利用脑类器官模拟线粒体疾病：聚焦线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作

本研究的目的是了解线粒体疾病的检测方法，并寻找治疗该疾病的药物。挑战在于，尽管该技术包含类器官的形成，仍需保持高通量筛选的能力。首先，当诱导性多能干细胞培养皿中的细胞融合度达到约70%至80%时，移除培养基。

用 PBS 洗涤细胞。向细胞中加入 350 µL 酶溶液并进行孵育。加入 800 µL StemFit 培养基以终止反应。

将细胞悬液转移至新的离心管后，在22°C条件下以190×g离心5分钟。随后，用1毫升分化培养基重悬细胞沉淀。细胞计数后，将3000个细胞接种至96孔U型低吸附培养板的每孔中，每孔体积为100微升。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育六天。孵育结束后，使用宽口移液器将类器官从96孔板转移至10厘米培养皿中。向新的96孔板的每孔加入50微升添加补充物的DMEM/F12培养基。

将类器官收集到2毫升离心管中。小心移除培养基，注意不要吸走类器官，并加入1.5毫升添加补充物的DMEM/F12培养基。在吸出最后一次洗涤液后，加入500微升新鲜培养基。

然后将类器官转移至10厘米培养皿中，加入5毫升培养基以利于挑取每个类器官。使用设定为50微升的微量移液器，将所有类器官转移至96孔板的每个孔中，并培养3天。

在第9天，将类器官收集到2毫升离心管中，并用DMEM/F12洗涤3次。然后将类器官重悬于分化培养基中。每孔接种约10个类器官至6孔板中，并将每孔培养基的终体积调整为2毫升。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下静置培养平板6天。第15天时，将类器官收集至15毫升离心管中。待管内物质沉降后，吸除上清液，加入含有B27和维生素A的新鲜分化培养基。

将约10个类器官转移至六孔板的每个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下静态培养类器官15天。使用稀释的多聚-L-鸟氨酸溶液包被培养板。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，用PBS洗涤各孔，每次5分钟，共洗涤3次。然后向各孔中加入稀释的层粘连蛋白溶液。

将培养板在37摄氏度下孵育三小时，或过夜。以200×g离心类器官悬液五分钟。弃去上清液，加入一毫升酶溶液。

充分混匀后，在37摄氏度孵育5分钟，然后离心。去除上清液后加入1毫升分散液，小心地将分离液铺加在悬液下方。随后在200×g离心5分钟。

现在，将一毫升神经元培养基加入离心管中。混匀溶液，并将细胞悬液通过70微米滤网转移至50毫升离心管中。计数细胞后，以每平方厘米10万个细胞的密度将细胞悬液接种于多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上。

每四到七天更换一次培养基，持续至第60天。进行免疫荧光染色前，先将类器官收集至微量离心管中，用PBS洗涤，随后在4%多聚甲醛中室温固定30分钟。

固定后，用 PBS 清洗类器官三次。将类器官置于 4°C 保存，直至使用。接种后 30 天进行 2D 神经元培养时，从培养板中移除培养基。

然后用 PBS 洗涤细胞。在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。用移液器吸出多聚甲醛，再用 PBS 洗涤细胞三次。

将固定后的细胞保存在 4 摄氏度直至使用。为收集类器官用于 RTQPCR，将类器官转移至微量离心管中。用移液器将 PBS 加入管中以洗涤类器官。

现在，向类器官中加入 350 微升裂解缓冲液，然后在液氮中迅速冷冻。将试管保存在 -80 摄氏度，直至使用。在第 30 天，已成功从健康对照 iPSC 系 414C2 诱导出含有 FOXG1 阳性神经元的脑类器官，并在第 60 天获得二维培养的神经网络。

通过定量PCR（QPCR）确认了M.3243A到G变异的异质性水平。第2至第8条细胞系具有低水平异质性，而第2至第6条细胞系具有高水平异质性。源自低水平异质性细胞系（第2至第8条）的脑类器官表现出与健康对照组相似的大小和形态。

来自高异质性细胞系2-6的类器官显示出减小的尺寸，为0.3平方毫米，并具有不规则形态，圆形度值为0.82。在第30天和第60天，来自414C2细胞系和2-8细胞系诱导产生的大多数神经元呈FOXG1阳性。而在来自2-6细胞系的类器官或二维培养神经元中，极少检测到FOXG1阳性神经元。

我们的结果表明，基于患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）类器官模型是研究MELIS的机制及药物筛选的有用平台。我们常规的方法具有培养时间短、成本效益高的优点，为研究MELIS的病理生理机制提供了实用工具。未来，我们希望利用患者来源的类器官结合化合物筛选，寻找治疗MELIS的潜在药物。