人类脑组织的染色质分析实验

大家好，我是Amish Matan，来自马萨诸塞大学医学院精神病学系Sha Mc Barian博士的实验室。今天我将向大家演示一种在死后人脑组织中进行染色质免疫沉淀的实验方法。尽管以下实验步骤并不十分复杂。

最令人兴奋的是，直到最近，人类大脑中的基因表达研究还仅限于对 mRNA 和蛋白质的简单定量。这一特定技术将使我们更深入地理解基因表达在正常和病变人类大脑中的作用机制。现在，让我们开始进行染色质免疫沉淀。

我们从先前解剖的冷冻尸检人脑组织开始。使用护目镜并在指定区域处理人体组织非常重要。处理这些样本时，用五倍于脑组织体积的下槽缓冲液对脑组织进行处理。

当所有组织在溶液中均呈现均一状态后，即可将其转移至一个 2 mL 离心管中。组织匀浆完成后，向样品中加入 5 单位/毫升的微球菌核酸酶，并通过移液器吹打混匀溶液，随后置于冰上。

此步骤需快速完成，因为微球菌核酸酶即使在4摄氏度下仍具有活性。所有样品经微球菌核酸酶处理后，我们需迅速转移至37摄氏度水浴中，并孵育7分钟。

七分钟孵育后，加入0.5摩尔的EDTA至终浓度为10毫摩尔，以终止微球菌核酸酶活性。现在我们已准备好进行下一步的片段化处理。在经过微球菌核酸酶处理后，含有核小体DNA的样品将开始片段化。

将一个15毫升的Falcon离心管中加入4.5毫升0.2毫摩尔的EDTA、2.5微升0.2摩尔的苯甲脒以及4.5微升0.1摩尔的PMSF。随后将我们的样品转移至该离心管中。现在将样品置于冰上孵育1小时，每隔10分钟涡旋混匀一次。

在长达一小时的孵育结束后，我们将加入2.5微升的3摩尔DTT。样品再次涡旋混匀，然后在4摄氏度下，以3,175 × g的离心力在摆桶转子中离心10分钟。离心后，将上清液进行分配，其中500微升作为输入对照，仅含有基因组DNA；其余部分则均分为两管，每管含1,600微升样品，用于后续的染色质免疫沉淀实验。

将输入对照样本置于负80摄氏度过夜，以备后续使用。接着，向样本中加入160微升10 XFSB（即样本体积的十分之一），同时加入4微克抗体。

现在将样品涡旋混匀，然后在4°C下旋转过夜。过夜孵育后，我们将洗涤用于分离核小体DNA的蛋白凝胶珠。由于这些磁珠非常敏感，因此在操作时必须剪掉移液器吸头的尖端。

这是为了确保在移液时磁珠有更大的空间。现在将1.6 mL的XFS磁珠加入到245 µL的蛋白猎豹中，置于一个2 mL的微量离心管中。这足以用于四个样本管。

接下来，将珠子溶液分装到两个 2 毫升离心管中，每管用 1×FSB 补充至 1.6 毫升。将离心管在室温下于旋转仪上旋转 30 秒，然后在 0.1 × g 离心力下离心 30 秒。离心后，使用真空装置去除上清液 ATE。

加入1.6 mils的一种XFSB。再次将样品在旋转器上旋转30秒，然后在0.1 RCF FS下离心30秒。离心后，再次移除上清液，并将两个管中的沉淀合并，加入1.5 mils的一种XFSB。

同时加入15 µL精子DNA。室温下旋转孵育30分钟，然后以0.1 ×g离心30秒。弃去上清液，加入200 µL的1×FSB。

现在向每份染色质沉淀样品中加入 90 微升农杆菌裂解液，然后在 4 摄氏度下旋转孵育一小时。作为阴性对照，向剩余的农杆菌裂解液中加入 1 毫升 1 XFSB，并与染色质免疫沉淀样品一同在 4 摄氏度下旋转孵育一小时。在这一小时的孵育期间，我们可以趁机配制一些新鲜的解离缓冲液。

此步骤将在实验后续阶段使用，即在孵育一小时后进行。以 0.1 CFS 离心样品和阴性对照 30 秒，弃去上清液。接下来，我们将使用四种不同的洗涤溶液清洗磁珠：低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、氯化锂溶液，最后使用 pH 为 8 的 TE 缓冲液。

除氯化锂溶液外，每种缓冲液均在室温下旋转样品3分钟，然后在0.1 R Cs条件下离心30秒。氯化锂洗涤步骤仅需在室温下旋转样品1分钟。每次洗涤后，使用真空装置弃去上清液。

现在我们准备进行样品的洗脱。开始洗脱步骤时，向每个样品中加入 250 µL 新鲜配制的洗脱缓冲液。在室温下旋转样品 15 分钟，然后在 0.4 ×g 条件下离心 1 分钟。

现在将上清液保存至一个2 mL的橙色管中。然后向每个样品中加入250 µL洗脱缓冲液。再次用手轻轻涡旋振荡数秒。

将样品涡旋振荡15分钟后，再继续涡旋15分钟，随后将离心管放入离心机中离心。以16 ×g离心4分钟，并将上清液收集到同一个2 mL离心管中。为消化样品中的蛋白质，首先向每个染色质免疫沉淀样品中加入10 µL 0.5 M EDTA、25 µL 0.8 M Tris-HCl（pH 6.5）以及2.5 µL 10 mg/mL的蛋白酶K。

在每个上清样本中加入15 µL裂解缓冲液和2.5 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，将上清样本和染色质免疫沉淀样本在52 °C孵育至少三小时。三小时孵育结束后，即可开始苯酚氯仿抽提。

经过三小时的孵育后，向每个样品中加入500 µL苯基氯仿。由于苯基氯仿是一种有机化学物质，接触皮肤有害，且其蒸气吸入也有害，因此该操作需在通风橱内进行。接下来，将所有样品涡旋振荡数秒，然后在13 ×g条件下离心五分钟。

管内应出现两相。由于我们关注的是上层相中的成分，因此将上层相取出并转移至一个2 mL的微量离心管中。随后，向每个样品中加入2 µL甘油和50 µL 3 M乙酸钠的混合液，以及1.375 mL的100%乙醇。

所有样品均需充分涡旋振荡，并于负80摄氏度条件下放置过夜。过夜孵育后，将样品置于冰上解冻。随后在4摄氏度条件下以15 RCF离心10分钟。

离心后，小心移除上清液，避免扰动管底的沉淀物。接着，向每个样品中加入1 mL冰冷的75%乙醇，并将所有样品上下颠倒4至6次。然后在4°C条件下，以18 ×g离心5分钟。

再次去除上清液，沉淀物置于空气中干燥。沉淀物干燥后，溶于50微升pH为8的4毫摩尔痕量盐酸中，并于-80摄氏度保存，直至进一步使用。好了，我刚刚向您演示了如何在冷冻的人类死后脑组织上进行染色质免疫沉淀实验。

需要提醒的是，在进行该实验操作时，处理人脑组织和染色质时务必采取所有必要的安全防护措施。染色质免疫沉淀实验可用于进一步深入理解正常与病变人脑组织中的基因表达情况。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。