利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内和体外对脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌进行表征
2025年12月5日
该方案使用脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠系，观察并量化脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）分泌过程，并展示其被前体细胞吸收，揭示了脂肪组织中的旁分泌通路。
我们研究脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs），以界定它们在脂肪组织中的作用，特别是它们如何调控成熟脂肪细胞与其祖细胞之间的交叉信号。目前尚无体内系统用于研究脂肪细胞EV分泌物，现有纯化方案尚未完全优化。首先，使用无菌技术切除被安乐死小鼠的腹股沟脂肪组织。
将1克组织放入2毫升管中，管内含0.5毫升消化缓冲液。使用无菌剪刀将组织切碎，切碎不超过一毫米的块。将切碎的组织悬浮于10毫升含0.5毫克/毫升Liberase和50单位每毫升DNase I的消化缓冲液中。样本在轨道振动器中以37摄氏度孵育。
在孵育过程中，轻轻将管子倒转多次。当溶液看起来浑浊且无可见组织碎片时，消化完成。要分离基质血管分数（SVF），需用两体积消化缓冲液稀释消化悬浮液。
轻轻倒置管子三到四次，以使搅拌均匀。将悬浮液通过无菌的100微米过滤器去除未消化的组织，然后以300克离心机在4摄氏度下离心五分钟。把颗粒标记为SVF。
将基质血管分馏置于新鲜制备的红细胞溶解缓冲液中，冰藏五分钟，避免光照保护。加入两卷洗涤缓冲液，离心机在400克下，温度4摄氏度，离心五分钟。将基质血管分馏液重新悬浮于每克组织80微升缓冲液中，并将内容物转移到新管子中。
每克组织加入20微升非脂肪细胞前体耗竭鸡尾酒。在黑暗中以2至8摄氏度孵育样本15分钟。将样本通过LS色谱柱，收集含有谱系阴性细胞分数的流动。
以300克离心机，4摄氏度离心五分钟，以获得脂肪细胞的前驱细胞。将250微升分离的小鼠脂肪细胞前体细胞小鼠孵育在胶原蛋白包覆的八孔腔体载玻片上，培养六小时。用4%对甲醛固定细胞10分钟，以保留细胞和细胞外囊泡结构以便影像检查。
接着，用PBS洗三次滑套，然后用防褪色介质安装。接下来，计数脂肪细胞前驱细胞后，将其悬浮并稀释活性染料。在冰上孵育20分钟，避免光照。
用洗涤缓冲液和离心机清洗一次电池。将细胞悬浮在明亮染色缓冲液中，使最终浓度达到每100微升100万个细胞。通过添加Fc受体阻断试剂，以1比100的比例阻断非特异性结合并培养。
在6000克下，在四摄氏度下自由旋转SCA-1抗体10分钟。将SCA-1抗体以1到100稀释加入APC管，然后将管子冰敷，避免光照。用一毫升洗涤液清洗细胞两次，然后在4摄氏度下以300克离心机离心五分钟。
将细胞悬浮在洗涤缓冲液中进行流式细胞分选，然后用配备紫蓝激光的光谱流式细胞仪获取SCA-1阳性和GFP阳性细胞的数据。开始区分时，将0.2%明胶裹在常温下30分钟。将新鲜分离的APCs放入补充的DMEM/F12培养基中，培养至汇聚。
从第一天到第八天用MesenCult地产分化培养基替换培养基。第九天，用PBS清洗脂肪细胞两次，然后用含有DMEM 1%BSA和0.2%Primocin的成熟脂肪细胞培养基替换培养基。为了分离脂肪细胞分泌的胞外囊泡，首先将15毫升培养基通过40微米滤纸，然后再用30微米滤纸过滤。
先用500克离心液五分钟，然后用2000克离心上清液10分钟，以去除残留细胞和杂质。将所得上清液通过0.8微米滤网，并将滤液转移到15毫升超滤装置中，在4000克离心机中15分钟浓缩介质。将浓缩样品装入连接自动分级收集器的排异色谱柱上，采集F1至 F8.To 进行Western印迹分析，每个分馏浓度从400微升到25微升。
移液器将50微升放射性免疫沉淀分析缓冲液注入浓缩液中，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。加入75微升两枚2X SDS加载缓冲液，使样品变性并在4%至12%三甘氨酸凝胶上分离蛋白质。对于纳米颗粒跟踪分析，将细胞外囊泡样品稀释为0.1微米过滤的无菌PBS，并轻轻混合。
将稀释样品装入配备高灵敏度科学互补金属氧化物半导体相机和532纳米绿色激光器的NTA仪器中。将检测范围设在10纳米至1000纳米之间，浓度为10的6到10的9次方每毫升的粒子。停止群群/CD63GFP小鼠的脂肪前体细胞在共聚焦显微镜下未检测到绿色荧光蛋白点。
而AdipCD63小鼠的细胞则在细胞质中表现出许多独特的绿色荧光蛋白点。流式细胞术分析显示，报告小鼠中1号头骨阳性细胞中有1.2%表达绿色荧光蛋白，而AdipCD63-GFP小鼠为12.6%。西方吸迹排除色谱分数显示细胞外囊泡标记CD63和HSP70在F1和F2组分中富集。而内质网和线粒体的标记缺失，确认了膀胱纯净。
纳米粒子追踪分析显示，脂肪细胞来源的胞外囊泡大小从50纳米到500纳米不等，透射电子显微镜确认囊泡呈现出完整的双膜结构。西方印迹证实脂肪细胞中STX4被敲除。共焦点显微镜显示，CD63-GFP阳性囊泡在野生型脂肪细胞中分布在细胞质中，而STX4敲除脂肪细胞则在质膜附近积累。
与野生型相比，STX4敲除脂肪细胞的分泌物细胞来源胞胞浓度显著降低。对等量蛋白细胞内囊泡的Western blot显示，STX4敲除脂肪细胞中CD63和CD81的表达低于野生型。该方案提供了一个稳健且可重复的系统，用于体内和体外研究脂肪细胞EV分泌，并优化了脂肪细胞EV纯化方法。
该方案首次描述并验证了结合序列低速离心与尺寸排除色谱纯化成熟脂肪细胞衍生EV的应用。我们的发现让我们能够提出关于脂肪细胞如何在生理和病理条件下利用细胞外囊泡与其他细胞类型交流的新问题。
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概述
本研究调查了脂肪细胞源外细胞外囊泡（EV）及其在成熟脂肪细胞和祖细胞之间的通讯中的作用。利用脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠系，研究可视化并量化了EV分泌，展示了脂肪组织内的旁分泌途径。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢
背景
- 脂肪细胞源EV在细胞通讯中起着关键作用。
- 当前用于研究脂肪细胞EV分泌的体内系统是缺乏的。
- 现有的EV纯化方案未完全优化。
- 了解EV可以为代谢调控提供见解。
研究目的
- 定义脂肪细胞源EV在脂肪组织中的作用。
- 探索成熟脂肪细胞和祖细胞之间的交叉通讯。
- 建立可靠的体内研究EV分泌的方法。
使用的方法
- 使用无菌技术从处死的小鼠中切除腹股沟脂肪组织。
- 将切碎的组织悬浮在消化缓冲液中进行分析。
- 使用Liberase和DNase I进行组织消化。
- 在轨道摇床上以37摄氏度孵育样品。
主要结果
- 使用CD63-GFP报告小鼠可视化脂肪细胞的EV分泌。
- 量化祖细胞对EV的摄取。
- 展示脂肪组织内的旁分泌信号传导途径。
- 建立研究脂肪细胞EV体内的方案。
结论
- 脂肪细胞源EV在脂肪组织内的细胞通讯中具有重要意义。
- 该研究为未来研究代谢过程中的EV提供了基础。
- 优化的研究EV的方法可以增强对脂肪组织动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Adipocyte-derived extracellular vesicle (AdEV) secretion is a critical but underexplored mechanism in metabolic tissue communication, with implications for target validation and mechanistic de-risking in metabolic disease research. The CD63-GFP reporter mouse model and optimized in vitro system enable precise tracking and quantification of AdEV dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational studies. This platform enhances the ability to interrogate paracrine signaling pathways and compare depot-specific adipocyte EV profiles, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of AdEV secretion for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying adipocyte-to-APC paracrine communication pathways.
- Facilitates comparative studies across adipose depots to refine biological relevance and target confidence.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible in vitro system for standardized EV secretion assays from differentiated adipocytes.
- Enables quantitative readouts via confocal imaging, flow cytometry, and nanoparticle tracking analysis.
- Supports assay scalability and platform reuse for screening modulators of EV secretion or uptake.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling depot-specific and genotype-specific AdEV profiling.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking EV secretion dynamics to functional outcomes.
- Facilitates biomarker exploration through biochemical and functional analysis of purified AdEVs.
Pipeline & Workflow Integration
This genetic and in vitro platform integrates from early discovery through preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of adipocyte paracrine signaling via EVs.
- Screening: Delivers standardized, quantitative EV secretion assays for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides robust readouts including flow cytometry, Western blot, and nanoparticle tracking for cross-condition comparison.
- Translational Research: Enables depot- and genotype-specific AdEV analysis for disease model alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse adipose tissue and EV research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in adipose tissue signaling studies.
- Operational Value: Standardizes EV isolation and quantification workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional relevance of AdEV-mediated communication.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic disease targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse models, confocal imaging, and flow cytometry.
- Needs access to specialized instrumentation for EV purification and nanoparticle tracking analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization of isolation and quantification protocols.
- Adaptable to multiple adipose depots and differentiation protocols for broader applicability.
- Dependent on validated markers and controls to ensure EV purity and specificity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Adipocyte Progenitor Cells from Inguinal Adipose Tissue
2:57
Confocal and Flow Cytometry-Based Detection of Secreted GFP-Tagged Adipocyte Extracellular Vesicles
4:52
Detection of Secreted Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles In Vitro
7:47
Results
9:58
Conclusion
