体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

我们的实验室研究T细胞亚群的分化、代谢及其相互作用。调节性T细胞（Treg）影响T细胞间的串扰，维持免疫稳态，因此Treg的研究对于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病至关重要。传统的体外Treg抑制实验忽略了Treg介导的效应及其对效应T细胞分化的影响。

该改良方案可同时评估细胞增殖和极化状态。首先，准备初始T细胞、调节性T细胞（Treg）富集细胞以及抗原呈递细胞富集的非CD4阳性细胞。将初始CD4阳性T细胞悬液在4°C条件下以350×g离心7分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。

将细胞增殖染料 eFluor 450 用 PBS 稀释至室温下浓度为 20 微摩尔。每 1 × 10⁷ 个细胞加入 0.5 毫升 PBS 至离心管中。保持离心管倾斜约 45 度，通过上下吹打 50 次，轻柔地重悬细胞。

接着，迅速向细胞悬液中加入等体积的细胞增殖染料溶液，使终浓度为 10 微摩尔。将离心管保持在 45 度角，用移液器吹打细胞，使其与细胞增殖染料充分混匀。立即用铝箔包裹离心管，避免光照。

室温孵育20分钟，每隔5分钟轻轻涡旋一次，以防止细胞聚集。接着，向离心管中加入10毫升预冷的细胞培养基，轻轻涡旋细胞以终止染色。然后离心细胞并弃去上清液。

洗涤细胞时，向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基。重复离心操作，并将沉淀重悬于5 mL培养基中。细胞计数后，离心细胞并重悬于适量培养基中，调整细胞浓度至2 × 10⁶ 个细胞/mL。

将离心管置于冰上。计算细胞培养所需的样本数量。准备适量含有2.5微克/毫升抗小鼠CD3抗体或适宜诱导细胞因子的细胞培养基。

取制备好的初始T细胞和Treg富集细胞并涡旋混匀。向48孔板中加入100 µL CD45.2阳性、CD4阳性初始T细胞，以及100 µL CD45.1阳性、非CD4阳性APC富集细胞。将100 µL CD45.1阳性、CD4阳性、CD25阳性Treg富集细胞转移至实验孔中，将100 µL细胞培养基转移至对照孔中。

然后，向每个孔中加入含有抗小鼠 CD3 抗体的培养基 100 微升，以及含有适当诱导细胞因子的培养基 100 微升。向其余空孔中加入 PBS，以维持培养板的湿度并减少边缘效应。将 48 孔板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育三天。

轻轻吹打培养的细胞以重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。离心细胞后弃去上清液。向每根离心管中加入500 µL含有佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate）、离子霉素（ionomycin）和GolgiPlug蛋白转运抑制剂的细胞培养基。

轻轻涡旋重悬细胞，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育3小时。离心后，向沉淀中加入50微升含有一种 Zombie Yellow 染料以及1:100稀释的抗小鼠CD16/32抗体的PBS溶液。涡旋混匀样品，避光室温孵育15分钟，以标记死细胞并阻断Fc受体。

离心细胞后弃去上清液。向样品中加入 50 µL 表面抗体混合液，涡旋混匀，在 4°C 避光孵育 20 分钟。然后向每支离心管中加入 1 mL 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。

离心并去除上清液后，向每支离心管中加入 300 微升固定和透化溶液，并涡旋混匀样品。将样品在 4 摄氏度避光条件下孵育 20 分钟。随后向每支离心管中加入 1 毫升透化和洗涤缓冲液，再进行离心并去除上清液。

重复洗涤后，向每个样本中加入50微升细胞因子抗体混合液，并涡旋混匀样本。将样本在4摄氏度避光条件下孵育40分钟。用1毫升破膜洗涤缓冲液洗涤每个样本。

离心细胞并弃去上清液。用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。通过流式细胞术检测应答性T细胞的增殖与分化。

在全部细胞中圈定淋巴细胞群体，以排除细胞碎片和杂质。根据散射信号从淋巴细胞中选取单细胞群体。随后从单细胞中鉴定活细胞群体，再从活细胞中确定CD4阳性T细胞群体。

接下来，在 CD4 阳性 T 细胞中圈选 CD45.1 阳性的调节性 T 细胞富集群体以及 CD45.2 阳性的效应 T 细胞群体。然后在 CD45.2 阳性 T 细胞中选择 CD45.2 阳性、CD4 阳性、干扰素 γ 阳性的辅助性 T 细胞 1（T helper 1 cells），CD45.2 阳性、CD4 阳性、白细胞介素-17A 阳性的辅助性 T 细胞 17（T helper 17 cells），以及未增殖的 CD45.2 阳性、CD4 阳性 T 细胞。对所有样本进行流式细胞术数据采集。

最后，使用 FlowJo 软件分析流式细胞术数据，设门策略与流式细胞术数据采集时保持一致。在与富集的调节性 T 细胞共培养后，无论是在辅助性 T 细胞 1 型还是辅助性 T 细胞 17 型诱导条件下，未增殖的反应性 T 细胞频率均显著增加。与富集的调节性 T 细胞共培养后，CD45.2 阳性、CD4 阳性、干扰素 γ 阳性的辅助性 T 细胞 1 型的分化受到显著抑制。

当应答性T细胞与富含调节性T细胞的细胞共培养时，CD45.2阳性、CD4阳性、白细胞介素-17A阳性的辅助性T细胞17的频率增加。体外对调节性T细胞的功能分析可实现对调节性T细胞与效应T细胞之间在增殖和极化方面的双向作用进行研究。执行本方案时最大的挑战在于如何在确保调节性T细胞和初始T细胞纯度的同时维持细胞活力。

通过这一流程，ELISA 及其他生物医学检测可评估细胞因子和代谢效应分子的产生，而经 FACS 分选的细胞则可用于后续的 RNA-seq 和蛋白质组学分析。