Name: 利用本征对比法对DNA分子进行光谱超分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-06T13:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解利用本征荧光对DNA分子进行无标记光谱超分辨率成像的方法。该技术通过光谱单分子定位显微镜保留天然分子特性，避免标记带来的干扰，适用于单链和双链DNA的精确光谱分析。

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本研究获得了美国国立卫生研究院资助项目 R02CA225002、U54CA261694、R01CA289294 和 U54CA268084，以及美国国家科学基金会资助项目 CBET-2430743 的支持。我们感谢西北大学郝峰教授实验室提供的双楔形棱镜装置，该装置是光谱学单分子定位显微镜系统的关键组成部分。

1. DNA凝胶样品的制备（图1A）
<ol>
	<li>将DNA样品（无论是寡核苷酸还是双链DNA）粉末溶解于无核酸酶的去离子水中，配制成终浓度为100 mM的溶液，并将储备液保存于-4 °C。</li>
	<li>分装成5 µL的等份以减少反复冻融。若使用冷冻的等份样品，根据体积在室温下解冻5-15分钟。</li>
	<li>用实验室擦拭纸轻轻清洁载玻片。用移液器吸取5 µL的100 mM DNA分子溶液滴加到 freshly cleaned 玻片上，静置蒸发1-3小时，形成DNA凝胶。</li>
	<li>为安全起见，此步骤应在通风橱中操作。根据材料表配制成像缓冲液。经验证，β-巯基乙醇缓冲液和DABCO缓冲液均能支持DNA分子的随机光开关成像。</li>
	<li>为安全起见，此步骤应在通风橱中操作。向DNA凝胶中加入5 µL成像缓冲液，并在成像前立即加盖盖玻片。封闭样品中可能会产生气泡。使用镊子去除盖玻片内的气泡。</li>
</ol>
2. sSMLM 系统的校准与数据采集（图 1B）
<ol>
	<li>制备一个纳米孔阵列，孔径为100 nm，孔间距为4 µm，排列成8行×5列，用于后续光谱SMLM系统的校准33。 
	注意：也可使用美国空军（USAF）1951分辨率测试板（R3L1S4N）进行光谱校准33。
	<ol>
		<li>通过连续金属溅射和聚焦离子束（FIB）刻蚀制备纳米孔阵列。首先，在22 mm × 22 mm的硼硅酸盐玻璃盖玻片上，采用直流溅射法在75 W功率、3 mTorr气压、20标准立方厘米/分钟（SCCM）氩气流条件下沉积一层150 nm厚的铝膜。</li>
		<li>使用聚焦离子束（FIB）刻蚀在铝层上加工出5 × 8的纳米孔阵列，加速电压为30 kV。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启光谱SMLM系统（图2），在相机前直接插入窄带滤光片（532 nm、580 nm、633 nm、680 nm和750 nm），并使用白光光源（例如显微镜灯）照射校准样品。</li>
	<li>每种滤光片下采集10帧图像。由于光源在近红外区域强度较低且相机效率较低，将532 nm、580 nm、633 nm和680 nm的曝光时间设为200 ms，750 nm的曝光时间设为2000 ms（图3）。</li>
	<li>将DNA凝胶样品置于显微镜载物台上，确保盖玻片一侧朝向物镜，并打开相机软件以进行数据采集。</li>
	<li>借助自动对焦追踪系统确定合适的z轴位置，确保可观察到清晰的随机闪烁信号。此步骤至关重要，需要耐心操作，因为DNA凝胶样品缺乏细胞结构等明显的形态学特征，难以定位到合适的信号区域。</li>
	<li>确保物镜不接触盖玻片边缘，以免缓冲液渗入浸油中，干扰对焦追踪。</li>
	<li>以典型的照明功率5 kW/cm²和曝光时间30 ms采集10,000–30,000帧图像。根据需要调整帧数、照明功率和曝光时间。采集完成后，软件将默认以nd2格式保存数据。</li>
	<li>实验结束后，按照机构安全指南，将玻璃载片放入经批准的锐器废弃物容器（例如破碎玻璃或锐器处理箱），并将所有剩余缓冲液倒入指定的化学液体废液容器中。</li>
</ol>
3. 校准与光谱数据的分析（图1C）
<ol>
	<li>使用 Bio-Formats 插件，将获取的 DNA 样本原始图像堆栈导入 FIJI（Windows 64 位）中。</li>
	<li>从图像栈中减去最小投影，以获得背景扣除后的数据集，并将其保存用于光谱分析。对于加载的原始图像栈，选择 图像 &#62; 堆叠 &#62; Z 投影 并选择 最小强度 在投影类型中。然后选择 过程 &#62; 图像计算器 从原始图像堆栈中减去最小投影，并将其保存为TIFF格式。</li>
	<li>使用 ThunderSTORM 插件（版本 1.3）对零级原始图像序列进行定位识别。采用适当参数（例如，阈值 = 1.2 × 标准差（Wave.F1），sigma = 1.5，拟合半径 = 3）重构零级图像，并提取发射事件坐标（单位：nm）。对于裁剪后的零级原始图像序列，选择 插件 &#62; ThunderSTORM &#62; 运行分析.</li>
	<li>使用 FIJI 和开源软件 RainbowSTORM（GitHub 链接在32，使用比 MATLAB 2020b 更新的版本）处理标定数据，以获得水平和垂直位移与波长之间的关系31,32.
	<ol>
		<li>使用 ThunderSTORM 插件对5个波长的校准图像进行定位识别。采用适当参数（例如，阈值 = 5 × std（Wave.F1），sigma = 1.5，拟合半径 = 3），重建零级衍射图像中纳米孔的定位及其在一级衍射图像中对应的光谱定位。</li>
		<li>将阈值（例如，在5-10 × std（Wave.F1）范围内）调整至每张校准图像均有80个定位点。</li>
		<li>运行 RainbowSTORM 并点击 光谱校准 &#62; 浏览 加载上一步中每个校准波长（532 nm、580 nm、633 nm、680 nm、750 nm）对应的 CSV 文件。点击 保存校准文件.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将基于纳米的坐标转换为像素坐标，并根据校准中确定的从零级到一级的水平和垂直偏移，将其映射到相应的光谱窗口图4），以测量DNA本征荧光的全光谱。
	<ol>
		<li>使用自定义的 Python 脚本34 （版本 3.11.7）以提取全谱数据，具体步骤如下。</li>
		<li>为步骤3.2中获得的背景扣除图像堆栈（.tiff）、步骤3.3生成的定位信息CSV文件（.csv）以及步骤3.4的校准文件（.mat）设置正确的文件路径。</li>
		<li>使用900-950像素作为3D DWP采集的488 nm数据的水平位移，对应光谱范围为484-588 nm，略宽于500-550 nm滤光片范围，以确保覆盖。</li>
		<li>使用925-984像素作为3D DWP采集的532 nm数据的水平位移，对应525-750 nm光谱窗口，该范围再次选择为比590-650 nm滤光片范围更宽。</li>
		<li>使用23像素作为488 nm和532 nm数据在3D DWP中的垂直偏移量。 
		上述数值源自使用 RainbowSTORM 获得的光谱校准曲线。完整的光谱测量所用的 Python 脚本可在34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用3对非线性光谱进行线性化，以便后续分析（比较、分类等）rd 阶多项式拟合（图3).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

本文首次提出了一种用于捕获单链和双链DNA分子全谱本征荧光的实验方案，涵盖从样品制备到数据采集及计算分析的完整流程。该方法通过利用DNA的本征荧光而非外源性探针，实现了无需标记的DNA分子超分辨率成像。原则上，该技术可拓展至固定细胞，甚至有望应用于活细胞成像，因其避免了化学标记和基于抗体的信号放大过程。细胞核内的染色质由DNA、RNA及多种蛋白质组成，远比DNA凝胶体系复杂。目前，由于DNA分子发出的光子数较低，在固定或活细胞中来自细胞核内部的随机发射信号仍难以检测。然而，已有研究报道在分离的染色体或细胞核中可检测到DNA的本征荧光信号16,24,27。但目前该方案仍局限于使用合成DNA样本的体外（in vitro）环境。相比之下，采用免疫染色法标记细胞核DNA或染色质通常涉及多个耗时步骤——包括淬灭、封闭以及一抗和二抗孵育——整个过程通常需要数小时（每个靶点约5小时）12,42，不仅增加了实验复杂性，还可能对天然染色质结构造成干扰。通过消除外源性标记物，基于本征荧光的成像技术不仅显著缩短了样品制备时间，而且避免了大体积荧光探针和抗体所引起的结构扰动与连接误差，从而实现对DNA更真实、更高精度的纳米级定位。
尽管该方案具有无需标记和概念简洁的优点，但其成功实施需要仔细关注若干关键实验细节。例如，在样品制备过程中，若DNA凝胶形成时间不足，与完全形成的凝胶相比，可检测到的单分子定位数量会减少。通常情况下，凝胶形成需要约1.5小时。如果溶液尚未完全干燥，只需稍等更长时间即可。对于22 × 22 mm的盖玻片，5 µL成像缓冲液已足够，而过多的缓冲液体积可能导致液体泄漏，从而破坏物镜的浸油界面并 adversely 影响成像性能。一旦发生泄漏，可使用实验室擦拭纸小心清除。在聚焦时，应从最低的z位置逐步升高物镜。当物镜接触浸油后，切换至微调模式，寻找频繁出现随机单分子发射事件的焦平面。若大的凝胶簇产生重叠的一级光谱而导致信号聚集，应选择另一个成像区域。
尽管该方案具有诸多优势，但在评估其适用性和性能时，仍需考虑若干重要局限性。首先，精确的光谱提取依赖于单个单分子事件之间足够的空间分离；较高的定位密度（例如来自较大的DNA凝胶簇或紧密堆积的大分子组装体）可能导致一阶光谱信号重叠，从而增加或阻碍可靠的光谱重建。其次，该方法对光学对准和焦平面稳定性较为敏感，双楔形棱镜的微小错位或偏离最佳焦平面均可能引入波长校准的系统性误差，并降低信噪比。第三，目前该方案尚未实现光谱解混，限制了其在分子密度较高或存在多种光谱重叠物种的样本中的应用。综上所述，这些因素共同界定了该方法的实际适用范围，在将本方案拓展至更复杂或更拥挤的生物体系时，应予以充分考虑。
在本实验方案中，RainbowSTORM 仅用于光谱校准，尽管该软件还提供了用于二维/三维校准、sSMLM 数据分析和图像重建的强大工具。这些分析工具非常适合在光谱超分辨率成像中将空间定位信息与光谱读数相关联，并可在本方案未来的扩展中进一步加以利用。最后，本方案原则上也可适用于其他类型的生物大分子43,44,45，例如 RNA、微管蛋白等。所检测到的光谱可进一步输入计算模型（如深度学习模型46）进行分类，从而根据不同激发条件下的本征光谱以及光物理特性预测其序列或分子结构。本研究还为无需标记、分子特异性的染色质成像铺平了道路，避免了对外源标记或天然结构变性的依赖。

超分辨率荧光显微技术——包括结构光照明显微镜（SIM）、受激发射损耗显微镜（STED）以及单分子定位显微镜（SMLM）方法，如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）——已将光学显微镜的分辨率大幅突破衍射极限1,2,3,4,5,6,7，使得前所未有地观察染色质的纳米级结构成为可能8,9,10,11,12。然而，目前用于可视化核酸结构的染色方法主要依赖于标记与DNA结合的蛋白质，而非直接标记DNA本身，或使用可能干扰天然染色质构象并影响细胞活性的小分子染料13,14。由于这些局限性，在天然、无干扰条件下开发无需标记的光学超分辨率成像方法具有重要意义。本文所述方案适用于合成的纯化单链或双链DNA核苷酸，在此类样本中可稳定检测其内源荧光；该方案未针对固定细胞或活细胞中的细胞核DNA分子成像进行优化。
由于核酸的荧光量子产率极低（在紫外光激发下约为10−4），且在室温下荧光衰减极快，长期以来被认为不具有荧光特性15，因此在飞秒光谱技术发展之前，关于DNA本征荧光（主要是荧光寿命）的研究十分罕见。人们普遍认为核苷酸在紫外光照射下仅有微弱荧光，而在可见光区域的吸收则更弱。然而，最近研究发现，在生理相关浓度下，未经修饰的核酸可在可见光激发下产生荧光16。这一现象此前可能被忽视，因为大多数核苷酸的光化学研究均在稀溶液（10–100 µM）中进行17,18,19,20，而在细胞核和染色体中，DNA的浓度可高达0.1–1 M21,22,23。更重要的是，研究观察到在可见光照射下核酸呈现随机荧光开关行为16，这为将未经修饰的核酸用作基于定位的超分辨率显微成像中的内源性对比剂奠定了基础。
在可见光激发下，已研究了生理浓度条件下核苷酸单体及简单序列的单链DNA分子的光化学特性24。此外，通过在不同耗尽条件下检测核苷酸的荧光恢复情况，已证实这些DNA分子具有随机荧光开关特性，这与基态耗尽（GSD）理论高度一致6,7。而且，由于核苷酸具有相对较高的量子产率和较低的系间窜越概率，其单分子发射事件的光子计数和闪烁持续时间与STORM中常用的外源性染料（如Alexa Fluor 647）相当，同时表现出独特的光谱特征25,26，使DNA成为高分辨率成像的理想内源性对比剂。此外，采用上一节所述的光谱回归算法，可实现对多核苷酸和线性单链DNA纤维的亚十纳米级超分辨率成像27。
为了捕获DNA本征荧光的完整光谱，我们采用双楔形棱镜（DWP）进行光谱检测，该方法可实现高通量的单分子光谱分析与成像，同时具有极低的透射损耗和波前误差28,29,30，并结合开源的光谱SMLM分析软件（RainbowSTORM）实现自动化的数据处理31,32。基于这一技术能力，我们开发了一个集成了光谱检测与专用光谱分析流程的多激光SMLM平台。本文所呈现的实验方案涵盖了样品制备、数据采集与分析全过程，为在单分子定位显微镜中利用DNA本征荧光提供了一套可重复的工作流程。该方法不仅实现了对单链寡核苷酸和双链DNA分子在无标记条件下以本征对比度成像的概念验证研究，还为DNA在天然、无标记状态下的更广泛成像应用奠定了基础，例如结合计算方法，基于DNA的本征荧光进行序列预测。

<table><tbody><tr><td>488 nm 发射滤光片用于成像</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/50M</td><td></td></tr><tr><td>532 nm带通滤光片用于校准</td><td>Thorlabs</td><td>FL532-3</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 发射滤光片用于成像</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET620/60M</td><td></td></tr><tr><td>580 nm 带通滤光片用于校准</td><td>Thorlabs</td><td>FB580-10</td><td></td></tr><tr><td>用于校准的633 nm带通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FL632.8-3</td><td></td></tr><tr><td>680 nm 带通滤光片用于校准</td><td>Thorlabs</td><td>FB680-10</td><td></td></tr><tr><td>750 nm 带通滤光片用于校准</td><td>Thorlabs</td><td>FB750-10</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>BME成像缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>7 &amp;mu;L GLOX, 7 &amp;mu;L 巯基乙醇和 690 &amp;mu;L-葡萄糖缓冲液</td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>DABCO（1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷）</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td></td></tr><tr><td>DABCO 成像缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>65 mM DABCO + 30 mM 亚硫酸钠 + 30 mM DTT 1 M&amp;nbsp; 在无DNA酶、无RNA酶的去离子水中。亚硫酸钠应溶解于PBS 10中&amp;times; 在配制成像缓冲液之前，将其浓度调整至 1 M。</td></tr><tr><td>用于光谱学SMLM的DNA去凝聚</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>20个碱基对的双链GC_alter、GC_conti、AT_alter和AT_conti。&lt;br/&gt; 例如，GC_alter 的两条链均为 5&amp;rsquo; - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3&amp;rsquo;；GC_conti 的一条链为 5&amp;rsquo; - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3&amp;rsquo; 以及另一个作为5&amp;rsquo; - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3&amp;rsquo;&lt;br/&gt; 所有样品均符合HPLC标准。</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸/双链DNA</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>用于光谱学SMLM的DNA寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>20碱基A、G、C、T；40碱基单链AC序列（A1C1、A5C5、A10C10、A20C20）；&amp;nbsp; 单链5、8、12、16碱基鸟嘌呤&lt;br/&gt; 例如，A10C10 是&lt;br/&gt; 5'- AAAAAAAAAACCCCC&lt;br/&gt; CCCCCAAAAAAAA&lt;br/&gt; AACCCCCCCCCC - 3&#039;&lt;br/&gt; 所有样品均符合HPLC标准。</td></tr><tr><td>无DNase/RNase蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇）</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>GLOX</td><td>NA</td><td>NA</td><td>14 mg 葡萄糖氧化酶，50 &amp;mu;L 过氧化氢酶（17 mg/ml）+ 200 &amp;mu;L缓冲液A，即10 mM Tris（pH 8.0）和50 mM NaCl。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>50 mM Tris（pH 8.0）、50 mM NaCl 和 10% 葡萄糖。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>sigma</td><td>G7141</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖，粉末</td><td>Thermo Fisher</td><td>15023021</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10倍浓度）</td><td>Thermo Fisher</td><td>J62036.K3</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×）</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>424290010</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>Tris (1 M) pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr></tbody></table>

利用固有对比度对dna分子进行光谱超分辨率成像

Spectroscopic Super-resolution Imaging of DNA Molecules using Intrinsic Contrast

超分辨率成像技术通过揭示纳米尺度的结构细节，彻底改变了生物学研究。目前大多数光学超分辨率方法依赖于生物分子的荧光标记，这种方法能够特异性地标记特定分子种类，但可能干扰细胞功能，由连接分子引入误差，并且难以在单个DNA分子尺度上实现染色质成像所需的稳定高密度标记。一种能够实现无标记、原位（in situ）基因组成像并具备纳米级分辨率的技术，将对生物学产生深远影响。本文介绍了一种利用DNA本征荧光进行光谱单分子定位显微镜（sSMLM）成像的实验方案。该方案详细描述了样品制备、数据采集和光谱分析过程。简而言之，通过将多核苷酸溶液滴加到玻璃表面并静置数小时使其干燥，形成一层薄DNA凝胶。凝胶形成后，在成像缓冲液存在下使用sSMLM对样品进行成像。所记录的数据集包含零阶图像（提供空间定位信息）和一阶图像（编码每个定位点的发射光谱）。首先基于零阶数据生成空间重构图像，随后从一阶信号中提取对应的光谱信息。最后，我们通过多种激发波长以及不同长度、序列和组成的DNA分子，验证了该方法的可行性。

从样品制备到数据采集和分析的完整流程——针对一个DNA样品的一组图像堆栈——大约需要120分钟，假设DNA凝胶形成需要1小时（图1）。解冻、凝胶形成和光谱校准的总时间固定在约90分钟，与实验中图像或样品的数量无关。为了提高效率，我们建议在一次实验中对多个样品采集多组图像堆栈。
在DWP之后获得的代表性实时图像如图1B和图3A所示，其中荧光信号被分为零级衍射（左侧，包含空间信息）和一级衍射（右侧，包含光谱信息）。在图1B中，图像采用2D DWP配置采集，此时零级与一级衍射图像之间的间距相对较小。相比之下，图3A显示的是使用3D DWP配置采集的数据，由于双平面3D成像所需的工程化光程差，两个衍射级次被更明显地分离开。所有在图1C、图3和图4中展示的数据均采用3D DWP配置采集。2D与3D成像的选择取决于实验目的：对于合成DNA样品的本征荧光光谱测量，通常优先采用2D DWP，因为这些样品不具有相关的三维结构特征；然而，当需要轴向信息时，也可使用3D DWP配置。
综上所述，这些代表性结果展示了基于DWP的成像平台的核心能力，即能够实时同时解析单个DNA分子的空间定位和发射光谱。系统性能良好的标志是零级空间图像与一级光谱色散图像之间具有清晰且稳定的分离，零级图像中的每个单分子定位均对应一级图像中一条独立的光谱轨迹。通过在零级图像中识别孤立的单分子事件，测量相应一级信号的相对像素位移，并利用校准后的映射函数将该位移转换为波长，从而进行定量光谱分析。由于像素位移与发射波长之间的关系呈非线性，需采用三阶多项式拟合，以从原始数据中准确重建线性发射光谱28。所得的单分子光谱可进一步整合到计算分析流程中，包括机器学习或深度学习模型，从而基于不同激发条件下和不同光物理状态下的固有荧光特征，实现光谱分类以及对DNA序列组成或分子结构的推断。
本方案中展示的所有数据均使用基于β-巯基乙醇的成像缓冲液收集35。原则上，任何能够增强荧光团光开关行为的成像缓冲液均适用于该方法，例如基于DABCO的成像缓冲液36。测试的DNA分子包括20个碱基的单链A、G、C、T；40个碱基的单链AC链（A1C1、A5C5、A10C10、A20C20）；5、8、12、16个碱基的单链鸟嘌呤；20个碱基对的双链GC和AT（详见材料表中的详细信息）。选择20和40个碱基的DNA结构是基于观察结果：40个碱基的DNA链呈现紧凑构象，其有效尺寸小于40 × 3.4 = 13.6 nm，低于重建的SMLM图像的分辨率极限。激发波长（488 nm和532 nm）并未针对特定序列进行唯一优化，而是为了证明使用任一波长均可在不同碱基组成和构象状态下稳健检测到DNA的本征荧光。我们测试了如补充图1所示的成像缓冲液，发现几乎未检测到随机闪烁信号，从而排除了缓冲液组分和玻璃表面处理的影响。只有DNA凝胶与成像缓冲液组合时才出现大量闪烁信号。玻璃载片和盖玻片保持清洁并经过小心处理，样品凝胶在封闭环境中形成。因此，检测到的信号不太可能来源于杂质或基底自荧光。我们还测量了干燥凝胶和DNA溶液的信号，两者之间无显著差异，因此干燥过程中的光化学伪影并非信号的主要来源。光降解产物通常表现出宽谱发射且不具备闪烁特性，这在本研究中从未观察到。检测的定量极限以定位事件的最小光子计数反映，为30–50[光子计数]。该值在DNA样品和标记系统（如固定细胞中AF647标记的H3K9me3）中保持一致。DNA本征荧光的平均定位精度约为15–25 nm，而AF647的定位精度约为10–15 nm。
在二维情况下，重建的SMLM图像像素尺寸为22 nm。随机发射事件定位的精度平均约为20 nm，该值描述了单分子定位位置的置信区间。然而，用于检测本征荧光的样品不具有生物结构，因此无法解释其结构分辨率。相干拉曼散射显微技术的分辨率据报道为250 - 300 nm37，而紫外双光子显微技术的分辨率为300 nm38。相干拉曼散射成像的信噪比在10 - 100量级39，而紫外双光子显微技术的信噪比为2 - 20（通常表示为信号与双标准差之比，SSDR）40,41。使用sSMLM检测DNA本征荧光时，信噪比约为5，这是由于光子计数较低以及相机检测噪声带来的限制所致。
<img alt="DNA SMLM 研究的样品制备与分析流程；包括光谱数据采集。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69917/69917fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 1"> 
图 1：工作流程及预估耗时。（A）样品制备包括解冻储备液、制备 DNA 凝胶以及添加成像缓冲液。总耗时因样品和环境不同而异，通常为 1–3 小时。（B）每次采集均需使用专门设计的纳米孔阵列样品进行校准。总校准时间约为 20 分钟，单次图像堆栈的数据采集时间约为 10 分钟，包括样品定位（10,000 帧，曝光时间为 50 ms）。（C）分析流程包括在 FIJI 中进行预处理以及在 Python 中进行光谱分析。FIJI 中的预处理约需 10 分钟，而使用已建立的代码进行光谱分析速度较快。所示光谱数据来自 16 个碱基的鸟嘌呤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69917/69917fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多波长激光输入的光学激发装置示意图；包含双楔形棱镜和物镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69917/69917fig2.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图2"> 
图2：光学原理图。 四束激光（405 nm、488 nm、532 nm、647 nm）通过激光准直系统导入倒置显微镜，使系统稳定且易于操作。双楔形棱镜（DWP）置于sCMOS相机前方，实现光谱单分子检测。在对DWP进行校准时，需在相机与DWP之间插入滤光轮。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69917/69917fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在532、633、750 nm处具有水平偏移的光激发实验示意图及校准图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69917/69917fig3.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图3"> 
图3：光谱校准。所使用的校准波长为532 nm、580 nm、633 nm、680 nm和750 nm。通过依次将具有这些中心波长的窄带滤光片放置在DWP之后和相机之前，可以测量不同波长对应水平和垂直偏移，从而建立像素位置与波长之间的校准曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69917/69917fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Emission spectra analysis under 532nm and 488nm; nonlinear vs. linear conversion graphs." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69917/69917fig4.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="Figure 4"> 
图4：在532 nm和488 nm激发下，选定的双链与单链DNA分子的光谱。 (A - B) GC_alter 的非线性和线性光谱，GC_alter 指一种双链 DNA 分子，其两条链均为 20 个碱基的 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'。高亮的绿色光谱表示平均曲线。C - D) A 的非线性和线性光谱10C10，指一种单链DNA分子，长度为40个碱基，包含重复的10个腺嘌呤和10个胞嘧啶（5'- AAAAAAAAAACCCCCCCCCCAAAAAAAAAACCCCCCCCCC-3'）。高亮的蓝色光谱显示平均曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69917/69917fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：内源性DNA荧光的对照实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69917/S.%20Figure%201_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细介绍了DNA本征荧光光谱的样品制备、数据采集和分析操作。

利用固有对比度对DNA分子进行光谱超分辨率成像

超分辨率成像通过揭示纳米尺度的结构细节，彻底改变了生物学研究。大多数光学超分辨率方法……

我们的研究提出了首个用于测量DNA分子本征荧光光谱的实验方案，可实现对其天然光学特性及与序列确认相关特征的探究。该方案利用DNA的内源性荧光进行光谱成像，避免了现有方法中标记所导致的结构干扰、连接错误以及标记密度不一致等问题。首先，将DNA样品溶解于无核酸酶的去离子水中，使其终浓度为100毫摩尔。准备5 µL的DNA储备溶液分装，以尽量减少反复冻融循环。将含有储备溶液的多余管子在4°C下保存。使用实验室擦拭纸轻轻清洁载玻片。用移液器吸取5 µL的100 mmol/L DNA溶液，滴加到新清洗的玻片上，让样品干燥1至3小时，以形成DNA凝胶。在通风橱中，配制β-巯基乙醇缓冲液或DABCO成像缓冲液，用于支持DNA分子的随机光开关。用移液器吸取5 µL成像缓冲液，滴加到DNA凝胶上，然后在样品上覆盖盖玻片。如果覆盖的样品内部存在气泡，请使用镊子将其去除。获取一个制备好的纳米孔阵列，该阵列包含直径为100纳米、间距为四微米的纳米孔，排列成八行五列。打开sSMLM系统，并在相机前方直接插入窄带滤光片。将校准样品置于显微镜下，打开显微镜光源以照亮样品。对所有滤光片设置曝光时间为200毫秒，但对750纳米滤光片则更改为2,000毫秒。进入采集界面，选择快速时间序列模式，并将每个滤光片的帧数调整为10帧。校准后，将DNA凝胶样品放置于显微镜载物台上，使盖玻片一侧朝向物镜，并打开相机软件以进行数据采集。使用自动聚焦追踪系统确定合适的Z轴位置，并调节焦点直至观察到清晰的随机闪烁信号。确保物镜不接触盖玻片边缘，以防止缓冲液渗入浸油中，干扰追踪过程。以所需的照明功率和30毫秒的曝光时间采集约10,000到30,000帧图像。数据采集完成后，默认让软件将数据保存为nd2格式。将玻璃载玻片丢弃至指定用于破碎玻璃或尖锐物品的批准废料箱中。根据机构安全指南，将所有剩余缓冲液弃置到指定的化学液体废物容器中。打开 Fiji 软件，使用 Bio-Formats 插件加载所获得的 DNA 样本原始图像堆栈。依次选择图像、堆栈、Z 投影，并选择最小强度作为投影类型，以生成原始图像堆栈的最小强度投影。选择图像计算器，并从原始图像堆栈中减去最小值投影。将减去背景后的数据集保存为 TIF 文件，用于光谱分析。接下来，使用 ThunderSTORM 插件版本 1.3 对零级原始图像堆栈进行定位识别。将阈值设为标准差波长的1.2倍，拟合半径设为3，sigma设为1.5，以重建零阶图像并提取发射事件坐标。对于裁剪后的零阶原始图像序列，选择插件后依次点击ThunderSTORM并运行分析。使用 Fiji 和基于 MATLAB（2020b 或更高版本）的开源软件 RainbowSTORM 处理校准数据，获得水平与垂直位移和波长之间的关系。利用 ThunderSTORM 插件对五个波长的校准图像进行定位识别。将阈值设置为标准差的五倍，wave。F1，将拟合半径设为三，σ设为1.5，以重建零级上的纳米孔定位及一级上的相应光谱定位。获取每组校准数据的平均图像，并在标准差波五到十倍的范围内调整阈值。重复F1操作，直至每幅校准图像获得80个定位。运行 RainbowSTORM，然后在光谱校准下方点击浏览，以加载每个校准波长的 CSV 文件。接着点击保存校准文件，以存储校准文件。使用自定义的 Python 脚本版本 3.11.7 提取完整的光谱数据。然后在 Python 脚本中设置正确的文件路径，指向前一步背景扣除操作生成的 TIF 格式背景扣除图像堆栈。设置定位分析步骤生成的定位 CSV 文件路径，以及校准步骤生成的 MAT 格式校准文件路径。随后，将水平位移设置为 925 至 984 像素，适用于使用 3D DWP 获取的 532 纳米数据，对应 525 至 750 纳米的光谱窗口，以确保覆盖 590 至 650 纳米滤光片范围之外的区域。根据使用RainbowSTORM获得的光谱校准曲线，将基于3D DWP获取的488纳米和532纳米数据的垂直偏移调整为23像素。最后，通过三阶多项式拟合对非线性光谱进行线性化处理，以便进行后续的比较和分类分析。已执行光谱校准，从而能够测量零级与一级图像之间的相应水平和垂直像素偏移。这使得能够在像素位置与波长之间建立校准曲线。在532纳米激发下，获得了GC alter（指一种双链DNA分子）的非线性和经转换的线性发射光谱。绿色曲线代表平均光谱。A10C10 是一种单链 DNA 分子，在 488 纳米激发下获得了其非线性和经转换的线性发射光谱，其中蓝色曲线代表平均光谱。本方案使研究人员能够利用光谱超分辨成像技术测量合成的单链和双链 DNA 分子的本征荧光光谱。精确定位正确的 Z 位置至关重要，因为 DNA 凝胶样品缺乏结构信息，需要仔细调焦以观察其随机闪烁现象。未来的研究可拓展至测量 RNA 和蛋白质的内在荧光，整合用于序列预测的计算模型，以及无标记染色质成像。

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利用本征对比法对DNA分子进行光谱超分辨率成像

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。...

细菌分裂机器的超分辨率成像

新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。...

DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

本方法学的总体目标是从样品制备到图像采集与重建，提供最佳实验条件，以在固定细胞中实现微管和中间丝的二维双色dSTORM成像。...

利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

本文详细描述了如何构建一种高度倾斜扫描瓦片（HIST）显微镜，并介绍了其在单分子成像中的应用。...

构建高倾斜扫描瓦片显微镜以实现大视野单分子成像的指南

用于研究人类原代细胞核结构的3D多色DNA FISH技术

本实验方案描述了一种利用单分子定位显微镜数据、已知体积、基因组大小和细胞周期阶段，通过沃罗诺伊图（Voronoi...

使用单分子定位显微镜绘制细胞核中DNA的绝对密度图

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。...

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。...

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

了解利用本征荧光对DNA分子进行无标记光谱超分辨率成像的方法。该技术通过光谱单分子定位显微镜保留天然分子特性，避免标记带来的干扰，适用于单链和双链DNA的精确光谱分析。

利用固有对比度对DNA分子进行光谱超分辨率成像

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