三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

本研究旨在利用Seahorse技术优化用于研究能量代谢的三维细胞球体形成方法，重点关注细胞行为代谢活性及药物反应，建立具有临床相关性的模型。该研究成果将通过更准确地模拟脑肿瘤，改进药物筛选模型，提升治疗评估和代谢分析水平，从而优化治疗策略。研究结果为探索三维球状模型中能量代谢的变化机制、药物对代谢通路的影响，以及代谢改变如何导致肿瘤对治疗产生耐药性的机制奠定了基础。

将收集的U87细胞在DMEM中重悬后，将未使用的培养基预热至37摄氏度。将细胞悬液在室温下维持30分钟。根据初始细胞计数，用含有10% FBS的DMEM稀释细胞悬液，最终体积为20毫升，确保细胞数量约为200,000个。

通过反复倒置充分混匀最终的细胞悬液。将悬液沿每个孔的边缘缓慢加入透明圆底超低吸附96孔板中，每孔200 µL，然后用Parafilm密封板子以防止离心过程中泄漏。将密封后的板子放入离心机，以200 ×g离心2分钟，使细胞沉淀至各孔底部。

从离心机中取出培养板。小心移除封口膜，将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。为制备包被液，将5毫克聚-D-赖氨酸溶解于50毫升无菌水中，并充分混匀直至完全溶解。

向代谢检测板的每个孔中加入 30 µL 包被溶液。通过轻轻振荡平板或吸除多余溶液，确保无气泡产生。将平板盖好后于室温孵育 20 分钟，随后吸除包被溶液，并用 200 µL 无菌水洗涤孔板两次。

将培养板风干至少30分钟，然后在37摄氏度、无二氧化碳条件下加热30分钟，以稳定包被。随后，向每孔加入175 µL预热的培养基。将培养板置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育，直至准备进行细胞球体转移。

培养5天后，将球状体培养板转移至高内涵成像系统。设置成像参数时，将温度设为37摄氏度，二氧化碳浓度设为5%。在系统设置中调整培养板类型、通道和聚焦范围。随后，使用共聚焦显微镜配备10倍物镜及成像软件获取球状体图像，识别含有完整球状体的孔，并记录其位置以用于后续转移。

将完整的球状体分为两组，对照组设六个复孔，非诺贝特处理组设六个复孔。用新鲜预热的培养基配制最佳浓度的非诺贝特工作液。小心地将含有球状体的低吸附培养板从成像系统中取出，置于生物安全柜内无菌表面上。

将涂有聚-D-赖氨酸的检测板放置于其旁边以进行转移，然后剪切20微升移液器的吸头尖端，以便在不损伤细胞球体的情况下轻柔地吸取。使用剪切后的移液器吸头，从孔底轻柔地吸取每个完整的球体。将每个球体转移至包被板中对应的孔内，并静置20秒使其沉降。

将3D球状体检测板转移至高内涵成像系统。为分析形态学数据，应用纹理区域模块，根据纹理特征将图像内容划分为三个聚类，从而粗略分离3D球状体与背景。接着应用图像区域识别模块，利用基于体积的大小特征进一步优化已初步分离的3D球状体，确保去除杂质并保留完整的球状体。

使用形态学特性模块测量3D球状体的形态学参数。应用种群筛选模块过滤并保留真正的3D细胞球状体，然后导出形态学数据结果。在培养的第五天可明显观察到球状体形成，所有观察样本均保持一致的球形形态。

在第5天还观察到球状体解体，结构完整性明显受损。移植后分析显示，大多数对照组和非诺贝特处理的3D球状体仍保持完整，但部分经非诺贝特处理的球状体出现解体。与对照组相比，非诺贝特处理的球状体在所有时间点的氧消耗率均显著降低。