利用固有对比度对DNA分子进行光谱超分辨率成像
2026年3月6日
本方案详细介绍了DNA本征荧光光谱的样品制备、数据采集和分析操作。
我们的研究提出了首个用于测量DNA分子本征荧光光谱的实验方案，可实现对其天然光学特性及与序列确认相关特征的探究。该方案利用DNA的内源性荧光进行光谱成像，避免了现有方法中标记所导致的结构干扰、连接错误以及标记密度不一致等问题。首先，将DNA样品溶解于无核酸酶的去离子水中，使其终浓度为100毫摩尔。
准备5 µL的DNA储备溶液分装，以尽量减少反复冻融循环。将含有储备溶液的多余管子在4°C下保存。使用实验室擦拭纸轻轻清洁载玻片。
用移液器吸取5 µL的100 mmol/L DNA溶液，滴加到新清洗的玻片上，让样品干燥1至3小时，以形成DNA凝胶。在通风橱中，配制β-巯基乙醇缓冲液或DABCO成像缓冲液，用于支持DNA分子的随机光开关。用移液器吸取5 µL成像缓冲液，滴加到DNA凝胶上，然后在样品上覆盖盖玻片。
如果覆盖的样品内部存在气泡，请使用镊子将其去除。获取一个制备好的纳米孔阵列，该阵列包含直径为100纳米、间距为四微米的纳米孔，排列成八行五列。打开sSMLM系统，并在相机前方直接插入窄带滤光片。
将校准样品置于显微镜下，打开显微镜光源以照亮样品。对所有滤光片设置曝光时间为200毫秒，但对750纳米滤光片则更改为2,000毫秒。进入采集界面，选择快速时间序列模式，并将每个滤光片的帧数调整为10帧。
校准后，将DNA凝胶样品放置于显微镜载物台上，使盖玻片一侧朝向物镜，并打开相机软件以进行数据采集。使用自动聚焦追踪系统确定合适的Z轴位置，并调节焦点直至观察到清晰的随机闪烁信号。确保物镜不接触盖玻片边缘，以防止缓冲液渗入浸油中，干扰追踪过程。
以所需的照明功率和30毫秒的曝光时间采集约10,000到30,000帧图像。数据采集完成后，默认让软件将数据保存为nd2格式。将玻璃载玻片丢弃至指定用于破碎玻璃或尖锐物品的批准废料箱中。
根据机构安全指南，将所有剩余缓冲液弃置到指定的化学液体废物容器中。打开 Fiji 软件，使用 Bio-Formats 插件加载所获得的 DNA 样本原始图像堆栈。依次选择图像、堆栈、Z 投影，并选择最小强度作为投影类型，以生成原始图像堆栈的最小强度投影。
选择图像计算器，并从原始图像堆栈中减去最小值投影。将减去背景后的数据集保存为 TIF 文件，用于光谱分析。接下来，使用 ThunderSTORM 插件版本 1.3 对零级原始图像堆栈进行定位识别。
将阈值设为标准差波长的1.2倍，拟合半径设为3，sigma设为1.5，以重建零阶图像并提取发射事件坐标。对于裁剪后的零阶原始图像序列，选择插件后依次点击ThunderSTORM并运行分析。
使用 Fiji 和基于 MATLAB（2020b 或更高版本）的开源软件 RainbowSTORM 处理校准数据，获得水平与垂直位移和波长之间的关系。利用 ThunderSTORM 插件对五个波长的校准图像进行定位识别。将阈值设置为标准差的五倍，wave。
F1，将拟合半径设为三，σ设为1.5，以重建零级上的纳米孔定位及一级上的相应光谱定位。获取每组校准数据的平均图像，并在标准差波五到十倍的范围内调整阈值。重复F1操作，直至每幅校准图像获得80个定位。
运行 RainbowSTORM，然后在光谱校准下方点击浏览，以加载每个校准波长的 CSV 文件。接着点击保存校准文件，以存储校准文件。使用自定义的 Python 脚本版本 3.11.7 提取完整的光谱数据。
然后在 Python 脚本中设置正确的文件路径，指向前一步背景扣除操作生成的 TIF 格式背景扣除图像堆栈。设置定位分析步骤生成的定位 CSV 文件路径，以及校准步骤生成的 MAT 格式校准文件路径。随后，将水平位移设置为 925 至 984 像素，适用于使用 3D DWP 获取的 532 纳米数据，对应 525 至 750 纳米的光谱窗口，以确保覆盖 590 至 650 纳米滤光片范围之外的区域。
根据使用RainbowSTORM获得的光谱校准曲线，将基于3D DWP获取的488纳米和532纳米数据的垂直偏移调整为23像素。最后，通过三阶多项式拟合对非线性光谱进行线性化处理，以便进行后续的比较和分类分析。已执行光谱校准，从而能够测量零级与一级图像之间的相应水平和垂直像素偏移。
这使得能够在像素位置与波长之间建立校准曲线。在532纳米激发下，获得了GC alter（指一种双链DNA分子）的非线性和经转换的线性发射光谱。绿色曲线代表平均光谱。
A10C10 是一种单链 DNA 分子，在 488 纳米激发下获得了其非线性和经转换的线性发射光谱，其中蓝色曲线代表平均光谱。本方案使研究人员能够利用光谱超分辨成像技术测量合成的单链和双链 DNA 分子的本征荧光光谱。精确定位正确的 Z 位置至关重要，因为 DNA 凝胶样品缺乏结构信息，需要仔细调焦以观察其随机闪烁现象。
未来的研究可拓展至测量 RNA 和蛋白质的内在荧光，整合用于序列预测的计算模型，以及无标记染色质成像。
概述
本文介绍了一种利用光谱单分子定位显微镜（sSMLM）对DNA分子进行无标记、原位基因组成像的实验方案。该方法利用DNA的内在荧光特性，无需外源性荧光标记即可实现超分辨率成像和光谱分析，从而保留了分子的天然特性，并避免了标记所导致的假象。
关键研究组成部分
科学领域
- 超分辨率显微镜
- 基因组成像
- 光谱学
- 生物物理学
背景
- 传统的超分辨率成像依赖于荧光标记，这可能会干扰细胞功能并引入不准确性。
- 需要无标记成像方法，以在纳米尺度上实现对高密度染色质和DNA的准确可视化。
- DNA的固有荧光为非侵入性、高分辨率成像提供了潜在解决方案。
- 现有方法在标记密度的一致性方面存在困难，且可能无法捕捉到天然的光学特性。
研究目的
- 开发并演示一种利用sSMLM测量DNA分子本征荧光光谱的实验方案。
- 实现对单链和双链DNA的无标记、高分辨率成像与光谱分析。
- 提供一套完整的样品制备、数据采集与光谱校准工作流程。
使用的方法
- 通过将多核苷酸溶液干燥在玻片上制备DNA凝胶样品。
- 添加成像缓冲液（β-巯基乙醇或DABCO）以支持随机光开关。
- 采集sSMLM数据，包括零阶（空间）和一阶（光谱）图像。
- 利用纳米孔阵列和多种激发波长进行光谱校准。
- 使用Fiji、ThunderSTORM、RainbowSTORM及自定义Python脚本进行数据处理，实现定位和光谱提取。
主要结果
- 成功测量单链和双链DNA分子的本征发射光谱。
- 在不同激发波长下，展示不同类型DNA（如GC富集序列和A10C10）之间的光谱差异。
- 建立将像素位置映射到发射波长的校准曲线。
- 该方案无需外部标记即可实现精确的空间定位与光谱分析。
结论
- 该方案可实现无标记、超分辨率的DNA光谱成像，同时保持分子的天然特性。
- 该方法克服了传统标记技术的局限性，例如对样本的干扰和标记密度不一致等问题。
- 未来应用可能包括RNA、蛋白质的本征荧光成像以及无标记的染色质研究。
常见问题
行业重要性概述
利用固有荧光对DNA进行光谱超分辨率成像，可实现无标记、高分辨率的基因组物质分析，避免了外部标记所引入的伪影和不一致性。该技术通过保持分子的天然特性，提供定量且可重复的数据，支持早期发现与靶点验证。该方法在发现流程的关键转折点上增强了预测的可信度，降低了生物学解释的风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 无需标记引起的干扰，即可直接检测DNA的结构与序列。
- 通过揭示单链与双链DNA的天然光学特性，支持功能靶点的验证。
- 提供高保真、定量的光谱数据，有助于降低机制研究中的风险。
- 提高后续基因组学和染色质研究的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 为下游超分辨率工作流程制备经过验证的无标记DNA系统。
- 提供可重复的定量发射光谱，用于检测标准化。
- 实现高密度、可扩展的成像，适用于筛选应用。
- 支持对DNA序列和组成对光学特性影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过保持DNA的天然特性，契合转化生物标志物的发现需求。
- 通过实现无标记染色质成像，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 减少因标记伪影导致的临床前模型中生物学误读风险。
- 支持未来扩展至RNA和蛋白质的内在荧光研究。
流程与工作流整合
本方案贯穿从早期假设验证到先导化合物鉴定及临床前研究的整个发现过程，支持机制性研究和转化研究目标。
- 发现生物学：通过测量DNA的本征荧光和序列依赖性光谱特征，实现假设验证与通路解析。
- 筛选：提供即用型、可重复的DNA样本，用于高通量超分辨率成像。
- 分析：提供定量的空间和光谱读出结果，以实现对不同类型和条件下DNA的可靠比较。
- 转化研究：支持无标记染色质成像，促进生物标志物的匹配与转化研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的无标记成像能力，适用于多种核酸和染色质研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高DNA成像的预测置信度，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过消除标记变异性，实现工作流程标准化并增强可重复性。
- 战略价值：提供无伪影的定量数据，改善决策判断，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的优先级排序，推动基因组学与染色质研究项目的进展。
实施注意事项
- 需要具备超分辨率显微镜和光谱分析方面的专业知识。
- 需要能够使用sSMLM仪器、光谱校准工具以及高级图像分析软件。
- 需要跨团队对样品制备和数据处理流程进行标准化。
- 应用于其他核酸或蛋白质系统时，可能需要优化实验方案。
- 由于DNA凝胶缺乏结构性特征，精确对焦和校准至关重要。
