Name: 人类冠状病毒的滴定使用免疫过氧化物酶含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习使用免疫过氧化物酶法对人类冠状病毒进行滴定检测，该方法适用于无细胞病变效应的病毒株。本方案详细演示了病毒样本采集、细胞制备及系列稀释检测的完整实验流程，为病毒学研究提供可靠的定量分析手段。

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本实验方法的完整文字方案可在 <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a> 中获取。

作者无任何利益冲突需要披露。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

利用免疫过氧化物酶法滴定人冠状病毒

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

测定感染性病毒滴度是病毒学研究中一项基础且关键的实验方法。对于不引起明显细胞病变效应的病毒，传统的噬斑测定法无法适用，人类冠状病毒（HCoV）的原型株229E和OC43即属于此类情况。因此，本研究建立了一种替代性的间接免疫过氧化物酶测定法（IPA），用于检测和滴定此类病毒，并在此详细描述。将含有病毒的样品进行系列对数稀释后，接种于96孔板中的易感细胞。病毒增殖后，通过IPA检测病毒，获得以“50%组织培养感染剂量”（TCID50）表示的感染性病毒滴度。该数值代表在一系列实验孔中，有一半孔内含有具有复制能力的感染性病毒时的样品稀释倍数。该技术为在细胞、组织及体液等生物样品中滴定HCoV-229E和HCoV-OC43提供了可靠的方法。本文内容基于首次发表于《分子生物学方法》（Methods in Molecular Biology，2008年，第454卷，第93–102页）的研究工作。

关键词：感染性病毒滴度，间接免疫过氧化物酶测定法，IPA，TCID50，HCoV-229E，HCoV-OC43，人类冠状病毒，病毒滴定，生物样品

在本视频中，我们演示一种利用免疫过氧化物酶检测法这一酶联抗原检测技术来检测病毒并测定其滴度的替代方法。我们将向您展示如何采集病毒样本、制备用于检测的细胞，最后通过系列稀释进行免疫过氧化物酶检测，以确定病毒滴度。

测定感染性病毒滴度是病毒学研究中一项基础且关键的实验方法。传统的空斑试验不适用于……

测定感染性病毒滴度是一种基础的实验方法。然而，对于无明显细胞病变效应的病毒（如人类冠状病毒），使用噬斑实验的经典方法并非最可靠的选择。在本视频中，我们展示了一种利用酶联抗原检测技术——即免疫过氧化物酶实验——来检测和测定病毒滴度的替代方法。本文将向您展示如何采集病毒样本、制备用于检测的细胞，以及最终通过连续稀释法进行免疫过氧化物酶测定以确定病毒滴度。大家好，我是皮埃尔·阿尔博博士（Dr. Pierre Albo），来自加拿大魁北克省拉瓦尔市AM RIP研究所神经免疫学实验室的主任。今天我们将演示如何定量人科罗拉多病毒毒株OT 43和Two Nine E，这两种病毒是无法在培养物中形成蚀斑的代表性毒株。因此，我们开发了一种绕过该问题的检测方法，称为免疫过氧化物酶检测法。为了演示本实验方案，我将向大家介绍我的学生 Gabrielle Marol、我的技术员 Francis Nader，以及我的研究助理 Ellan Jacob。那么我们开始吧。首先，我们需要准备组织样本。我们先对将用于收集各个器官的无菌管进行预称重。在确定每个空管的重量后，我们将在无菌条件下迅速解剖目标器官，然后将其置于冰上保存。需要注意的是，每次解剖之间必须用70%乙醇冲洗器械。在收集完器官后，测定每个生物样本的重量。接下来，我们将在生物安全柜中使用聚四氟乙烯匀浆器，将组织样本与10%无菌PBS进行匀浆。打开匀浆器，然后上下移动试管以破碎组织。每次匀浆完一个样本后，在处理下一个组织样本前，需先用无菌水清洗装置一次，再用70%乙醇清洗一次，最后用PBS清洗一次。样本匀浆后，在 4 摄氏度下以 1000 ×g 离心 20 分钟，收集上清液至新的无菌离心管中。此时，病毒样本可进行免疫过氧化物酶检测处理。否则，可立即将其在-80摄氏度下冷冻并保存，直至准备进行检测。接下来，我们需要制备细胞样品。贴壁细胞和非贴壁细胞的制备方法有所不同，但均涉及收集细胞内和细胞外的病毒滴度。为了测定贴壁细胞中外源性病毒的产生情况，我们需在感染后的适当时间点收集感染细胞的上清液并置于无菌试管中进行检测。为了估算细胞内病毒滴度，首先需要移除培养基，用温热且无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入与原体积相同或已知体积的培养基，并在负80摄氏度条件下进行三次冻融循环。该过程可裂解细胞，使病毒颗粒释放到培养基中。对于非贴壁细胞，我们首先以1000 × g离心5分钟。离心沉淀细胞后，将上清液收集至无菌管中。此上清液代表细胞外的感染性病毒部分。接下来，我们将细胞沉淀重悬于与收集的上清液相同体积的培养基中，或重悬于已知体积的培养基中。随后，在负80摄氏度条件下进行三次冻融循环，以裂解细胞并释放培养基中的病毒颗粒。这代表了具有感染性的病毒的细胞内部分。裂解贴壁或非贴壁细胞后，以1000 ×g离心5分钟。随后可将上清液收集至新的无菌离心管中，并采用免疫过氧化物酶法测定滴度。此外，样品也可立即在-80 °C条件下冷冻保存，待检测时使用。为了检测人冠状病毒在生物样本中的增殖能力，我们拟在易感细胞上进行免疫过氧化物酶检测。首先通过消化处理，从融合的单层细胞中制备易感细胞悬液。在操作人冠状病毒时，使用293T/1细胞作为易感细胞；而对于人冠状病毒OC43，则使用HRT-18细胞系。在制备好易感细胞悬液后，将其接种于96孔组织培养板中。若使用多通道移液器，请根据细胞的适当浓度，每孔加入100 µL细胞悬液。每孔中易感细胞的数量取决于所用细胞的类型以及细胞接种的时间。铺板后，请参阅我们的Springer实验方案以获取更详细的信息。开始免疫过氧化物酶检测之前，需要先用先前制备的样品感染敏感细胞。当敏感细胞达到70%至80%汇合度时，将96孔板用无菌纸巾包裹，轻轻倒扣在另一张无菌纸巾上，从而吸除每孔中的培养基。随后，向每个孔中加入100 µL添加了1% FBS的α-MEM培养基。每个样本应在四列相邻的孔中进行检测。在同一块板上，将待测样本的等分试样每孔加入100 µL，置于第一行。通常将易感细胞以感染样本的系列对数稀释液进行接种。为此，向4个孔中每个孔再次加入11微升相同样品。然后在96孔板的第二行中，使用多通道移液器上下吹打混匀3次，再将每孔中的11微升转移至第三行，依此类推，直至板的最后一行。接种细胞后，将板置于加湿孵育盒中，在33°C、5%CO2条件下孵育，用于人冠状病毒培养。2290 感染细胞在感染人冠状病毒后孵育五天，OC43 感染细胞孵育四天。孵育结束后即可进行病毒检测。孵育结束后，我们即可准备检测病毒。首先，需将培养板中的培养基完全移除。可在超净台内将培养板快速倾倒，使液体滴落至非无菌的纸巾上完成此操作。然后，我们用 PBS 轻柔地润洗细胞，使用多通道移液器向孔中轻轻加入 PBS。将 PBS 从孔中倾倒出去，并用纸巾包裹每块板以去除残留的 PBS。细胞洗涤后，需使用含0.3%过氧化氢的100%甲醇进行固定。将甲醇混合液加入细胞中，室温下静置15至30分钟。30分钟孵育结束后，通过轻弹培养板的方式在水槽上方去除固定液。随后将培养板倒扣，轻弹数次以去除残留固定液，使其接触已铺在实验台面上的几张纸巾。然后将细胞在室温下完全风干，细胞面朝上放置约15至30分钟。在此期间，可用PBS缓冲液配制针对该病毒的特异性抗体溶液，并稀释至适当浓度。接着，向每个孔中加入100 µL特异性病毒抗体溶液，将培养板置于37°C孵育2小时。孵育后，将培养板中的培养基在水槽上方彻底弃去。用 PBS 填满各孔，对培养板进行冲洗。然后将 PBS 在水槽上方弃去，再用 PBS 冲洗一次。重复上述步骤两次。将板倒置轻弹，使残余 PBS 滴落在实验台上的非无菌纸巾上，以彻底去除残留液体。随后，向每个孔中加入 100 µL 以 1:1000 稀释的二抗。在 PBS 中稀释，37 摄氏度孵育平板 2 小时，孵育结束前 30 分钟无需 CO₂。配制检测试剂，即 DAB 与 PBS 和 0.01% 过氧化氢的混合液。用 PBS 洗涤平板三次，方法同前。洗涤平板后，向每个孔中加入100 µL显色试剂。在室温下孵育10至20分钟，或孵育至阳性对照孔出现染色。为终止反应，用去离子水按之前使用PBS的方法洗涤平板一次，并向每个孔中加入100 µL去离子水。最后使用光学显微镜观察各孔，对所有含有染色细胞的孔进行定量分析。至此，我们终于可以确定病毒的滴度。该滴度可通过CAR法进行计算，相关计算公式可在本视频配套的Springer实验方案中找到。我们刚刚向您展示了在此操作过程中如何对人类冠状病毒进行滴定。需要牢记的是，您所处理的样本中同时含有两种病毒，因此必须在无菌条件下操作。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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人类冠状病毒的滴定使用免疫过氧化物酶含量

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