Name: 体外 调控T细胞的功能分析：聚焦增殖与分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-09T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习体外调节性T细胞功能分析方法，通过流式细胞术同时评估效应T细胞增殖与Th1、Th17分化。该方案为研究Treg介导的免疫调控及自身免疫疾病治疗策略提供可靠工具。

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本工作由四川省科技计划（编号：2026NSFSC0940）、四川大学华西医院学科卓越发展“1·3·5”计划（编号：ZYYC25010）以及中国博士后科学基金会（编号：2025M781396）资助。D.Z. 衷心缅怀于2018年逝世的 Sang-A Park 博士。实验流程图使用 BioRender.com 制作。

所有小鼠实验均经四川大学华西医院动物伦理委员会批准（批准号：20250814006、20211212A）。本实验所用小鼠均为C57BL/6遗传背景。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的1× PBS。</li>
	<li>配制磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：含0.5% BSA和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1× PBS。</li>
	<li>配制细胞培养基：RPMI 1640培养基，含10%胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、55 µM β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。</li>
</ol>
2. C57BL/6小鼠淋巴细胞的制备
<ol>
	<li>在无菌条件下取一只6–8周龄的C57BL/6小鼠（雄性或雌性）的脾脏和外周淋巴结，放入含有5 mL FACS缓冲液的50 mL离心管中。 
	注意：脾脏和淋巴结的解剖应按照标准操作程序进行。</li>
	<li>将70 µm细胞筛置于50 mL离心管上，然后将脾脏和淋巴结放在筛网上，使用5 mL注射器活塞轻轻研磨组织1分钟。研磨过程中，用FACS缓冲液冲洗筛网3次。确保将所有组织完全研磨，并将细胞冲洗至离心管中。研磨完成后，移除细胞筛。</li>
	<li>在4 °C下以350 × g离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL红细胞裂解缓冲液中，在室温下静置3–5分钟。</li>
	<li>立即向离心管中加入FACS缓冲液至总体积达15–20 mL，以终止裂解反应，然后在4 °C下以350 × g离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入10 mL FACS缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液，使用台盼蓝染色法计数总活淋巴细胞数。 
	注意：这些细胞为CD45.2+淋巴细胞。</li>
</ol>
3. CD45.1 小鼠淋巴细胞的制备
<ol>
	<li>在无菌条件下取一只6–8周龄CD45.1小鼠（无论雄性或雌性）的脾脏和淋巴结，并将其放入含有5 mL FACS缓冲液的50 mL离心管中。</li>
	<li>按照上述相同步骤制备CD45.1小鼠的淋巴细胞。 
	注意：这些细胞为CD45.1+淋巴细胞。</li>
</ol>
4. CD45.2+CD4+CD62L+ 初始T细胞的制备
注意：整个过程使用MACS的CD4+CD62L+ T细胞分离试剂盒。MACS缓冲液预先冷却至4 °C，所有离心条件均为4 °C、350 × g 离心7分钟。
<ol>
	<li>收集来自 C57BL/6 小鼠的细胞悬液，离心并弃去上清液，每 1 × 108 初始总细胞向离心管中加入 400 µL MACS 缓冲液和 100 µL CD4+ T 细胞生物素标记抗体混合物。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 5 分钟。</li>
	<li>每 1 × 108 初始总细胞，向第 4.1 步的离心管中加入 300 µL MACS 缓冲液和 200 µL 抗生物素微珠。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入 10 mL MACS 缓冲液，离心并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 2 mL MACS 缓冲液中。</li>
	<li>将 LS 柱置于相应的 MACS 分选磁性分离器上。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗柱子。等待柱内缓冲液完全流尽后，再进行下一步操作。 
	注意：LS 柱的最大细胞载量为 2 × 109 个细胞（包括阳性与阴性细胞），其可捕获的阳性细胞最大数量为 1 × 108 个。通常，单只小鼠在此步骤中仅需使用一个 LS 柱。</li>
	<li>将第 4.3 步获得的细胞悬液加载到 LS 柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用 3 mL MACS 缓冲液洗涤柱子。将所有穿流液收集至一个新的 15 mL 离心管中。 
	注意：这些为总 CD4+CD25– T 细胞。</li>
	<li>对第 4.5 步获得的总 CD4+CD25– T 细胞进行离心，弃去上清液，获得细胞沉淀。</li>
	<li>每 1 × 108 初始总细胞，向细胞沉淀中加入 800 µL MACS 缓冲液和 200 µL CD62L 微珠。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>向离心管中加入 10 mL MACS 缓冲液，离心并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 500 µL MACS 缓冲液中。</li>
	<li>将 MS 柱置于相应的 MACS 分选磁性分离器上，并用 1 mL MACS 缓冲液冲洗柱子。</li>
	<li>将细胞悬液加载到 MS 柱上。当悬液完全流入柱内后，用 1 mL MACS 缓冲液洗涤柱子两次。</li>
	<li>将 MS 柱从磁性分离器上取下，置于一个新的 15 mL 离心管上。向柱中加入 1 mL MACS 缓冲液，并立即用力推动推杆，以洗脱被磁珠标记的细胞。</li>
	<li>计数细胞，离心并弃去上清液，将细胞重悬于适量培养基中，并将离心管置于冰上。 
	注意：这些细胞为 CD45.2+CD4+CD62L+ 初始 T 细胞。通常，每只小鼠可纯化获得约 8 × 106 至 1 × 107 个 CD4+CD25–CD62L+ 初始 T 细胞；若包含外周淋巴结，可提高得率。</li>
	<li>测定分离细胞的纯度：取 5 × 104 个分离得到的 CD4+CD62L+ T 细胞，重悬于 1.5 mL 离心管中的 50 µL 抗体溶液中。 
	注意：通过将抗小鼠 CD4 PerCP-Cy5.5 抗体、抗小鼠 CD62L FITC 抗体和抗小鼠 CD25 PE 抗体以 1:100 的比例加入 FACS 缓冲液中，制备抗体溶液。</li>
	<li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟后，加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>通过流式细胞术检测样品纯度。 
	注意：有关流式细胞仪分析的详细信息，请参阅仪器用户手册或先前报道的实验方案14。分离的 T 细胞样品中 CD4+CD25–CD62L+ 初始 T 细胞的纯度应高于 95%（图 2）。</li>
</ol>
5. CD45.1+CD4+CD25+ 调节性T细胞富集细胞与抗原提呈细胞富集的非CD4+细胞的制备
注意：整个过程使用MACS用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒，该试剂盒的说明书已优化，可同时获得富含抗原呈递细胞（APC）的非CD4+细胞和富含CD4+CD25+ Treg的细胞。MACS缓冲液预先冷却至4 °C，所有离心条件均为4 °C、350 × g离心7分钟。
<ol>
	<li>收集来自CD45.1小鼠的细胞悬液，离心后弃去上清液，按每1 × 108个初始总细胞加入400 µL预冷的MACS缓冲液和100 µL CD4+CD25+调节性T细胞生物素抗体混合液至离心管中。轻轻混匀，于4 °C避光孵育10分钟。</li>
	<li>无需洗涤，直接向第5.1步的离心管中按每1 × 108个初始总细胞加入380 µL预冷的MACS缓冲液、200 µL抗生物素微珠和20 µL CD25-PE抗体。轻轻混匀，于4 °C避光孵育15分钟。</li>
	<li>向离心管中加入10 mL MACS缓冲液，离心后弃去上清液，然后按每1 × 108个初始总细胞将细胞沉淀重悬于500 µL MACS缓冲液中。</li>
	<li>将LD柱置于相应的MACS分选磁性分离器上，用2 mL MACS缓冲液冲洗柱子。待柱内缓冲液完全流尽后再进行下一步操作。</li>
	<li>将第5.3步所得细胞悬液缓慢加至LD柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用2 mL MACS缓冲液洗涤柱子2次。将所有穿流液收集至一个新的15 mL离心管中。</li>
	<li>从磁性分离器上取下LD柱，置于一个新的15 mL离心管上。向LD柱中加入3 mL MACS缓冲液，立即用力推动柱塞，以挤出被微珠标记的非CD4+细胞。计数细胞，离心后将细胞沉淀重悬于适量细胞培养基中，使细胞浓度达到1 × 107 cells/mL，并将离心管置于冰上。 
	注：这些非CD4+细胞主要由巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等抗原呈递细胞（APC）组成。在本实验方案中，这些细胞作为APC富集的非CD4+组分使用。</li>
	<li>将第5.5步收集的全部CD4+ T细胞离心，弃去上清液，获得细胞沉淀。</li>
	<li>按每1 × 108个初始总细胞向细胞沉淀中加入900 µL MACS缓冲液和100 µL抗PE微珠。轻轻混匀，于4 °C避光孵育15分钟。</li>
	<li>将MS柱置于相应的MACS分选磁性分离器上，用500 µL预冷的MACS缓冲液冲洗柱子。待柱内缓冲液完全流尽后再进行下一步操作。</li>
	<li>将第5.8步所得细胞悬液缓慢加至MS柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用1 mL MACS缓冲液洗涤柱子2次。将穿流液收集至一个新的15 mL离心管中。 
	注：此时穿流液中的细胞为CD4+CD25– T细胞。</li>
	<li>将MS柱从磁性分离器上取下，置于一个新的15 mL离心管上方。向柱中加入1 mL MACS缓冲液，然后迅速下压柱塞，以回收被磁珠标记的CD4+CD25+调节性T细胞富集组分。</li>
	<li>计数细胞后，离心细胞悬液并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于适量培养基中，使最终细胞浓度为2 × 106 cells/mL，并将离心管置于冰上。 
	注：这些细胞为CD45.1+CD4+CD25+调节性T细胞富集组分。通常，每只小鼠可纯化获得约8 × 105至1 × 106个CD4+CD25+细胞；若加入外周淋巴结，可提高得率。</li>
	<li>测定分离所得CD4+CD25+调节性T细胞富集组分的纯度：分别取5 × 104个分离的CD4+CD25+调节性T细胞富集细胞和5 × 104个分离的APC富集非CD4+细胞，重悬于50 µL抗体溶液中。 
	注：通过将抗小鼠CD4 PerCP-Cy5.5抗体和抗小鼠CD25 PE抗体按1:100比例加入FACS缓冲液中配制抗体溶液。此处使用相同的抗小鼠CD25 PE抗体以确认CD4+CD25+细胞已充分标记，且非CD4+组分中无CD4+CD25+ T细胞残留。如需更严格地鉴定调节性T细胞，还可进行抗小鼠Foxp3 PB抗体的细胞内染色。</li>
	<li>于4 °C避光孵育20分钟后，加入2 mL FACS缓冲液洗涤细胞。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中。</li>
	<li>通过流式细胞术检测样品纯度。 
	注：CD4+CD25+细胞的比例应≥ 95%，以确保调节性T细胞富集群体的纯度满足实验要求（图2）。作为APC富集组分使用的非CD4+细胞中，CD4+ T细胞比例不应超过5%（图2）。</li>
</ol>
6. 使用细胞增殖染料标记初始型 CD4+ T 细胞
注意：所有离心条件均为 4 °C、350 × g 离心 7 分钟。使用前将 PBS 缓冲液预平衡至室温。标记过程需避光操作，以避免染料淬灭。
<ol>
	<li>取初始CD4+ T细胞悬液，离心后弃去上清液，收集细胞沉淀。</li>
	<li>用PBS稀释细胞增殖染料eFluor 450，于室温下配制浓度为20 µM的染料溶液。</li>
	<li>每1 × 107个细胞加入0.5 mL PBS。将离心管倾斜约45°，通过上下吹打50次，轻柔重悬细胞。</li>
	<li>迅速向细胞悬液中加入等体积的细胞增殖染料溶液，使染料终浓度为10 µM。保持离心管倾斜约45°，通过上下吹打50次混匀细胞，确保细胞与增殖染料充分接触。</li>
	<li>立即用铝箔包裹离心管以避光，于室温孵育20分钟。每隔5分钟轻轻涡旋振荡一次，防止细胞聚集。</li>
	<li>向离心管中加入10 mL预冷的细胞培养基，轻轻涡旋以终止染色反应，随后离心并弃去上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基，离心后弃去上清液，以洗涤细胞。</li>
	<li>再次向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基，并重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，离心后弃去上清液，用适量培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2 × 106 cells/mL，并将离心管置于冰上保存。</li>
</ol>
7. 设置 体外 Treg细胞的功能分析
<ol>
	<li>计算细胞培养所需的样本数量，准备适量含有 2.5 µg/mL 抗小鼠 CD3 抗体或指定诱导细胞因子的细胞培养基，并轻轻涡旋混匀已制备的 CD45.2+CD4+CD62L+ 初始 T 细胞、CD45.1+CD4+CD25+ 富集的调节性 T 细胞（Treg）以及富集的非 CD4+ 抗原呈递细胞（APC）。 
	注意：使用 CD45.2+CD4+CD62L+ 初始 T 细胞作为反应性 T 细胞（Tresp）。本示例实验旨在研究 Treg 细胞对 Th1 和 Th17 细胞分化与增殖的影响。因此，细胞培养共设四个样本：在 Th1 或 Th17 诱导条件下培养的 Tresp 细胞，分别在有或无 Treg 富集细胞存在的情况下进行培养。</li>
	<li>向 48 孔板中每孔加入 100 µL CD45.2+CD4+ 初始 T 细胞（每孔 2 × 105 个细胞）。</li>
	<li>向 48 孔板中每孔加入 100 µL CD45.1+ 富集的非 CD4+ APC 细胞（每孔 1 × 106 个细胞）。</li>
	<li>向实验孔中加入 100 µL CD45.1+CD4+CD25+ 富集的 Treg 细胞（每孔 2 × 105 个细胞），向对照孔中加入 100 µL 细胞培养基。实验样本中 Treg 富集细胞与 Tresp 细胞的比例为 1:1。 
	注意：可根据需要设定 Treg 细胞与 Tresp 细胞的比例，或设计多个不同比例的实验组。共培养体系中 Tresp 细胞数量固定，Treg 细胞数量可根据需要调整。通常实验样本中 Treg 与 Tresp 的比例包括 1:1、1:2、1:4、1:8、1:16 和 0:1。&#160;此外，每个实验条件可设置三个重复孔，以减少随机实验误差。&#160;此处为清晰起见，基于既往研究经验15,16，以 1:1 比例为例进行说明。</li>
	<li>向每孔加入 100 µL 含 2.5 µg/mL 抗小鼠 CD3 抗体的细胞培养基。 
	注意：抗小鼠 CD3 抗体的终浓度为 0.5 µg/mL。除实验样本外，需设置不含抗小鼠 CD3 抗体的空白对照样本。在该样本中加入 100 µL 不含抗小鼠 CD3 抗体的 T 细胞培养基，用于测定未增殖 T 细胞的荧光强度，或峰 0 的强度，从而准确校准增殖分布情况。</li>
	<li>向每孔加入含指定细胞因子的细胞培养基 100 µL，使每孔终体积为 500 µL。 
	注意：本实验中，使用终浓度为 10 ng/mL 的重组小鼠 IL-12 p70 诱导 Th1 细胞，使用终浓度为 2 ng/mL 的重组人 TGF-β1 和 50 ng/mL 的重组小鼠 IL-6 诱导 Th17 细胞。</li>
	<li>向其余空孔中加入 PBS（每孔 500 µL），以维持培养板内湿度，减少边缘效应。</li>
	<li>将 48 孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 3 天。 
	注意：在此共培养体系中，可溶性抗小鼠 CD3 抗体提供 T 细胞活化的初始 T 细胞受体（TCR）信号，而富集的非 CD4+ APC 细胞提供共刺激信号，以实现 T 细胞的完全活化。TCR 与共刺激信号也可通过包被于培养板的抗小鼠 CD3 抗体及可溶性抗小鼠 CD28 抗体触发。研究人员可根据需要选择合适的刺激方式。</li>
</ol>
8. 体外 Treg细胞的功能分析
注意：所有离心条件均为 4 °C、350 × g 离心 7 分钟。
<ol>
	<li>轻轻吹打培养的细胞使其重悬，并将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。离心后弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入500 µL含有5 ng/mL PMA、1 µg/mL离子霉素和1:1,000稀释的GolgiPlug蛋白转运抑制剂的细胞培养基，轻轻涡旋混匀以重悬细胞，然后在37 °C、5% CO2培养箱中孵育3小时。</li>
	<li>离心后弃去上清液，向每个样本中加入50 µL含一测试量Zombie Yellow染料和1:100稀释的抗小鼠CD16/32抗体的PBS溶液，涡旋混匀，并在室温避光条件下孵育15分钟，以标记死细胞并阻断Fc受体。</li>
	<li>离心后弃去上清液，加入50 µL表面抗体混合液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育20分钟。 
	注：将抗CD4 PerCP-Cy5.5抗体、抗CD45.1 FITC抗体和抗CD45.2 APC-eFluor 780抗体按1:200比例加入FACS缓冲液中，配制表面抗体混合液。</li>
	<li>向每根离心管中加入1 mL FACS缓冲液，离心后弃去上清液。</li>
	<li>向每根离心管中加入300 µL固定和破膜溶液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育20分钟。</li>
	<li>向每根离心管中加入1 mL 1×破膜/洗涤（Perm/Wash）缓冲液，离心后弃去上清液；重复此洗涤步骤一次，以确保彻底去除残留的固定剂。</li>
	<li>向每管中加入50 µL细胞因子抗体混合液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育40分钟。 
	注：将抗IFN-γ PE抗体和抗IL-17A PE-Cy7抗体按1:100比例加入Perm/Wash缓冲液中，配制细胞因子抗体混合液。</li>
	<li>用1 mL Perm/Wash缓冲液洗涤每个样本，离心后弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中。</li>
	<li>通过流式细胞术检测Tresp细胞的增殖与分化情况。采用以下设门策略（图3）：首先，在总细胞中圈选淋巴细胞群体，排除细胞碎片和杂质；其次，根据散射光信号在淋巴细胞中圈选单细胞群体；第三，在单细胞中圈选活细胞群体；第四，在活细胞中圈选CD4+ T细胞群体；第五，在CD4+ T细胞中分别圈选CD45.1+ Treg富集细胞群体和CD45.2+ Teff细胞群体；第六，在CD45.2+ T细胞中进一步圈选CD45.2+CD4+IFN-γ+ Th1细胞、CD45.2+CD4+IL-17A+ Th17细胞以及未增殖的CD45.2+CD4+ T细胞。</li>
	<li>进行流式细胞术数据采集并分析结果。
	<ol>
		<li>使用标记了细胞增殖染料eFluor 450的培养T细胞作为细胞增殖染料单染对照。使用未标记细胞增殖染料的培养T细胞制备Zombie Yellow染料单染对照。其余每种荧光染料的单染对照均使用补偿微珠制备。</li>
		<li>使用标记了细胞增殖染料eFluor 450但未添加抗小鼠CD3抗体进行培养的T细胞，定义未增殖细胞的设门范围。</li>
		<li>使用标记了细胞增殖染料并经Zombie Yellow染料染色、所有表面抗体染色，以及抗小鼠IFN-γ PE抗体和抗小鼠IL-17A PE-Cy7抗体同型对照染色的培养T细胞，定义IFN-γ+CD4+和IL-17A+CD4+ T细胞的设门范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本研究中，在Th1诱导条件下共培养的结果与既往报道一致，即Treg细胞可抑制Th1细胞的增殖和分化17,18。在Th17诱导条件下，富集的Treg细胞同样抑制了Tresp细胞的增殖。然而，在本实验所采用的Th17极化条件下，IL-17A+ Tresp细胞的比例在Treg富集细胞存在时反而增加，这与以往报道中Treg细胞可抑制Th17细胞分化的结论不同19,20。这些数据表明，Treg细胞对Tresp细胞的作用可能因诱导条件和检测指标的不同而有所差异。该检测方法可为研究基因修饰或功能改变的Treg细胞功能提供一种体外模型。
这 体外 Treg细胞的功能分析可用于研究Treg细胞对T细胞增殖和极化的影响。相关的共培养方法已被应用于Treg细胞功能的研究中。例如，有研究报道，Treg细胞中的TGF-β信号通路会削弱其...

CD4+CD25+Foxp3+ 调节性T（Treg）细胞在免疫稳态中发挥重要的调节作用1。Treg细胞可主动抑制过度的免疫反应，并维持自身免疫耐受，从而防止免疫反应对正常组织和器官造成损伤2。调控Treg细胞被认为是治疗自身免疫性疾病、实体器官移植排斥反应、移植物抗宿主病以及过敏性疾病等炎症性疾病的潜在治疗策略3,4,5。同时，抑制Treg细胞的功能被视为激活抗肿瘤免疫的有效策略6,7。临床研究已探索了过继性调节性T细胞治疗或低剂量IL-2治疗在自身免疫性疾病、实体器官移植以及移植物抗宿主病中的应用8,9,10。此外，工程化Treg细胞的研究也日益受到关注，包括嵌合抗原受体（CAR）-Treg细胞和T细胞受体（TCR）-Treg细胞11,12。
迄今为止，调节性T细胞（Treg）疗法尚未在常规临床治疗中广泛应用。为了推动Treg细胞疗法的临床应用，系统性地研究和评估其功能至关重要。体外评估调节性T细胞功能的常用策略是体外Treg抑制试验13，该方法可检测Treg细胞对效应T细胞（Teff）增殖的抑制功能。然而，标准的体外 Treg抑制试验并未评估Teff细胞的分化情况。若能同时评估效应T细胞的增殖与分化，则可获得关于调节性T细胞功能的更全面信息。
此处，我们介绍一种改良的 体外 Treg细胞抑制实验，称为“体外 Treg细胞的功能分析”（图1）。本方案提供了一种 体外 研究调节性T细胞对效应T细胞增殖与分化影响的共培养策略

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3457IW</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>12.5 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420043</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>1250 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420813</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420318</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3548</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>5 mL 注射器活塞</td><td>Shifeng Medical</td><td>SB2-061(A)</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>50 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420258</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞滤网&amp;nbsp;</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS-70-CS</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD28 抗体</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 抗体</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 PerCP-Cy5.5（RM4-5）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>45-0042-82</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 Foxp3 PB（FJK-16s）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5773-82</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 IFN-γ PE（XMG1.2）</td><td>BioLegend</td><td>505808</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗小鼠 IL-17A PE-Cy7（eBio17B7）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-7177-82</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Beckman CytoFLEX S 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>用于免疫细胞样本的流式细胞数据采集</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2064</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>上海模型生物研究中心有限公司</td><td>SM-001</td><td>用于原代淋巴细胞及 T 细胞亚群的分离</td></tr><tr><td>CD25 单克隆抗体（PC61.5），PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-83</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>CD4+CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒（小鼠）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-041</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>CD4+CD62L+ T 细胞分离试剂盒（小鼠）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-643</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>CD45.1 小鼠</td><td>上海模型生物研究中心有限公司</td><td>NM-KI-210226</td><td>用于原代淋巴细胞及 T 细胞亚群的分离</td></tr><tr><td>CD45.1 单克隆抗体（A20），FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-0453-85</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>CD45.2 单克隆抗体（104），APC-eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>47-0454-82</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>CD62L（L-选择素）单克隆抗体（MEL-14），FITC&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-0621-85</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 固定/通透溶液试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>eBioscience 细胞增殖染料 eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0842-90</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E1170</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5669701</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>FlowJo 10.6.2</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>用于流式细胞术数据分析的软件</td></tr><tr><td>Golgi-Plug 蛋白转运抑制剂</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>人 TGF-β1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21C</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>钙离子霉素钙盐</td><td>Millipore Sigma</td><td>I3909</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>LD 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>OctoMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG1，&amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BioLegend</td><td>400408</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 大鼠 IgG2a κ 同型对照抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-4321-82</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8139</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 CD16/32 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>用于细胞分选</td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-12 p70</td><td>PEPROTECH</td><td>210-12</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>406-ML</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液（ACK 裂解缓冲液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads 补偿微球&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Zombie Yellow 可固定活力检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>423104</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>或同类产品</td></tr></tbody></table>

体外调节性t细胞功能分析：聚焦增殖与分化

In Vitro Functional Analysis of Regulatory T cells: Focus On Proliferation And Differentiation

调节性T（Treg）细胞在维持免疫稳态中发挥关键作用。Treg细胞功能异常与多种疾病相关，包括自身免疫病、器官移植排斥、感染和癌症。调控Treg细胞被认为是治疗炎症性疾病的潜在治疗策略，包括自身免疫性疾病、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病和过敏性疾病。经典 体外 调节性T细胞（Treg）抑制实验主要用于评估Treg细胞对效应T细胞（Teff）增殖的抑制作用。然而，除增殖外，T细胞的分化对其发挥免疫功能同样具有重要意义。因此，本方案提供了一种改良的 体外 调节性T细胞抑制实验，用于研究调节性T细胞（Treg细胞）对效应T细胞（Teff细胞）增殖与分化的影响。本方案首先介绍小鼠Treg细胞和初始T细胞的制备方法，随后阐述通过共培养体系研究Treg细胞对Teff细胞（包括Th1细胞和Th17细胞）增殖与分化的调控作用，最后介绍共培养后用于流式细胞术的染色策略。 体外 Treg细胞的功能分析可用于研究Treg细胞对T细胞增殖和极化的影响。

在代表性实验中，使用初始T细胞作为Tresp细胞，以研究富含Treg的细胞对Th1和Th17细胞增殖与分化的影响。在该实验中，Tresp细胞通过抗小鼠CD3抗体和富含APC的非CD4+细胞激活，随后在IL-12 p70诱导下分化为Th1细胞，或在TGF-β1和IL-6诱导下分化为Th17细胞。在这两种诱导条件下，研究了以1:1比例加入富含Treg的细胞后，Tresp细胞增殖与分化的改变情况。
当CD45.2+CD4+ Tresp细胞与CD45.1+CD4+ Treg富集细胞共培养时，在Th1和Th17诱导条件下，未增殖Tresp细胞的比例均显著增加（图4A、B），表明Tresp细胞的增殖在Treg富集细胞存在下受到抑制。此外，在与Treg富集细胞共培养后，CD45.2+CD4+IFN-γ+ T（Th1）细胞的分化受到...

本方案提供了一种 体外 研究调节性T细胞对效应T细胞增殖与分化影响的共培养策略

体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

调节性T（Treg）细胞在维持免疫稳态中发挥关键作用。Treg细胞功能异常与多种疾病相关，……

我们的实验室研究T细胞亚群的分化、代谢及其相互作用。调节性T细胞（Treg）影响T细胞间的串扰，维持免疫稳态，因此Treg的研究对于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病至关重要。传统的体外Treg抑制实验忽略了Treg介导的效应及其对效应T细胞分化的影响。该改良方案可同时评估细胞增殖和极化状态。首先，准备初始T细胞、调节性T细胞（Treg）富集细胞以及抗原呈递细胞富集的非CD4阳性细胞。将初始CD4阳性T细胞悬液在4°C条件下以350×g离心7分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。将细胞增殖染料 eFluor 450 用 PBS 稀释至室温下浓度为 20 微摩尔。每 1 × 10⁷ 个细胞加入 0.5 毫升 PBS 至离心管中。保持离心管倾斜约 45 度，通过上下吹打 50 次，轻柔地重悬细胞。接着，迅速向细胞悬液中加入等体积的细胞增殖染料溶液，使终浓度为 10 微摩尔。将离心管保持在 45 度角，用移液器吹打细胞，使其与细胞增殖染料充分混匀。立即用铝箔包裹离心管，避免光照。室温孵育20分钟，每隔5分钟轻轻涡旋一次，以防止细胞聚集。接着，向离心管中加入10毫升预冷的细胞培养基，轻轻涡旋细胞以终止染色。然后离心细胞并弃去上清液。洗涤细胞时，向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基。重复离心操作，并将沉淀重悬于5 mL培养基中。细胞计数后，离心细胞并重悬于适量培养基中，调整细胞浓度至2 × 10⁶ 个细胞/mL。将离心管置于冰上。计算细胞培养所需的样本数量。准备适量含有2.5微克/毫升抗小鼠CD3抗体或适宜诱导细胞因子的细胞培养基。取制备好的初始T细胞和Treg富集细胞并涡旋混匀。向48孔板中加入100 µL CD45.2阳性、CD4阳性初始T细胞，以及100 µL CD45.1阳性、非CD4阳性APC富集细胞。将100 µL CD45.1阳性、CD4阳性、CD25阳性Treg富集细胞转移至实验孔中，将100 µL细胞培养基转移至对照孔中。然后，向每个孔中加入含有抗小鼠 CD3 抗体的培养基 100 微升，以及含有适当诱导细胞因子的培养基 100 微升。向其余空孔中加入 PBS，以维持培养板的湿度并减少边缘效应。将 48 孔板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育三天。轻轻吹打培养的细胞以重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。离心细胞后弃去上清液。向每根离心管中加入500 µL含有佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate）、离子霉素（ionomycin）和GolgiPlug蛋白转运抑制剂的细胞培养基。轻轻涡旋重悬细胞，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育3小时。离心后，向沉淀中加入50微升含有一种 Zombie Yellow 染料以及1:100稀释的抗小鼠CD16/32抗体的PBS溶液。涡旋混匀样品，避光室温孵育15分钟，以标记死细胞并阻断Fc受体。离心细胞后弃去上清液。向样品中加入 50 µL 表面抗体混合液，涡旋混匀，在 4°C 避光孵育 20 分钟。然后向每支离心管中加入 1 mL 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。离心并去除上清液后，向每支离心管中加入 300 微升固定和透化溶液，并涡旋混匀样品。将样品在 4 摄氏度避光条件下孵育 20 分钟。随后向每支离心管中加入 1 毫升透化和洗涤缓冲液，再进行离心并去除上清液。重复洗涤后，向每个样本中加入50微升细胞因子抗体混合液，并涡旋混匀样本。将样本在4摄氏度避光条件下孵育40分钟。用1毫升破膜洗涤缓冲液洗涤每个样本。离心细胞并弃去上清液。用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。通过流式细胞术检测应答性T细胞的增殖与分化。在全部细胞中圈定淋巴细胞群体，以排除细胞碎片和杂质。根据散射信号从淋巴细胞中选取单细胞群体。随后从单细胞中鉴定活细胞群体，再从活细胞中确定CD4阳性T细胞群体。接下来，在 CD4 阳性 T 细胞中圈选 CD45.1 阳性的调节性 T 细胞富集群体以及 CD45.2 阳性的效应 T 细胞群体。然后在 CD45.2 阳性 T 细胞中选择 CD45.2 阳性、CD4 阳性、干扰素 γ 阳性的辅助性 T 细胞 1（T helper 1 cells），CD45.2 阳性、CD4 阳性、白细胞介素-17A 阳性的辅助性 T 细胞 17（T helper 17 cells），以及未增殖的 CD45.2 阳性、CD4 阳性 T 细胞。对所有样本进行流式细胞术数据采集。最后，使用 FlowJo 软件分析流式细胞术数据，设门策略与流式细胞术数据采集时保持一致。在与富集的调节性 T 细胞共培养后，无论是在辅助性 T 细胞 1 型还是辅助性 T 细胞 17 型诱导条件下，未增殖的反应性 T 细胞频率均显著增加。与富集的调节性 T 细胞共培养后，CD45.2 阳性、CD4 阳性、干扰素 γ 阳性的辅助性 T 细胞 1 型的分化受到显著抑制。当应答性T细胞与富含调节性T细胞的细胞共培养时，CD45.2阳性、CD4阳性、白细胞介素-17A阳性的辅助性T细胞17的频率增加。体外对调节性T细胞的功能分析可实现对调节性T细胞与效应T细胞之间在增殖和极化方面的双向作用进行研究。执行本方案时最大的挑战在于如何在确保调节性T细胞和初始T细胞纯度的同时维持细胞活力。通过这一流程，ELISA 及其他生物医学检测可评估细胞因子和代谢效应分子的产生，而经 FACS 分选的细胞则可用于后续的 RNA-seq 和蛋白质组学分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

体外 调控T细胞的功能分析：聚焦增殖与分化

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。...

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

CD4+调节性T细胞是强大的免疫调节因子，在免疫稳态中发挥重要作用。由于外周血中这类细胞数量稀少，使其功能研究具有挑战性，特别是在HIV-1感染的背景下。本文介绍一种从HIV-1感染者外周血中分离并扩增功能性CD4+...

从HIV-1感染者体内扩增调节性T细胞的新工具

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

初始CD4+ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4+...

小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

本文介绍了一种分析从未经处理及慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的调节性T（Treg）细胞表型的实验方案。此外，我们还提供了一种评估Treg细胞抑制活性的方法。...

从慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的活化调节性T细胞的表型与功能分析

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法+ T细胞...

体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内...

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍一种通过定量PCR（qPCR）检测表观遗传标记来确定免疫细胞身份和纯度的可靠方法。特定基因位点的DNA去甲基化可作为特定细胞类型的独特标识，可用于鉴定CD8+ T细胞、调节性T细胞或Th17...

基于表观遗传学的定量PCR检测免疫细胞身份与纯度

学习体外调节性T细胞功能分析方法，通过流式细胞术同时评估效应T细胞增殖与Th1、Th17分化。该方案为研究Treg介导的免疫调控及自身免疫疾病治疗策略提供可靠工具。

体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

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