Name: 利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内和体外对脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌进行表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 探索利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内外表征脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌的方法。该技术可定量分析EV分泌并揭示脂肪组织中的旁分泌信号通路，为代谢研究提供新工具。

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感谢爱因斯坦医学院流式细胞术核心实验室提供的FACS技术支持，以及分析成像中心提供的所有图像分析帮助。本研究部分得到了美国国立卫生研究院基金DK128839和NCI癌症中心支持基金P30CA013330的资助。

根据阿尔伯特·爱因斯坦医学院的动物护理与使用指南，雄性小鼠在22 °C、相对湿度30-70%的环境中以群养方式饲养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，并提供 随意摄取 可自由获取食物和水，并维持在C57BL/6J遗传背景上。
1. 体内 通过抗原提呈细胞摄取检测分泌的腺相关病毒外泌体
<ol>
	<li>缓冲液制备
	<ol>
		<li>消化缓冲液：通过向50 mL DMEM中加入0.5 mL 1 M HEPES和0.5 g低脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）来制备HEPES缓冲DMEM。混合至完全溶解。</li>
		<li>洗涤缓冲液：制备含2.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和4%胎牛血清（FBS）的PBS。</li>
		<li>将Liberase和DNase 1储备液分别配制成5 mg/mL和5 KU/mL，于-20 °C保存。使用前立即解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹股沟脂肪组织采集与消化 
	注意：通过吸入二氧化碳处死4月龄AdipCD63-GFP和CD63-GFP对照小鼠。在分离脂肪组织祖细胞（APCs）前，将已处死的小鼠置于4 °C环境中24小时。
	<ol>
		<li>采用无菌技术切除脂肪组织，取1 g组织置于0.5 mL消化缓冲液中，用无菌剪刀将组织精细剪碎至不超过1 mm的碎片。</li>
		<li>将剪碎的组织悬浮于含0.5 mg/mL Liberase和50 U/mL DNase 1的10 mL消化缓冲液中。</li>
		<li>在37 °C下于旋转摇床（100 rpm）中孵育30–60分钟。孵育期间轻轻翻转离心管数次以混匀组织。当溶液呈现浑浊且无可见组织碎片残留时，视为消化完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>APCs的分离
	<ol>
		<li>用两倍体积的消化缓冲液稀释悬浮液，并轻轻翻转离心管3–4次。</li>
		<li>通过无菌100 µm滤膜过滤，以去除未消化的组织。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液中的脂肪细胞部分，将沉淀标记为基质血管组分（SVF）。</li>
		<li>用无菌水新鲜配制1×红细胞（RBC）裂解缓冲液。将SVF中的红细胞在冰上孵育5分钟以进行裂解，注意避光。</li>
		<li>加入两倍体积的洗涤缓冲液，然后在4 °C下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>按照脂肪组织祖细胞分离试剂盒（小鼠）的操作说明，每克组织用80 µL缓冲液（PBS，pH 7.2，0.5% BSA，2 mM EDTA）重悬SVF。</li>
		<li>每克组织加入20 µL非脂肪细胞祖细胞耗竭混合液。</li>
		<li>混匀后在2–8 °C避光孵育15分钟。</li>
		<li>将样品通过LS柱，收集流穿液。</li>
		<li>将流穿液（CD31、CD45、Ter119阴性）在4 °C下以300 × g离心5分钟，获得用于研究的APCs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过共聚焦显微镜检测APCs摄取的分泌型AdEVs
	<ol>
		<li>将从AdipCD63-GFP或CD63-GFP小鼠中分离的APCs（1 × 104 个细胞/mL）250 µL接种至胶原包被的8孔腔室载玻片上，使细胞贴壁约6小时。</li>
		<li>用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，以保存细胞和细胞外囊泡（EV）结构用于成像。 
		注意：在此类检测中，GFP信号标记AdEVs，通过共聚焦显微镜在APCs内检测到GFP信号表明这些祖细胞摄取了AdEVs。</li>
		<li>用PBS洗涤载玻片三次，用抗荧光淬灭封片剂封片，并使用配备63×油浸物镜的共聚焦显微镜捕获GFP信号。采用488 nm激光激发GFP，检测500–550 nm发射光，以0.5 µm步长采集z轴序列图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术检测APCs摄取的分泌型AdEVs
	<ol>
		<li>计数APCs，并将活力染料（如Zombie）按1:1000比例稀释于1X&#160;PBS中。将细胞重悬为每100 µL含1 × 106 个细胞，冰上孵育20分钟，避光。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤一次，在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于亮染缓冲液中，浓度为每100 µL含1 × 106 个细胞。</li>
		<li>用Fc受体阻断试剂（如抗CD16/CD32）按1:100比例在冰上封闭非特异性结合10分钟。</li>
		<li>将Sca-1抗体在4 °C下以6,000 × g预离心10分钟。然后向APC管中加入1 μL Sca-1抗体，在冰上孵育20分钟，用铝箔覆盖避光。</li>
		<li>用1 mL洗涤缓冲液洗涤两次，在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于洗涤缓冲液中，浓度约为每500 µL含1 × 106 个细胞，用于流式细胞分选。使用配备405 nm紫激光（Pacific Blue检测使用450/50 nm滤光片）和488 nm蓝激光（GFP检测使用530/30 nm滤光片）的光谱流式细胞仪获取Sca1+和GFP+细胞数据。使用仪器配套软件进行数据分析，设门于Sca1+细胞群体，并分析其中的GFP+亚群，如图2所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分泌型AdEVs的检测与分析 体外
<ol>
	<li>将前脂肪细胞（APCs）分化为成熟脂肪细胞 
	注意：除非另有说明，所有培养均在37 °C、8% CO2条件下进行。
	<ol>
		<li>第0天：在室温（RT）下用0.2%明胶包被培养皿30分钟，吸除明胶后，将新分离的APCs接种于DMEM/F12培养基中，该培养基含有15%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和0.1%普乐霉素（Primocin），使细胞在诱导分化前达到100%汇合度。</li>
		<li>第1–8天：更换为MesenCult脂肪诱导分化培养基（总体积50 mL：45 mL基础液 + 5 mL补充液 + 0.5 mL GlutaMAX + 50 µL Primocin），并在第4天更换为新鲜的分化培养基。</li>
		<li>第9天：用PBS洗涤脂肪细胞两次，随后更换为成熟脂肪细胞培养基（DMEM + 1% BSA + 0.2% Primocin），继续培养16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪细胞来源的细胞外囊泡（AdEV）的分离与纯化
	<ol>
		<li>将上述获得的15 mL脂肪细胞培养液依次通过40 µm滤膜和30 µm滤膜过滤。</li>
		<li>将滤液在500 × g下离心5分钟，随后在2,000 × g下离心10分钟，以去除残留细胞和碎片。</li>
		<li>将滤液通过0.8 µm滤膜过滤，然后使用截留分子量为100 kDa的超滤装置（样品体积15 mL）在4,000 × g下离心15分钟，将培养基体积从15 mL浓缩至0.5 mL。</li>
		<li>将样品加载至尺寸排阻色谱（SEC）柱，并使用自动组分收集器收集F1–8组分。</li>
		<li>使用截留分子量为100 kDa的超滤装置（样品体积4 mL）浓缩所收集的EV组分，并通过蛋白质印迹（Western blot）、纳米颗粒追踪分析仪和透射电子显微镜（TEM）对各组分中的EV含量进行验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AdEV的验证、定量及大小/形态学评估
	<ol>
		<li>EV标志物的蛋白质印迹分析
		<ol>
			<li>将每组分样品从400 µL浓缩至25 µL，然后加入50 µL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。加入2×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液使样品变性，并在4–12% Tris-甘氨酸凝胶上进行蛋白电泳分离。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用纳米颗粒追踪分析仪检测EV的大小、浓度和质量。
		<ol>
			<li>分析前，用无菌、经0.1 µm滤膜过滤的PBS以1:1000比例稀释EV样品，确保颗粒浓度处于最佳检测范围（约107–109 个颗粒/mL）。轻柔混匀稀释后的样品，避免产生气泡。</li>
			<li>将样品加载至配备高灵敏度科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机、532 nm绿色激光模块以及检测阈值为10 nm（最高至1,000 nm）/ 106–109 个颗粒/mL的仪器中。</li>
			<li>使用NS Xplorer软件套件进行成像和定量分析，该软件采用基于动态观测体积的浓度算法。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过透射电子显微镜（TEM）观察EV形态
		<ol>
			<li>在浓缩前取50 µL EV样品送至核心设施进行负染色处理。将EV样品滴加至经等离子清洗仪处理过的仅含碳膜的400目铜网上。</li>
			<li>短暂吸附后，用蒸馏水冲洗铜网，用1%（w/v）醋酸铀进行负染色，用滤纸吸去多余染液后自然干燥。随后在120 kV电压下使用透射电子显微镜对样品成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 安全与废弃物处理信息
<ol>
	<li>操作多聚甲醛和醋酸铀酰时，须在通风橱内佩戴个人防护装备（PPE），因为两者均有毒性。醋酸铀酰废弃物应收集于贴有标签的危险废物容器中。</li>
	<li>所有生物样本均应视为可能具有传染性，并根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的机构生物安全政策和规程进行材料处理与处置。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无经济利益冲突。

本方案通过提供一种稳健且可重复的系统来分离和表征AdEVs及其被APC摄取的过程，填补了重要的方法学空白。与其他来源的EVs相比，AdEVs富含脂质且浮力较大，使得基于超速离心的经典EV分离技术效率较低35。然而，目前大多数已发表的AdEV纯化方案仍依赖超速离心，而该方法可能影响囊泡形态，导致EV聚集，并引起蛋白质污染37,44。我们的方案则采用连续低速离心（≤ 4,000 × g）结合尺寸排阻色谱法（SEC）来纯化AdEVs。类似的连续离心-SEC方法已在非脂肪细胞来源的EVs中得到验证，具有更高的得率和纯度45。此外，避免使用超速离心可更好地保持非脂肪细胞来源EVs的生物物理特性46。上述方案首次描述并验证了将连续离心-SEC方法用于从成熟脂肪细胞中分离纯化AdEVs。
为确保本方案的可靠性和可重复性，...

脂肪组织 increasingly 被认为是一个动态的内分泌器官，在全身能量稳态中发挥关键作用1,2,3,4,5。除了作为脂质储存库的经典功能外，脂肪细胞还调节全身胰岛素敏感性，而脂肪组织质量的异常——无论是过多还是不足——均与胰岛素抵抗和代谢性疾病相关6,7,8,9。其中一种被提出参与该调控功能的机制是通过分泌因子介导的细胞间通讯。尽管脂肪因子已被确立为脂肪组织重要的内分泌信号分子10,11,12,13,14,15,16,17,18，脂肪细胞还会释放大量细胞外囊泡（EVs），即一类含有脂质、蛋白质、核酸和代谢物的膜结合颗粒。目前尚不清楚脂肪细胞分泌的EVs（AdEVs）是否也像其他类型的EVs一样携带糖类分子19,20,21,22,23,24。已有研究证实，脂肪细胞是EVs的主要来源之一，因为在小鼠模型中，约80%循环中的外泌体microRNA来源于脂肪细胞，这一结论通过在基础条件下使用脂肪细胞特异性Dicer基因敲除小鼠得以验证25。尽管已有报道指出AdEVs在代谢、炎症、胰岛素敏感性和脂肪生成中的作用，但这些功能仍未被充分阐明26,27,28,29。其他潜在功能，特别是介导与其他细胞类型及器官之间串扰的作用，目前仍知之甚少。EVs的丰度26提示其可能在局部和全身性信号传导中发挥重要作用，但AdEVs的生物学意义及其作用机制在很大程度上尚未被探索。这一知识空白凸显了建立可靠且专门化的方法以研究AdEV分泌与功能的必要性。
为弥补这一空白，我们通过将脂联素-Cre小鼠（Adiponectin-Cre）与Stopfl/fl/CD63-GFP 小鼠（品系编号：036865，JAX）&#160;停止fl/fl/CD63-GFP 同窝小鼠在无 Cre 的情况下不表达 CD63-GFP，被用作对照。CD63-GFP 报告基因小鼠品系已成功用于追踪细胞类型特异性的细胞外囊泡（EVs） 体内，包括内皮细胞和神经元来源的EVs30,31由于脂联素仅在成熟脂肪细胞中表达，而在脂肪细胞前体细胞（APCs）中不表达32,33, CD63 是细胞外囊泡（EVs）的标志物34，GFP+ 在循环和组织中检测到的EVs可被特异性地鉴定为AdEVs。因此，在本研究中，GFP+ 在APCs内检测到的EVs被解释为已被这些前体细胞摄取的AdEVs。该报告系统可实现对囊泡释放及其潜在靶向相互作用的直接监测 体内 和 体外，从而能够研究脂肪组织中其他细胞类型的AdEVs。重要的是，与其他细胞来源的EVs相比，AdEVs富含脂质，因而密度更低、更脆弱，且难以通过传统的超速离心方法有效回收。35,36,37高离心力可能损伤这些囊泡，或导致显著的样品损失与污染，从而增加后续分析的难度。为克服这些局限性，我们优化了一种结合多次低速离心与尺寸排阻色谱的流程，该方法可最大限度减少剪切应力，保持囊泡完整性，并提高纯度和得率，从而实现准确的定量分析和功能研究。CD63-GFP系统与这一优化的分离流程相结合，为研究脂肪细胞外囊泡（AdEV）在脂肪组织互作及全身代谢调控中的分泌机制与功能提供了便捷且可重复的技术途径。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>AM9260G</td><td>500倍稀释</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>用水稀释1000倍</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1000倍稀释</td></tr><tr><td>小鼠脂肪组织前体细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi biotec</td><td>30-106-639</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa MWCO</td><td>Sigma</td><td>UFC9100</td><td>15 mL 样品体积</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa MWCO</td><td>Sigma</td><td>UFC9100</td><td>4 mL 样品体积</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Calnexin 抗体</td><td>calnexin</td><td>ab22595</td><td>1000倍稀释</td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>abcam</td><td>ab217345</td><td>500倍稀释</td></tr><tr><td>CD81</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>10037s</td><td>500倍稀释</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;BioCoat&amp;nbsp;Collagen I 培养载片</td><td>Sigma</td><td>CLS354630</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;细胞筛</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td>40 &amp;mu;m 孔径</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;细胞筛</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td>100 &amp;mu;m 孔径</td></tr><tr><td>COX IV 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4844</td><td>1000倍稀释</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>即用型</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂</td><td>Thermofisher</td><td>10565018</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>储存液 5 KU/mL，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100倍稀释</td></tr><tr><td>Halt&amp;trade; 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X）</td><td>Thermofisher</td><td>78444</td><td>即用型</td></tr><tr><td>HSP70 抗体</td><td>abcam</td><td>ab181606</td><td>1000倍稀释</td></tr><tr><td>Invitrogen eBioscience 10X RBC 裂解缓冲液（多物种）</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9743</td><td>用水稀释10倍</td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC2042225</td><td>即用型</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 8 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microscopes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM 研究级酶</td><td>Sigma</td><td>LIBTM-RO</td><td>储存液 5 mg/mL，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Millex MCE 注射器滤器</td><td>Sigma</td><td>SLAA025</td><td>0.8 &amp;mu;m 孔径</td></tr><tr><td>NanoSight Pro</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Mini 蛋白凝胶，4&amp;ndash;12%</td><td>Thermofisher</td><td>XP04120BOX</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine SDS 样品缓冲液（2x）</td><td>Thermofisher</td><td>LC2676</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Pacific Blue 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体</td><td>BioLegend</td><td>108119</td><td>25倍稀释</td></tr><tr><td>多聚甲醛溶液（16%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td>用 PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>pluriStrainer S / 30 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0922459</td><td>30 &amp;mu;m 孔径</td></tr><tr><td>Ponceau S 溶液</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td>即用型</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>NC9141851</td><td>500倍稀释</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8961S</td><td>即用型</td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 CD16/32 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101301</td><td>100倍稀释</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI89900</td><td>用水稀释10倍</td></tr><tr><td>光谱流式细胞仪（Aurora 3）</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Syntaxin 4 抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>110042</td><td>5000倍稀释</td></tr><tr><td>Tecnai 20（透射电子显微镜）</td><td>FEI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tergeo-EM</td><td>PIE Scientific LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vinculin 抗体</td><td>abcam</td><td>ab18508</td><td>5000倍稀释</td></tr></tbody></table>

利用cd63-gfp报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

Characterization of Adipocyte-Derived Extracellular Vesicle Secretion Using a CD63-GFP Reporter Mouse Model In Vivo and In Vitro

脂肪细胞 increasingly 被认为是具有活性的内分泌细胞，能够分泌大量富含蛋白质、脂质和核酸的细胞外囊泡（EVs）。然而，调控EVs分泌的机制及其在不同生物学背景下的释放动态仍不完全清楚。为填补这一空白，我们构建了一种新型的脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠品系，其中GFP标记的CD63在脂联素（Adiponectin）启动子驱动下表达，从而实现对脂肪细胞来源EVs（AdEVs）的选择性标记与追踪 体内利用该报告模型，我们检测了脂肪细胞外囊泡（AdEVs）的分泌及其向脂肪组织内抗原呈递细胞（APCs）的递送。共聚焦成像和流式细胞术结果显示，AdEVs可被APCs主动摄取，揭示了脂肪微环境中一种此前未受重视的旁分泌通讯机制。
以补充 体内 研究，一个 体外 建立了该系统，以直接监测分化脂肪细胞中细胞外囊泡（EV）的分泌。从报告基因小鼠的皮下白色脂肪组织中分离出脂肪前体细胞（APCs），并诱导其分化为成熟脂肪细胞。在这些细胞中，CD63-GFP信号表现为离散的点状结构；当EV分泌被抑制时，信号在质膜上富集，这与囊泡释放受阻后发生积聚的现象一致。在正常培养条件下，分泌到培养基中的EV通过尺寸排阻色谱法进行浓缩和纯化，从而可用于后续的功能和生物化学分析。
该平台可应用于来自其他脂肪库的抗原呈递细胞（APC），例如附睾白色和棕色脂肪组织，或通过将其分化为特定脂肪库的脂肪细胞，从而实现不同类型脂肪细胞间细胞外囊泡（EV）分泌的比较。

这些方法共同引入了一种强大的遗传学工具和一种互补的 体外 解析AdEV分泌与靶向动态的系统。这些进展揭示了脂肪组织内部的细胞间通讯机制，并为理解AdEVs在健康与疾病状态下的广泛代谢影响奠定了基础。

通过共聚焦显微镜检测抗原呈递细胞（APC）摄取脂肪组织来源的细胞外囊泡（AdEVs）的本实验方案，我们从AdipCD63-GFP小鼠和Stopfl/fl/CD63-GFP小鼠的腹股沟脂肪组织中分离出APC，并用DAPI染色以显示细胞核。共聚焦显微镜观察显示，来自Stopfl/fl/CD63-GFP小鼠的APC中未检测到明显的GFP点状信号（图1A）。相比之下，从AdipCD63-GFP小鼠分离的APC在细胞质中呈现出大量清晰可辨的GFP点状信号（图1B）。GFP信号表明APC摄取了AdEVs，因为CD63-GFP标记由仅在成熟脂肪细胞中表达而不在APC中表达的脂联素启动子驱动30,31。这些结果证实了该方法的特异性，并验证了本方案识别AdEV摄取事件的能力。
除了共聚焦显微镜外，APC对分泌型AdEVs的...

该方案利用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，可视化并定量脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的分泌，并展示其被前体细胞摄取的过程，揭示了脂肪组织内的一种旁分泌通路。

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

脂肪细胞 increasingly 被认为是活跃的内分泌细胞，可分泌大量富含蛋白质、脂质和核酸的 EVs ...

我们研究脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs），以明确其在脂肪组织中的作用，特别是它们如何调控成熟脂肪细胞与其前体细胞之间的相互作用。目前尚无用于研究脂肪细胞EV分泌的体内系统，且现有的纯化方案尚未完全优化。首先，采用无菌技术切除安乐死小鼠的腹股沟脂肪组织。取一克试剂组织放入含有0.5毫升消化缓冲液的2毫升离心管中。使用无菌剪刀将组织剪切成不超过1毫米的碎片。将剪碎的组织悬浮于10毫升含有0.5毫克/毫升Liberase和50单位/毫升DNase I的消化缓冲液中。将样品置于37摄氏度的摇床中孵育。孵育期间，轻轻翻转离心管数次。当溶液呈现浑浊且无可见组织碎片残留时，表明消化完成。为分离基质血管组分（SVF），用两倍体积的消化缓冲液稀释消化后的悬液。轻轻倒置离心管三到四次，充分混匀。将悬液通过无菌的100微米滤膜，以去除未消化的组织，然后将滤液在4°C下以300×g离心5分钟。将沉淀物标记为SVF。将基质血管组分置于冰上，用新鲜配制的红细胞裂解缓冲液避光孵育五分钟。加入两倍体积的洗涤缓冲液，在4°C下以400g离心五分钟。每克组织用80微升缓冲液重悬基质血管组分，并将悬液转移至新管中。每克组织加入 20 微升非脂肪细胞前体耗竭混合液。在 2 至 8 摄氏度避光孵育 15 分钟。将样品过 LS 柱，收集流出液，其中含有谱系阴性细胞组分。在4°C条件下，以300g离心流穿液5分钟，以获得脂肪细胞前体细胞。将250 µL分离的小鼠脂肪细胞前体细胞接种至胶原包被的八孔腔室载玻片上，孵育6小时。使用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，以保存细胞及细胞外囊泡结构用于成像。接下来，用 PBS 清洗载玻片三次，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。接着，在计数脂肪细胞前体细胞后，将其悬浮并稀释活性染料，置于冰上避光孵育 20 分钟。用洗涤缓冲液洗涤细胞一次，然后离心。将细胞重悬于 Brilliant 染色缓冲液中，使最终浓度为每 100 微升含 100 万个细胞。通过加入 Fc 受体阻断试剂（按 1:100 比例）阻断非特异性结合，并进行孵育。将SCA-1抗体在4°C条件下以6000g离心10分钟。按1:100稀释比例将SCA-1抗体加入APC管中，然后将管子置于冰上避光保存。用1毫升洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每次在4°C条件下以300g离心5分钟。将细胞重悬于流式细胞术分选用洗涤缓冲液中，然后使用配备紫色和蓝色激光的光谱流式细胞仪，获取SCA-1阳性及GFP阳性细胞的数据。开始分化前，用0.2%明胶在室温下孵育30分钟包被培养皿。将 freshly isolated APCs 接种于添加补剂的DMEM/F12培养基中，并孵育至细胞融合。从第一天到第八天，使用MesenCult成脂分化培养基更换培养液。第九天，用PBS洗涤脂肪细胞两次，然后更换为含有DMEM、1% BSA和0.2% Primocin的成熟脂肪细胞培养基。为了分离脂肪细胞分泌的细胞外囊泡，首先将15毫升培养基通过40微米滤膜过滤，随后再通过30微米滤膜过滤。将滤液在500g离心5分钟，然后将上清液在2000g离心10分钟，以去除任何残留的细胞和碎片。将所得上清液通过0.8微米滤膜过滤后，转移滤液至15毫升超滤装置中，在4000g离心15分钟以浓缩培养基。将浓缩后的样品上样至连接自动组分收集器的尺寸排阻色谱柱，收集组分F1至F8。进行Western印迹分析时，将每份组分从400微升浓缩至25微升。加入50微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液至浓缩样品中。加入75微升2× SDS上样缓冲液以变性样品，并在4%至12% Tris-甘氨酸凝胶上分离蛋白质。进行纳米颗粒追踪分析时，用0.1微米滤过的无菌PBS稀释细胞外囊泡样品，并轻轻混匀。将稀释后的样品加入配备高灵敏度科学互补金属氧化物半导体相机和532纳米绿色激光器的纳米颗粒追踪分析仪中。设定检测粒径范围为10纳米至1,000纳米，浓度范围为每毫升10⁶至10⁹个颗粒。在共聚焦显微镜下，来自stop-flock-flock/CD63GFP小鼠的脂肪前体细胞未显示出可检测到的绿色荧光蛋白点状信号。尽管来自AdipCD63小鼠的细胞在整个细胞质中显示出大量明显的绿色荧光蛋白点状结构。流式细胞术分析显示，在报告基因小鼠中，仅有1.2%的skull 1阳性细胞表达绿色荧光蛋白，而在AdipCD63-GFP小鼠中，该比例为12.6%。对尺寸排阻色谱组分进行的蛋白质印迹分析表明，细胞外囊泡标志物CD63和HSP70在F1和F2组分中富集。内质网和线粒体的标志物则未检出，证实了囊泡的纯度。纳米颗粒示踪分析显示，脂肪细胞来源的细胞外囊泡大小在50纳米至500纳米之间，透射电子显微镜证实这些囊泡具有完整的双层膜结构。Western blot证实脂肪细胞中STX4基因被敲除。共聚焦显微镜显示，在野生型脂肪细胞中，CD63-GFP阳性囊泡在细胞质中广泛分布，而在STX4基因敲除的脂肪细胞中，这些囊泡则在质膜附近聚集。与野生型脂肪细胞相比，STX4基因敲除脂肪细胞分泌的脂肪细胞来源细胞外囊泡浓度显著降低。对等量细胞内囊泡蛋白进行的蛋白质印迹分析显示，与野生型相比，STX4基因敲除脂肪细胞中CD63和CD81的表达水平降低。该实验方案提供了一个稳定且可重复的系统，可用于体内和体外研究脂肪细胞EV的分泌，并提供了一种优化的脂肪细胞EV纯化方法。本方案首次描述并验证了采用连续低速离心结合尺寸排阻色谱法纯化成熟脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的方法。我们的研究结果使我们能够提出新的科学问题，探讨脂肪细胞在生理和病理条件下如何利用细胞外囊泡与其他细胞类型进行通讯。

characterization-adipocyte-derived-extracellular-vesicle-secretion

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内和体外对脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌进行表征

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内...

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。...

通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。...

一种用于研究基质-细胞代谢串扰的人源三维细胞外基质-脂肪细胞共培养模型

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本方案描述了从培养人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）、收集上清液到通过超速离心法提取细胞外囊泡（EVs）的全部操作步骤。...

人脂肪源性间充质干细胞来源的细胞外囊泡的纯化与表征

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

探索利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内外表征脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌的方法。该技术可定量分析EV分泌并揭示脂肪组织中的旁分泌信号通路，为代谢研究提供新工具。

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌在体内和体外

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利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

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