细胞类球体的形态学数据（如面积、长度、宽度）。</li>
			<li>应用纹理区域 模块，基于图像中物体的纹理特征将图像内容划分为三个聚类，粗略分离 3D 类球体与背景。</li>
			<li>应用查找图像区域模块，基于体积相关的尺寸特征进一步优化已初步分离的 3D 类球体，去除杂质并保留完整类球体。</li>
			<li>通过形态学特性模块测量 3D 类球体的形态学参数。</li>
			<li>应用选择群体 模块，最终筛选出真实的 3D 细胞类球体。</li>
			<li>导出形态学数据分析结果，如表 3所示。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>数据处理 
		注意：利用成像输出参数对细胞数据进行归一化处理，以最小化实验误差。
		<ol>
			<li>通过分析软件打开原始代谢数据。</li>
			<li>选择归一化选项，进入归一化模式编辑界面。</li>
			<li>在归一化值 字段中输入检测板中各对应孔所含类球体的横截面积。</li>
			<li>将比例因子参数设置为 1,000,000。</li>
			<li>点击应用 按钮完成归一化过程。最终结果如图 4所示。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 废物处理
<ol>
	<li>根据生物危害和实验室废弃物管理规程，处理所有实验废弃物（培养基、试剂、耗材和细胞悬液）。在处置前，应对生物活性废弃物进行高压灭菌或化学消毒，以防止环境污染。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将细胞外通量分析技术应用于三维胶质瘤模型，是肿瘤细胞代谢研究中一项关键的方法学进展。尽管传统的二维培养长期以来一直是该领域的研究基础， 体外 实验，但它们无法捕捉到典型的空间结构、细胞间和细胞-基质相互作用以及氧气和营养物质梯度 体内 肿瘤12这些特征在胶质瘤中尤为重要，因为代谢重编程在肿瘤进展和治疗耐药性中起着关键作用。13.
将细胞外通量分析应用于三维培养时，一个显著的挑战在于代谢参数的准确归一化。与二维单层培养相比，三维类球体在细胞数量、大小和形状方面具有更高的变异性，若不加以校正，可能在ECAR和OCR数据解读中引入显著误差14,15,16。为解决这一问题，在进行代谢检测之前，整合了高内涵成像技术以定量分析类球体的体积和形态。该步骤可基于实际的类球体生物量进行...

胶质瘤是一种常见且具有侵袭性的脑肿瘤，由于其进展迅速、肿瘤微环境高度异质以及对常规治疗表现出显著耐药性，给临床治疗带来重大挑战1这些复杂性要求采用更具生理相关性的实验模型，以提高治疗评估的准确性。传统的二维（2D）细胞培养系统无法模拟 体内 肿瘤结构与细胞间相互作用2，常常导致关于药物疗效和肿瘤生物学的误导性结论3.
为克服这些局限性，三维（3D）肿瘤模型应运而生，成为一种更优的替代方案，因其能够模拟肿瘤在体内的结构和功能特征，从而提供更高的生物学相关性in vivo4,5。与此同时，代谢重编程 increasingly 被认为是胶质瘤进展和治疗耐药的重要特征6,7,8。细胞外通量分析已成为一种广泛应用的技术，可用于实时测定关键代谢参数，例如细胞外酸化率（ECAR，主要反映糖酵解乳酸产生所导致的质子外排）和氧消耗率（OCR，用于量化氧化磷酸化过程中的线粒体耗氧量），从而为糖酵解和氧化磷酸化通路提供关键见解9,10,11。
在本研究中，采用细胞外通量分析技术来分析三维胶质瘤球体，从而能够在高度模拟生理环境的条件下研究其代谢通路 体内 肿瘤条件。将U87胶质瘤细胞以每孔1,500个细胞的密度接种于透明圆底超低吸附96孔板中，在37 °C、5% CO₂条件下培养5天。2 以促进球体形成。采用高内涵成像技术确认球体形态并评估细胞大小。在进行代谢分析之前，将直径约220 µm、致密且呈圆形的三维细胞球体转移至预先包被多聚-L-赖氨酸的检测板中，以确保细胞黏附和测量稳定性。重要的是，通过整合高内涵成像对球体大小进行标准化处理，从而降低数据变异，提高数据可靠性。
该整合平台结合了三维培养、细胞外通量分析技术以及基于成像的归一化方法，能够更准确地评估胶质瘤对治疗干预的代谢反应。本研究为探讨药物耐药性的代谢基础提供了可靠的框架，并有助于开发更有效且具有临床转化潜力的胶质瘤治疗策略。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>Harmony 5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Solarbio</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>MEM EBSS 培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>Operetta CLS</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>高内涵成像分析系统</td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D Lysine hydrobromide</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>圆底超低吸附 96 孔板</td><td>Corning</td><td>4515</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse Wave Desktop 软件</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96</td><td>Agilent</td><td></td><td>体外代谢检测仪</td></tr><tr><td>Sorvall ST8R</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>离心机</td></tr><tr><td>0.25% EDTA 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>U87MG 细胞系&amp;nbsp;</td><td>国家实验细胞资源共享平台</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF 1.0 M 葡萄糖溶液，50 mL</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>XF 100 mM 丙酮酸溶液，50 mL</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>XF 200 mM 谷氨酰胺溶液，50 mL</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>XF 校准液，500 mL&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XF 细胞线粒体应激检测试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>XF DMEM 培养基，pH 7.4，500 mL</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td></td></tr><tr><td>XFe96/XF Pro Fluxpak-检测探针阵列</td><td>Agilent</td><td>103792-100</td><td></td></tr><tr><td>XFe96/XF Pro Fluxpak-代谢检测试剂板</td><td>Agilent</td><td>103792-100</td><td></td></tr></tbody></table>

三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

Advancements in the Metabolic Profiling of Three-Dimensional Brain Tumor Spheroids for Drug Screening

脑肿瘤，尤其是胶质瘤，由于其侵袭性强、肿瘤微环境复杂以及对传统疗法具有耐药性，治疗难度较大。传统的二维（2D）细胞培养模型往往无法真实再现肿瘤微环境，导致对药物疗效的预测不准确。细胞外通量分析技术通常用于2D培养中的实时代谢分析，可测量细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）等关键代谢参数，从而揭示细胞代谢状态。三维（3D）模型的应用代表了重大进展，因其能更准确地模拟体内（in vivo）肿瘤环境。细胞外通量分析仪已被应用于三维（3D）胶质瘤细胞模型，能够在更接近生理条件的环境中分析糖酵解和氧化磷酸化等关键代谢通路。
将U87细胞以适当的密度接种于96孔低吸附培养板中，并培养5天。第5天时，通过高内涵成像观察三维球状体的形成情况。成功形成的球状体随后被转移至预先包被多聚-L-赖氨酸的代谢检测板中，用于代谢分析。为了提高测量的准确性，高内涵成像系统可评估三维细胞大小，从而实现对胞外通量数据的精确归一化，减少因细胞大小差异导致的代谢变异。该整合方法可更可靠地分析胶质瘤细胞对药物处理的代谢响应，揭示潜在的药物耐药机制。最终，该技术为理解胶质瘤的代谢动态提供了有价值的见解，并有助于开发新型且具有临床相关性的治疗策略。

三维细胞球体能量代谢检测过程中的三个最关键步骤是三维细胞球体的培养、球体转移过程，以及检测后球体的成像与定量分析图1）。此外，观察细胞球体的状态至关重要。当按照上述实验步骤进行实验时，可在第5天检测到球体th 天（图2），类球体生长至平均面积约为 50,000 µm²（表3）。如果希望延长细胞球体的培养时间，可延长至7-10天。由于代谢检测板底部面积有限，待检测的细胞球体不宜过大。在转移细胞球体的过程中，若未能准确、稳妥地捕获球体，可能导致球体丢失，从而影响实验结果。因此，实验结束后通过高内涵分析（high-content analysis）对细胞进行成像分析图3) 以校准细胞外通量测定，确保实验结果的可靠性（图4).
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本研究建立了一个代谢谱分析平台，该平台整合了三维（3D）胶质瘤类球体与基于细胞外通量分析的成像标准化方法。该方法可更准确地评估肿瘤对药物治疗的代谢反应，并有助于揭示潜在的耐药机制。

脑肿瘤，尤其是胶质瘤，由于其侵袭性强、肿瘤微环境复杂以及对治疗产生耐药性，治疗难度较大……

本研究旨在利用Seahorse技术优化用于研究能量代谢的三维细胞球体形成方法，重点关注细胞行为代谢活性及药物反应，建立具有临床相关性的模型。该研究成果将通过更准确地模拟脑肿瘤，改进药物筛选模型，提升治疗评估和代谢分析水平，从而优化治疗策略。研究结果为探索三维球状模型中能量代谢的变化机制、药物对代谢通路的影响，以及代谢改变如何导致肿瘤对治疗产生耐药性的机制奠定了基础。将收集的U87细胞在DMEM中重悬后，将未使用的培养基预热至37摄氏度。将细胞悬液在室温下维持30分钟。根据初始细胞计数，用含有10% FBS的DMEM稀释细胞悬液，最终体积为20毫升，确保细胞数量约为200,000个。通过反复倒置充分混匀最终的细胞悬液。将悬液沿每个孔的边缘缓慢加入透明圆底超低吸附96孔板中，每孔200 µL，然后用Parafilm密封板子以防止离心过程中泄漏。将密封后的板子放入离心机，以200 ×g离心2分钟，使细胞沉淀至各孔底部。从离心机中取出培养板。小心移除封口膜，将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。为制备包被液，将5毫克聚-D-赖氨酸溶解于50毫升无菌水中，并充分混匀直至完全溶解。向代谢检测板的每个孔中加入 30 µL 包被溶液。通过轻轻振荡平板或吸除多余溶液，确保无气泡产生。将平板盖好后于室温孵育 20 分钟，随后吸除包被溶液，并用 200 µL 无菌水洗涤孔板两次。将培养板风干至少30分钟，然后在37摄氏度、无二氧化碳条件下加热30分钟，以稳定包被。随后，向每孔加入175 µL预热的培养基。将培养板置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育，直至准备进行细胞球体转移。培养5天后，将球状体培养板转移至高内涵成像系统。设置成像参数时，将温度设为37摄氏度，二氧化碳浓度设为5%。在系统设置中调整培养板类型、通道和聚焦范围。随后，使用共聚焦显微镜配备10倍物镜及成像软件获取球状体图像，识别含有完整球状体的孔，并记录其位置以用于后续转移。将完整的球状体分为两组，对照组设六个复孔，非诺贝特处理组设六个复孔。用新鲜预热的培养基配制最佳浓度的非诺贝特工作液。小心地将含有球状体的低吸附培养板从成像系统中取出，置于生物安全柜内无菌表面上。将涂有聚-D-赖氨酸的检测板放置于其旁边以进行转移，然后剪切20微升移液器的吸头尖端，以便在不损伤细胞球体的情况下轻柔地吸取。使用剪切后的移液器吸头，从孔底轻柔地吸取每个完整的球体。将每个球体转移至包被板中对应的孔内，并静置20秒使其沉降。将3D球状体检测板转移至高内涵成像系统。为分析形态学数据，应用纹理区域模块，根据纹理特征将图像内容划分为三个聚类，从而粗略分离3D球状体与背景。接着应用图像区域识别模块，利用基于体积的大小特征进一步优化已初步分离的3D球状体，确保去除杂质并保留完整的球状体。使用形态学特性模块测量3D球状体的形态学参数。应用种群筛选模块过滤并保留真正的3D细胞球状体，然后导出形态学数据结果。在培养的第五天可明显观察到球状体形成，所有观察样本均保持一致的球形形态。在第5天还观察到球状体解体，结构完整性明显受损。移植后分析显示，大多数对照组和非诺贝特处理的3D球状体仍保持完整，但部分经非诺贝特处理的球状体出现解体。与对照组相比，非诺贝特处理的球状体在所有时间点的氧消耗率均显著降低。

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科研

JoVE Journal

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癌症研究

用于药物筛选的三维脑肿瘤球体代谢分析的进展

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

本文介绍了一种制备胰腺癌细胞与成纤维细胞三维（3D）球体共培养物的方法，随后利用细胞外通量分析仪测定其代谢功能。...

胰腺癌细胞与成纤维细胞三维球体共培养物的制备及代谢分析

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。...

用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

通过高分辨率共聚焦显微镜，表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在三维（3D）侵袭实验中对胶质瘤癌细胞迁移的抗迁移作用。...

通过高分辨率共聚焦显微镜表征抗转移抑制剂对三维肿瘤球体侵袭的影响

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。...

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

这些实验方案将帮助研究人员利用Seahorse细胞外通量分析技术，探究三维培养的癌细胞系来源类球体中的线粒体能量代谢。...

利用细胞外通量分析探索单个三维微组织球体的线粒体能量代谢

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

了解利用Seahorse技术对三维胶质瘤球状体进行代谢分析的方法，以评估药物反应并揭示肿瘤耐药机制。该平台为癌症研究提供了强有力的工具，有助于开发更有效的治疗策略。

三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

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