Name: 一个人脑组织中的染色质含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习染色质免疫共沉淀技术在人脑组织中的应用，用于分析组蛋白甲基化等表观遗传调控机制。该方法有助于深入理解正常与疾病状态下人脑基因表达的分子基础。

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本工作获得了美国国家心理健康研究所资助（5R01MH071476）。

步骤：
1st 天
1. 使用Douncing缓冲液匀浆50-500 mg冷冻的死后灰质组织。
！警告！ - 人类组织必须在严格的安全条件下小心操作。应在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的安全标准下进行处理。
<ol>
<li>从 -80°C 取出先前解剖的死后脑组织，加入 5 倍脑组织体积的匀浆缓冲液进行 Dounce 匀浆，并置于 2.0 mL 微量离心管中。匹配的样本与对照组配对需同时处理。</li>
</ol>
2. 微球菌核酸酶（MN）消化
<ol>
<li>向样品中加入5U/mL的微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease），通过上下吹打混匀溶液，然后置于冰上。 *&nbsp;关键步骤 -&nbsp;此步骤需迅速操作，因为微球菌核酸酶在4°C时仍具有活性。</li>
<li>在37°C下孵育样品7分钟。</li>
<li>孵育7分钟后，加入0.5 M EDTA至终浓度为10 mM，以终止MNase活性。</li>
</ol>
3. 低渗处理
<ol>
<li>将样品放入15 mL离心管中。加入样品体积10倍的0.2 mM EDTA，样品体积的1/2000的0.2 M苯甲脒（benzamidine）以及样品体积的1/1000的0.1 M苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulphonylfluoride, PMSF）。后两种化合物用作蛋白酶抑制剂。 *&nbsp;关键步骤 -&nbsp;所有这些操作步骤中必须将样品置于冰上。</li>
<li>将样品孵育1小时，每10分钟涡旋混匀一次。</li>
<li>在长达1小时的孵育结束后，加入样品体积1/2000的3 M二硫苏糖醇（DTT），这是另一种蛋白酶抑制剂。</li>
<li>再次涡旋混匀样品，然后在4°C下以3175 RCF离心10分钟。 *&nbsp;可选步骤 - 使用Protein G琼脂糖进行预清除。<ol>
<li>取上清液并转移至新的15 mL离心管中。</li>
<li>加入500 µL Protein G琼脂糖。</li>
<li>室温下旋转孵育30分钟。</li>
<li>在4°C下以4000 rpm离心10分钟。</li>
</ol></li>
<li>将上清液分配，其中500 µL作为Input对照（仅含基因组DNA），其余部分均分为两个试管，每管含1600 µL样品——用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验。</li>
<li>Input对照样品在-80°C下保存过夜，待后续使用。</li>
<li>向ChIP样品中加入1/10体积的10X FSB缓冲液和4 μg抗体，涡旋混匀后在4°C下旋转孵育过夜。 ! 注意！ — 抗体的用量和稀释比例可能需要优化。</li>
</ol>
2nd 天
! 警告！-&nbsp;开始 2nd 每天通过清洗将用于分离核小体DNA的Protein G Agarose。由于琼脂糖珠非常敏感，在用移液器操作任何含有琼脂糖珠的溶液时，必须剪掉枪头的尖端。
1. 将蛋白G琼脂糖微珠与DNA结合
<ol>
<li>在2 mL微量离心管（循环）中，向245 µL蛋白G-琼脂糖中加入1.6 mL 1X FSB（足够用于4个管）。</li>
<li>将溶液均分至两个2 mL离心管中，并各自用1X FSB补足至1.6 mL。</li>
<li>室温下旋转混匀30秒，然后以0.1 RCF离心30秒。</li>
<li>使用真空装置去除上清液。</li>
<li>再次加入1.6 mL 1X FSB。样品旋转混匀30秒，随后以0.1 RCF离心30秒。</li>
<li>再次去除上清液，并将两个管中的琼脂糖珠合并至1.5 mL 1X FSB中。</li>
<li>加入15 µL超声处理的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）。 ！注意！ - 此步骤原则上可减少免疫沉淀物与珠子的非特异性结合。但这也可能导致某些（人源）DNA序列出现假阳性结果。</li>
<li>室温下旋转孵育30分钟，然后以0.1 RCF离心30秒。</li>
<li>去除上清液，加入200 μL 1X FSB。</li>
<li>向每个ChIP样品中加入90 µL琼脂糖珠，4°C下旋转孵育1小时。</li>
<li>向剩余的琼脂糖珠中加入1 mL 1X FSB作为阴性对照，4°C下旋转孵育1小时。&nbsp;</li>
<li>孵育1小时后，将样品和阴性对照以0.1 RCF离心30秒，弃去上清液。</li>
</ol>
2. 洗涤磁珠
！注意！ -&nbsp;洗涤缓冲液必须在使用前保存在 4°C，且仅可在未超过一个月的情况下使用。
<ol>
<li>向珠子中加入1 mL每种洗涤液，在室温下旋转孵育3分钟。</li>
<li>在0.1 RCF下离心30秒。&nbsp;</li>
<li>使用真空装置弃去上清液。</li>
</ol>
* 每种洗涤液
-- 低盐洗涤缓冲液
——高盐洗涤缓冲液
-- 氯化锂溶液 - 仅在室温下旋转1分钟！
-- TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH=8）
3. 洗脱
*&nbsp;关键步骤 - 每次实验当天需新鲜配制洗脱缓冲液。
<ol>
<li>向每个样品中加入 250 µL 新鲜配制的洗脱缓冲液。</li>
<li>室温旋转孵育 15 分钟，然后在 0.4 RCF 下离心 1 分钟。</li>
<li>将上清液收集至一个 2.0 mL 微量离心管中（Loop）。</li>
<li>向每个样品中加入 250 µL 洗脱缓冲液，手动涡旋数秒，然后在多功能涡旋仪上继续涡旋 15 分钟。</li>
<li>在 16 RCF rpm 条件下离心 4 分钟，并将上清液收集至同一个 2.0 mL 管中（Loop）。</li>
</ol>
4. 消化蛋白质
<ol>
<li>向每个ChIP样品中加入10 μl 0.5 M EDTA、25 μl 0.8 M Tris-HCl（pH 6.5）和10 mg/ml蛋白酶K（样品体积的1/200）。</li>
<li>向每个Input对照样品中加入用于蛋白酶K消化的裂解缓冲液（样品缓冲液体积的1/10）和10 mg/ml蛋白酶K（样品缓冲液体积的1/200）。</li>
<li>将Input样品和ChIP样品在52°C孵育至少3小时。</li>
</ol>
5. 酚/氯仿抽提
！警告！ - 涉及苯酚/氯仿的实验必须在通风橱中进行。操作苯酚/氯仿时需佩戴腈手套。
<ol>
<li>3小时孵育后，向每个样品中加入500 μl苯酚-氯仿。</li>
<li>将所有样品涡旋振荡数秒，然后在13 RCF rpm条件下离心5分钟。</li>
<li>此时会出现两相，我们关注的是上相中的成分。&nbsp; 吸取上相并转移至2 mL微量离心管中。</li>
<li>向每个样品中加入2 µL甘油原和50 µL 3M乙酸钠的混合液，以及1.375 mL 100%乙醇。</li>
<li>剧烈涡旋振荡所有样品，置于-80°C过夜。</li>
</ol>
3rd 天
<ol>
<li>从 -80°C 中取出样品，置于冰上使其解冻。</li>
<li>在 4°C 下以 15 RCF 离心 10 分钟。</li>
<li>小心移除上清液，避免扰动管底的沉淀物。</li>
<li>向每个样品中加入 1 mL 冷的 75% 乙醇，&nbsp;然后轻轻倒置 4–6 次。</li>
<li>在 4°C 下以 18 RCF 离心 5 分钟。</li>
<li>再次移除上清液，并让沉淀物自然风干。</li>
<li>将干燥的沉淀物溶解于 50 µL 的 4 mM Tris-HCl（pH 8）中，保存于 -80°C，待后续使用。</li>
</ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

本文所述方案对于研究人类大脑组蛋白和/或DNA甲基化特征的研究人员尤为有用，因为与其他类型的修饰（包括（组蛋白）乙酰化和磷酸化）相比，这些染色质标记可能较少受到死后人工假象的影响1, 2。死后大脑组织适用于单核小体样品的研究；DNA在很大程度上仍与核心组蛋白保持结合，至少在自溶间隔时间（即死亡至组织冷冻/储存的时间）具有代表性的样本中是如此，该时间通常为数小时至1.5天1。然而，单核小体制备物可能对核小体定位和密度的变化较为敏感，特别是在基因转录起始位点周围的序列区域3。因此，应包括使用不依赖修饰的抗组蛋白抗体进行的对照实验。 alternatively，也可通过缩短微球菌核酸酶消化的孵育时间并结合额外的纯化步骤（包括超速离心），从人脑提取物中分离多核小体组分。最后，最近一项关于死后脑组织全基因组转录因子结合的研究直接采用超声波剪切染色质4。值得注意的是，从死后研究的角度来看，在超声处理或酶消化前对染色质进行交联固定的制备方法可能并不理想，因为死亡后高级染色质结构的降解和/或人为重构是难以控制的潜在混杂因素。因此，染色质免疫沉淀（ChIP）分析在死后...

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>EMD Millipore</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>OmniPur，EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，0.5 M 溶液，pH 8.0</td><td>OmniPur，EMD Millipore</td><td>4055</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Mallinckrodt Baker 公司</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>10% (w/v) SDS 溶液</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650-100G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7277-250G</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2889</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌微球菌核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755-200UN</td><td></td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>Fluka</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-1G</td><td></td></tr><tr><td>3M DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Protein G 琼脂糖凝胶（快速流速）</td><td>Upstate，Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>超声处理鲑鱼精子DNA试剂盒</td><td>Stratagene，Agilent Technologies</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>来自埃默森青霉（Engyodontium album）的蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>苯酚：氯仿 1:1</td><td>OmniPur，EMD Millipore</td><td>6810</td><td></td></tr><tr><td>糖原，来自贻贝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767-1VL</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200度）</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;强&gt;溶液：&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;nChIP 匀浆缓冲液：10 mM Tris，4 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 调节pH至7.5&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10倍稀释FSB：50 mM EDTA，200 mM Tris，500 mM NaCl，调节pH至7.5&lt;/li&gt;&lt;李&gt;低盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），150 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;高盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），500 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;氯化锂缓冲液：1% IGEPAL-CA 630，1% 脱氧胆酸钠，1 mM EDTA（pH 8），10 mM Tris（pH 8），0.25 M LiCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;TE缓冲液：10 mM Tris（pH 8），1 mM EDTA&lt;/li&gt;&lt;李&gt;洗脱缓冲液：0.1 M NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，1% SDS&lt;/li&gt;&lt;李&gt;蛋白酶K消化缓冲液（10X）：1 M Tris，50 mM EDTA，2% SDS，2 M NaCl，调节pH至8.0&lt;/li&gt;&lt;李&gt;3 M 醋酸钠：将24.61 g无水醋酸钠（分子量=82.03）溶于100 mL经高压灭菌的蒸馏水中，用浓醋酸调节pH至5.2。&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;李&gt;nChIP 玻璃匀浆缓冲液：10 mM Tris，4 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 调节pH至7.5&lt;/li&gt;&lt;李&gt;10x FSB：50 mM EDTA，200 mM Tris，500 mM NaCl，调pH至7.5&lt;/li&gt;&lt;李&gt;低盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），150 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;高盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），500 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;氯化锂缓冲液：1% IGEPAL-CA 630，1% 脱氧胆酸钠，1 mM EDTA（pH 8），10 mM Tris（pH 8），0.25 M LiCl&lt;/li&gt;&lt;李&gt;TE缓冲液：10 mM Tris（pH 8），1 mM EDTA&lt;/li&gt;&lt;李&gt;洗脱缓冲液：0.1 M NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，1% SDS&lt;/li&gt;&lt;李&gt;蛋白酶K消化缓冲液（10倍浓度）：1 M Tris，50 mM EDTA，2% SDS，2 M NaCl，调pH至8.0&lt;/li&gt;&lt;李&gt;3 M 醋酸钠：将24.61 g无水醋酸钠（分子量=82.03）溶于100 mL经高压灭菌的蒸馏水中，用浓醋酸调节pH至5.2。&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

人类脑组织的染色质分析实验

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

慢性神经精神疾病，如精神分裂症、双相情感障碍和自闭症，被认为是由遗传和环境因素共同作用所致，这些因素可能导致基因表达的表观遗传改变及其他分子病理变化。然而，传统上对死后脑组织的表达研究仅限于mRNA或蛋白质的定量分析。死后脑组织研究中遇到的局限性，例如自溶时间与组织完整性的差异，也可能影响对染色质高级结构的研究。不过，来自多个脑库提供的代表性样本中，基因组DNA的核小体结构（包括DNA与核心组蛋白的结合）在很大程度上得以保存。因此，有可能在死后人脑中研究特定基因组位点上核心组蛋白的甲基化模式及其他共价修饰。本文介绍一种适用于冷冻（未经固定）人脑标本的简化原位染色质免疫沉淀（NChIP）实验方案。从微球菌核酸酶消化脑匀浆开始，经NChIP结合qPCR检测，可在三天内完成全部流程。本方法有望用于阐明正常与病变人脑中基因表达的表观遗传调控机制。

关键词：表观遗传学，染色质免疫沉淀，NChIP，核心组蛋白修饰，DNA甲基化，死后脑组织，微球菌核酸酶，qPCR，神经精神疾病，人脑

直到最近，人类大脑的表达研究仅限于RNA或蛋白质的定量分析。通过本文所述的染色质免疫沉淀技术，将有可能在死后大脑中绘制组蛋白甲基化及其他基因表达表观遗传调控因子的图谱。

慢性神经精神疾病（如精神分裂症、双相情感障碍和自闭症）被认为是由遗传因素和环境因素共同作用所致……

大家好，我是Amish Matan，来自马萨诸塞大学医学院精神病学系Sha Mc Barian博士的实验室。今天我将向大家演示一种在死后人脑组织中进行染色质免疫沉淀的实验方法。尽管以下实验步骤并不十分复杂。最令人兴奋的是，直到最近，人类大脑中的基因表达研究还仅限于对 mRNA 和蛋白质的简单定量。这一特定技术将使我们更深入地理解基因表达在正常和病变人类大脑中的作用机制。现在，让我们开始进行染色质免疫沉淀。我们从先前解剖的冷冻尸检人脑组织开始。使用护目镜并在指定区域处理人体组织非常重要。处理这些样本时，用五倍于脑组织体积的下槽缓冲液对脑组织进行处理。当所有组织在溶液中均呈现均一状态后，即可将其转移至一个 2 mL 离心管中。组织匀浆完成后，向样品中加入 5 单位/毫升的微球菌核酸酶，并通过移液器吹打混匀溶液，随后置于冰上。此步骤需快速完成，因为微球菌核酸酶即使在4摄氏度下仍具有活性。所有样品经微球菌核酸酶处理后，我们需迅速转移至37摄氏度水浴中，并孵育7分钟。七分钟孵育后，加入0.5摩尔的EDTA至终浓度为10毫摩尔，以终止微球菌核酸酶活性。现在我们已准备好进行下一步的片段化处理。在经过微球菌核酸酶处理后，含有核小体DNA的样品将开始片段化。将一个15毫升的Falcon离心管中加入4.5毫升0.2毫摩尔的EDTA、2.5微升0.2摩尔的苯甲脒以及4.5微升0.1摩尔的PMSF。随后将我们的样品转移至该离心管中。现在将样品置于冰上孵育1小时，每隔10分钟涡旋混匀一次。在长达一小时的孵育结束后，我们将加入2.5微升的3摩尔DTT。样品再次涡旋混匀，然后在4摄氏度下，以3,175 × g的离心力在摆桶转子中离心10分钟。离心后，将上清液进行分配，其中500微升作为输入对照，仅含有基因组DNA；其余部分则均分为两管，每管含1,600微升样品，用于后续的染色质免疫沉淀实验。将输入对照样本置于负80摄氏度过夜，以备后续使用。接着，向样本中加入160微升10 XFSB（即样本体积的十分之一），同时加入4微克抗体。现在将样品涡旋混匀，然后在4°C下旋转过夜。过夜孵育后，我们将洗涤用于分离核小体DNA的蛋白凝胶珠。由于这些磁珠非常敏感，因此在操作时必须剪掉移液器吸头的尖端。这是为了确保在移液时磁珠有更大的空间。现在将1.6 mL的XFS磁珠加入到245 µL的蛋白猎豹中，置于一个2 mL的微量离心管中。这足以用于四个样本管。接下来，将珠子溶液分装到两个 2 毫升离心管中，每管用 1×FSB 补充至 1.6 毫升。将离心管在室温下于旋转仪上旋转 30 秒，然后在 0.1 × g 离心力下离心 30 秒。离心后，使用真空装置去除上清液 ATE。加入1.6 mils的一种XFSB。再次将样品在旋转器上旋转30秒，然后在0.1 RCF FS下离心30秒。离心后，再次移除上清液，并将两个管中的沉淀合并，加入1.5 mils的一种XFSB。同时加入15 µL精子DNA。室温下旋转孵育30分钟，然后以0.1 ×g离心30秒。弃去上清液，加入200 µL的1×FSB。现在向每份染色质沉淀样品中加入 90 微升农杆菌裂解液，然后在 4 摄氏度下旋转孵育一小时。作为阴性对照，向剩余的农杆菌裂解液中加入 1 毫升 1 XFSB，并与染色质免疫沉淀样品一同在 4 摄氏度下旋转孵育一小时。在这一小时的孵育期间，我们可以趁机配制一些新鲜的解离缓冲液。此步骤将在实验后续阶段使用，即在孵育一小时后进行。以 0.1 CFS 离心样品和阴性对照 30 秒，弃去上清液。接下来，我们将使用四种不同的洗涤溶液清洗磁珠：低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、氯化锂溶液，最后使用 pH 为 8 的 TE 缓冲液。除氯化锂溶液外，每种缓冲液均在室温下旋转样品3分钟，然后在0.1 R Cs条件下离心30秒。氯化锂洗涤步骤仅需在室温下旋转样品1分钟。每次洗涤后，使用真空装置弃去上清液。现在我们准备进行样品的洗脱。开始洗脱步骤时，向每个样品中加入 250 µL 新鲜配制的洗脱缓冲液。在室温下旋转样品 15 分钟，然后在 0.4 ×g 条件下离心 1 分钟。现在将上清液保存至一个2 mL的橙色管中。然后向每个样品中加入250 µL洗脱缓冲液。再次用手轻轻涡旋振荡数秒。将样品涡旋振荡15分钟后，再继续涡旋15分钟，随后将离心管放入离心机中离心。以16 ×g离心4分钟，并将上清液收集到同一个2 mL离心管中。为消化样品中的蛋白质，首先向每个染色质免疫沉淀样品中加入10 µL 0.5 M EDTA、25 µL 0.8 M Tris-HCl（pH 6.5）以及2.5 µL 10 mg/mL的蛋白酶K。在每个上清样本中加入15 µL裂解缓冲液和2.5 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，将上清样本和染色质免疫沉淀样本在52 °C孵育至少三小时。三小时孵育结束后，即可开始苯酚氯仿抽提。经过三小时的孵育后，向每个样品中加入500 µL苯基氯仿。由于苯基氯仿是一种有机化学物质，接触皮肤有害，且其蒸气吸入也有害，因此该操作需在通风橱内进行。接下来，将所有样品涡旋振荡数秒，然后在13 ×g条件下离心五分钟。管内应出现两相。由于我们关注的是上层相中的成分，因此将上层相取出并转移至一个2 mL的微量离心管中。随后，向每个样品中加入2 µL甘油和50 µL 3 M乙酸钠的混合液，以及1.375 mL的100%乙醇。所有样品均需充分涡旋振荡，并于负80摄氏度条件下放置过夜。过夜孵育后，将样品置于冰上解冻。随后在4摄氏度条件下以15 RCF离心10分钟。离心后，小心移除上清液，避免扰动管底的沉淀物。接着，向每个样品中加入1 mL冰冷的75%乙醇，并将所有样品上下颠倒4至6次。然后在4°C条件下，以18 ×g离心5分钟。再次去除上清液，沉淀物置于空气中干燥。沉淀物干燥后，溶于50微升pH为8的4毫摩尔痕量盐酸中，并于-80摄氏度保存，直至进一步使用。好了，我刚刚向您演示了如何在冷冻的人类死后脑组织上进行染色质免疫沉淀实验。需要提醒的是，在进行该实验操作时，处理人脑组织和染色质时务必采取所有必要的安全防护措施。染色质免疫沉淀实验可用于进一步深入理解正常与病变人脑组织中的基因表达情况。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个人脑组织中的染色质含量

脑组织的细胞异质性对染色质中表观遗传标记的研究构成了显著限制，因为大多数检测方法缺乏单细胞分辨率。神经元通常与胶质细胞及其他非神经元细胞混杂在一起。本文提供了一种从人脑中提取和收集神经元细胞核的实验方案。...

从人死后脑组织中分离神经元细胞核

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI...

高灵敏度检测Balb/C小鼠脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶

来源：Mendez, F. M. et al.，利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp.

神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

RNA 原位 杂交（ISH）能够实现对细胞和组织中RNA的可视化。本文展示了如何将RNAscope...

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位 杂交

本文介绍一种基于辣根过氧化物酶标记的二抗和酪胺信号放大技术的高灵敏度免疫化学方法，用于绘制5mC氧化衍生物的空间分布图谱。...

使用高灵敏度免疫组织化学法检测胞嘧啶的修饰形式

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

表观遗传机制在胶质瘤中经常发生改变。染色质免疫沉淀可用于研究胶质瘤中由组蛋白修饰变化引起的遗传改变后果，这些修饰调控染色质结构和基因转录。本方案描述了对小鼠脑肿瘤神经球进行的天然染色质免疫沉淀实验。...

使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。...

TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

本文介绍了一种利用免疫荧光染色和DNA点杂交方法检测细胞和脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的实验方案。...

小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的检测

本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

学习染色质免疫共沉淀技术在人脑组织中的应用，用于分析组蛋白甲基化等表观遗传调控机制。该方法有助于深入理解正常与疾病状态下人脑基因表达的分子基础。

人类脑组织的染色质分析实验

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