Name: 芯片尺寸支架的三维细胞培养的微细 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-12T19:12:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习微热压印与微热成型技术制备多孔聚合物芯片，用于三维细胞培养。该方法简化制造流程，结合离子径迹技术，为细胞生物学和组织工程研究提供高效工具。

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作者谨此感谢Dirk Herrmann、Oliver Wendt、Siegfried Horn、Hartmut Gutzeit和Joerg Bohn在溶剂蒸气焊接方面提供的大力支持。此外，我们还要感谢Michael Hartmann、Alex Gerwald和Daniel Leisen在技术方面给予的协助。

流程序列 #1：热压印、机械加工与溶剂蒸气焊接
采用立方体设计的CellChip通过热压印或微注塑成型进行复制。为此，我们使用一个具有芯片反向几何结构的精密加工黄铜模具。容器以规则阵列排列，最多可达1156个，每个容器为立方体结构，边长为300 µm。热压印复制过程在常规的WUM02设备（Jenoptik Mikrotechnik，德国）上进行。该工具由两个圆形金属板组成。第一步，将一块薄的PMMA板（Lucryl，G77Q11，BASF）放置在打开状态下工具的下板中心位置。微结构模具嵌件则同心安装在上板中。随后闭合工具，对模具抽真空，并加热至高于聚合物玻璃化转变温度的温度。通过压紧两块金属板，使黏稠的聚合物被压入已抽真空的型腔中，直至完全充满，从而精确复制模具的几何形状。冷却后，可将微结构化的聚合物部件脱模。该过程所需的聚合物质量大于实际填充型腔所需的质量，多余的聚合物形成残余层，有助于部件脱模。然而，为了在容器底部制备直径小于3 µm的孔，必须将较厚的残余层减薄，甚至完全去除并替换为多孔膜。为了简化孔的集成工艺，采用金刚石铣刀对复制出的CellChip背面进行机械加工，将其完全去除。在此过程中，样品被固定在冷却的安装板上，同时将去离子水冷冻以支撑脆弱结构，防止其在加工过程中受损。
在最后一步工艺中，将一种商用的离子径迹蚀刻膜（聚碳酸酯，厚度10 µm，孔径3 µm，孔密度2×106 孔/cm²，Pieper Filter GmbH）键合到顶部和底部均已打开的容器阵列背面。键合过程采用溶剂蒸气焊接法，在一个密闭的加热腔室[图1]中进行，该腔室由一个上部冲头和一个带有集成真空吸盘的可移动下部平台组成。4 在腔室抽真空后，最多可同时对四个加工好的CellChip以及径迹蚀刻膜暴露于汽化的溶剂中。随后，通过上部冲头将成型部件与膜压合在一起。经过短暂的溶剂暴露（<15 s）后，再次抽空腔室以去除溶剂。由于接触时间短，仅材料表层被溶解，从而避免了因机械载荷导致的整体结构变形。最后，打开腔室，取出经溶剂焊接的CellChip，并准备用于细胞培养[图2]。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="色谱系统装置；蛋白质纯化实验所用设备。" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"></a> 图 1。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="微结构网格的扫描电镜照片；颗粒分布分析；比例尺 150 μm。" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"></a> 图 2。
流程序列 #2：重离子辐照、微热成型与径迹蚀刻（SMART 工艺）
这种名为SMART的新工艺是一种 recently developed 微加工技术，用于制造功能化的膜状微结构。5 该技术基于一种微加工热成型工艺，称为“微热成型”（microthermoforming）。6,7 这一核心工艺步骤借鉴自宏观的夹持片材热成型工艺，其过程是将加热后的薄聚合物膜在软化后的橡胶弹性状态下，通过气体压力压入模具型腔中 [图3]。与热压印或注塑成型不同，该工艺不属于一次成型，且聚合物不会被熔化。由于薄膜在保持固态并具有连续材料内聚性的条件下成型，因此可在平面聚合物膜上预先制备高横向分辨率的材料改性结构，并在后续成型过程中完整保留。在完成微热成型步骤后，这些改性结构还可进一步进行选择性处理，例如通过湿化学方法处理。
<img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="聚合物薄膜模压示意图；压力、温度变化；微模具形成过程。" width="400" height="217" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3
SMART 流程原则上包含三个步骤：
<ol>
<li>在预处理过程中于平面聚合物薄膜上构建高分辨率的改性图案</li>
<li>通过微热成形技术对薄膜进行三维成型，且不破坏（已图案化的）改性区域</li>
<li>后处理（可选），用于对薄壁微结构部件进行最终功能化修饰</li>
</ol>
我们目前用于制备多孔细胞芯片（CellChips）的SMART工艺包括以下步骤[图4]。首先，使用加速的重离子（如Xe、Au或U离子）在德国达姆施塔特GSI加速器设施上对一层薄聚合物膜（例如聚碳酸酯，Pokalon OG461Gl，50 µm，LoFo High Tech Film GmbH，德国）进行辐照，离子能量约为1 GeV，注量约为108 ions/cm²。当离子穿透薄膜时，每个离子会在材料中产生一条近乎笔直的改性区域轨迹，称为潜径迹（latent track）。预处理后的薄膜随后被热压成型为25×25排列的薄壁微容器阵列，每个微容器的直径和深度均为300 µm。该工艺目前在一台改进的热压印机[图5]上进行，其中聚合物膜被夹持在两块金属板之间。上板装有微加工模具，下板则包含压力和真空接口。通过氮气施加最高达5 MPa的压力，将薄膜拉伸进入先前已被抽真空的模具微腔中。成型过程在接近材料玻璃化转变温度下进行，以防止潜径迹退火。冷却模具后，即可脱模得到薄壁部件。
<img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="重离子辐照示意图；ΔT，Δp；过程：径迹蚀刻；科学研究。" width="400" height="119" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 图4
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="光学激发测量实验装置，带光纤连接的光谱系统。" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"></a> 图5
在后处理过程中，通过将整个微结构浸入适当的蚀刻介质（例如 5 mol/L NaOH、10% w/v 甲醇）中，选择性地将离子径迹蚀刻成孔。通过控制蚀刻时间及蚀刻条件（如浓度、温度和特殊添加剂（例如蚀刻促进剂）），可调节所形成孔的尺寸和形状[图6]。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="微结构表面的显微图像；扫描电镜图像；表面形貌分析；纳米级图案。" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"></a> 图6

<ol><li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-like+culture+system+using+microstructures%3A+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+And+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+as+a+novel+technique+for+manufacturing+scaffolds+in+tissue+engineering+%28CellChips%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.</li>
<li>Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li>
<li>Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+of+flexible%2C+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li>
<li>Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+tracks+in+solids%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nuclear tracks in solids.</a> , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.</li>
</ol>

尽管已有的聚合物微复制技术（如微注塑成型或热压印）适用于微结构的制备，但在制造具有集成且高度可控孔隙率的微结构（如CellChip所需）方面效果不佳。例如，对于体积较大的结构，需通过昂贵的机械加工来减薄壁厚，以便后续进行激光穿孔，或必须完全用径迹蚀刻膜替代原有结构。

SMART 是一种新型且具有前景的技术，可克服上述问题，并适用于大规模生产。未来发展方向包括采用卷对卷进料方式制造薄壁微结构，类似于宏观部件的生产线。此外，在橡胶弹性状态下对聚合物薄膜进行成型，不仅能够在整个结构（包括垂直侧壁）上形成定义明确的孔隙，还可在难以接触的区域（如微流控腔体内部）实现高分辨率的功能化结构，例如生物活性表面图案、涂层和拓扑结构。

芯片级三维细胞培养支架的微加工

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

使用微加工技术是制备具有可重复几何结构和恒定质量的三维细胞培养支架的前提条件。这些技术不仅在制造过程中具有广泛优势，也在多种应用中展现出重要价值。通过微加工支架精确且可重复的结构，可以调控所形成细胞聚集体的大小和形状，从而控制营养物质与气体的扩散路径长度。这无疑是防止细胞因营养和气体供应不足，或代谢产物清除不畅而导致凋亡和坏死的有效工具。
我们的聚合物芯片（称为CellChip）外形尺寸为2 × 2 cm，中央为微结构区域。该区域被细分为最多1156个微容器阵列，立方体设计（cp-或cf-芯片）的典型尺寸为边长300 µm，圆形设计（r-芯片）的典型尺寸为直径和深度均为300 µm。
到目前为止，微结构芯片的制备主要采用热压印或微注塑成型技术（有时还需结合后续繁琐的零件加工）。从根本上说，微注塑成型是目前唯一可用于聚合物微结构大规模生产的基于聚合物的复制技术之一。然而，这两种技术在加工高黏度聚合物熔体以形成极薄壁或集成通孔时，均存在某些不理想的局限性。以CellChip为例，需要制备极薄的底层结构，以便穿孔聚合物并形成尺寸明确的微孔，从而通过微流控灌注等方法为细胞提供培养基。
为了克服这些局限性并降低制造成本，我们开发了一种基于微型热压成型工艺的新型微技术方法。在制造高孔隙率、薄壁聚合物芯片时，我们结合了重离子辐照、微热压成型和径迹蚀刻技术。这种被称为“SMART”工艺（热压成型基底改性与复制）的方法首先使用数百MeV能量的重离子轰击聚合物薄膜，形成所谓的“潜径迹”。随后，在保持薄膜处于橡胶弹性状态的条件下，将其加工成三维结构，而不会改变或退火处理这些潜径迹。成型完成后，通过选择性化学蚀刻，最终将这些潜径迹转化为直径可调的圆柱形孔道。

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed 的微热成形工艺，并结合离子径迹技术，显著简化了制造过程。

使用微加工技术是制备具有可重复几何结构和恒定质量的三维细胞支架的先决条件。

大家好，我叫Stefan Re。我在生物界面研究所工作，在接下来的文章中，您将看到一种名为ship的微结构支架的制备过程，我们使用两种不同的方法来制造这种芯片。目前采用的是热压印工艺结合某些后续处理步骤，以及一种最近在名为Squi的研究中心开发的微热成形工艺。现在我们位于一个洁净室帐篷内，您在右侧看到的是一台典型的真空热压机，我们使用这台设备来制备微结构细胞芯片。首先，我们会引入一个微结构模具。此装置安装在此类平板上，您可以看到这里的两个模具。该模具通过微加工技术制成，材料为硅。现在我将微结构模具安装到机器中。在热成型工艺中，我们使用此类聚合物板，通常采用聚碳酸酯或PMA来生产细胞芯片。现在将聚合物板插入机器中，置于模具中央，然后闭合模具。关闭机器后，先对腔体抽真空，随后将模芯或整个模具加热至成型温度，再将受热软化的聚合物压入具有微结构的模具中。完成此模塑工艺后，整个模具会被冷却，并且该设备内会自动进行脱模过程。此处展示的是一个已模塑成型的细胞芯片，包含模塑部件、两个细胞芯片以及热压工艺形成的典型残余层。在热压和覆膜步骤之后，需将部件上的残余层减薄，最终完全去除。因此，需要对模具部件进行修整，然后将其冷冻固定在安装板上。安装完成后，通过铣削去除残余层，使部件达到特定厚度，从而在背面打开微结构网格。在铣削过程中，微容器壁由冻结的水提供支撑以保持稳定。最后，我们获得两个模制的细胞芯片，其具有悬空的MicroCon容器网格结构，容器在顶部两侧开口，而在底部进行键合。在铣削工艺之后，将多孔膜连接到这些开口MicroCon容器阵列的背面。我们将一种市售的带孔聚碳酸酯膜键合到开口细胞芯片的背面，以获得微孔容器阵列。为此，我们将薄聚合物径迹蚀刻膜插入此腔室中。这些膜的厚度约为10微米，然后将细胞芯片置于这些膜的上方。接着封闭该腔室，并在第一步中对腔室进行抽真空处理。然后，我们注入汽化的溶剂以溶解聚合物表面，并通过对该堆叠施加外力，使膜与细胞芯片键合。最后一步，对腔室进行评级，取出完成的细胞芯片。最近，我们开发了一种基于热成型工艺的新型赛奇器件制备技术，该技术适用于微米尺度，因此我们称之为微热成型。为了制备多孔sechi，我们使用经加速重离子辐照的聚酯薄膜。该工作是在与中国台湾Unilog大学的CASE合作下完成的，这些重离子完全穿透聚合物薄膜，在其中形成潜径迹。在热成型过程中，这些潜径迹得以保留，并用于形成孔隙。然后在成型过程中，通过蚀刻这些拉丁文轨迹形成具有特定尺寸的孔隙。右侧所示为经过改造的设备，即一台为该微热压印工艺改造的热压印机。该工具主要由三部分组成：上板和下板，它们带有用于气体压力和抽真空的连接件，第三部分位于此处，形如顶盖。第一步，我们放入一层厚度约为50至100微米的薄膜。然后关闭工具，进入第二步。由这两块板和顶板构成的腔室被抽真空。抽真空完成后，将聚合物膜压在这两块板之间，随后加热至成形温度，进行成形。此处的温度处于玻璃化转变温度范围内，这意味着聚合物并未熔化，而是处于一种白色弹性状态或橡胶弹性状态。接下来，我们施加气体压力。这里使用氮气作为气体，通过该气体将具有橡胶弹性的聚合物膜拉伸进入先前已抽真空的微模具中。完成此成型步骤后，整个模具被冷却，然后打开模具。最后，微结构聚合物泡沫被手动脱模。该新工艺的优点在于，与传统的微注塑成型工艺或热压印工艺相比，工艺步骤数量可显著减少。在对高结晶度的聚合物薄膜进行热成型后，我们选择性地将其中的重离子径迹蚀刻成具有特定尺寸的微孔。为此，我们采用一种简单的玻璃容器装置，将含有重离子径迹的薄膜置于氢氧化钠溶液中，在温和搅拌条件下加热至约 60 °C。蚀刻过程持续约一至数小时，以获得不同孔径的微孔。现在我们有了两种成品：一种是背面带有微孔膜的热压成型细胞芯片，另一种是左手拿着的热成型薄壁柔性细胞芯片。在用于细胞培养之前，它们需经过伽马辐照进行清洁和灭菌。

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生物学

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一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

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