用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

从骨髓中制备树突状细胞可提供大量优质的抗原呈递细胞，可用于活体免疫系统双光子成像的体外或体内实验。引入抗原呈递细胞后，可在活体淋巴结环境中研究抗原特异性的细胞间相互作用。本文演示了骨髓的无菌分离以及培养生成成熟树突状细胞的技术。

此外，我们追踪了树突状细胞从第1天到第11天的发育过程。该发育过程通过静态图像以及使用Scent Technologies IncuSite系统拍摄的培养箱内视频进行展示。最后，我们展示了骨髓来源的树突状细胞在镜像淋巴结中向OT two T细胞呈递cove抗原的过程。

大家好，我是梅兰妮·马修（Melanie Matthew），来自加州大学附近的米卡·哈利实验室。你是否曾经好奇过，在细胞生长过程中，培养箱内部究竟发生了什么？今天？

在本实验方案中，我们将向您展示如何在实验现场使用S系列仪器。Inky现场设备可让您在培养箱中实时监测细胞培养的生长情况。在本方案中，我们将演示如何从小鼠中分离并制备骨髓来源的巨噬细胞。

首先，我将向您演示如何去除股骨并分离骨髓。首先将动物固定。接着，用70%乙醇润湿动物体表。沿动物体正中线做第一个切口。

然后按照我在此处的示范，从腿部内侧进行切割。为了暴露股骨上方的肌肉组织，应将肌肉拨开，并用解剖镊夹住粗大的股骨。用解剖镊夹住骨骼后，沿骨骼向下移动，并在关节下方不远处进行第一处切割。

然后沿股骨长度方向向上剪开，尽量靠近身体处进行切割。这可能会导致少量出血，尤其是剪到股动脉时。在移除股骨的过程中，必须确保骨骼保持完整。

如您在此处所见，骨的两端未被切割或破坏。股骨取出后，剪除任何多余的组织，并将股骨放入盛有PMI培养基的小培养皿中。在去除多余组织时，务必确保股骨不会干燥。

此时，应将股骨转移至含有70%乙醇的培养皿中，并置于冰上5到10分钟。本视频中，我们将在实验台继续操作。然而，在实验的这一阶段，所有操作均应在组织培养罩内进行。

将骨骼浸泡于乙醇后，可将其转移至盛有无菌培养基的较大培养皿中，以进行骨髓的去除。现在我们已准备好去除并重悬骨髓。用无菌培养基填充胰岛素注射器，并将其放置一旁以备后续使用。

用无菌镊子夹住骨头，将其悬于盛放废弃组织的小培养皿上方，从两侧切除骨骺或骨的末端。将胰岛素注射器插入骨的一端，将骨髓冲洗至含有15 mL培养基的容器中。

用生理盐水再冲洗骨髓腔一至两次，直至所有骨髓组织被完全冲出。当骨髓完全被冲出后，骨骼将几乎呈全白色。将清洁后的骨骼放入废弃皿中，并对另一侧股骨重复上述操作。

完成此步骤后，轻柔地分散在洗涤过程中未完全解离的骨髓组织块，以制备单细胞悬液。此过程需通过移液操作持续5到10分钟。将单细胞悬液转移至一支50 mL离心管中，并用10 mL培养基至少洗涤培养板三次。

每次均需离心细胞，弃去培养基，并通过用手指用力且快速地轻弹管底来重悬细胞。为去除红细胞（RBCs），我们采用水裂解法。另一种去除红细胞的方法是氯化铵裂解法。

这两种方法已在之前的 JoVE 视频文章中描述过：使用米兰 max 纯化法从小鼠淋巴结中分离 CD4 阳性 T 细胞（JoVE 第 9 期），以及从大鼠脾细胞制备 T 细胞生长因子（JoVE 第 10 期）。

在去除红细胞后，您现在可以开始进行细胞培养了。因此，在带您了解树突状细胞培养之前，我想先向您介绍 Incus 平台。Incus 平台能够在培养箱内实时监测细胞的生长情况，从而让我们观察细胞的行为或异常行为。

培养建立后，将其放入合适尺寸的托盘中，并推上培养箱的观察窗。然后在计算机上设置时间间隔，选择需要成像的孔位，让成像系统自动为您采集数据。本方案中的视频将展示树突状细胞在体外的形态学变化。

这些视频直接从 Incus 网站程序导出。随着树突状细胞从第1天发育至第11天，可以观察到细胞真实形态的变化，细胞体积增大并逐渐呈现树突状细胞表型。裂解并去除红细胞后，细胞在原代树突状细胞培养基中洗涤，并以每毫升500万个细胞的密度接种。

这些细胞最初应在原代树突状细胞培养基中进行培养，随后转移到添加了40纳克/毫升IL-4和100纳克/毫升TNF-α的继代DC培养基中继续培养。这些细胞因子将促进成熟树突状细胞的发育，使其形态和特性类似于单核细胞来源的树突状细胞。接下来，我将向您展示细胞在培养过程中的形态变化，以及如何长期维持这些细胞培养。

接种细胞后，可在首次更换培养基前将树突状细胞培养 72 小时。这是你在第一天接种细胞后典型的培养状态。以下是细胞的形态。

在第三天，可以看到细胞已开始贴附于培养板上，但尚未呈现典型的树突状细胞表型。在第四天，吸除培养基，并加入10 mL新鲜的初代树突状细胞培养基。在第四天，我们将去除淋巴细胞及其他任何非贴壁细胞。

现在可以将细胞重新放回培养箱中继续培养三天，即在初次接种后的第七天进行。以下是典型的细胞培养状态。此时可以判断细胞需要进行传代和重新接种。

第7天，通过吸出培养基，然后加入300毫摩尔的无菌EDTA，并孵育5分钟，将树突状细胞从培养板上分离。接着，将培养板倾斜45度角，反复用移液器将EDTA溶液冲洗培养板背面，持续数分钟，以确保完全去除所有贴壁的树突状细胞。

将细胞收集到一个50毫升的锥形管中，并用二次DC培养基洗涤两次。然后将细胞重新悬浮并以每板500万个细胞的密度接种。新接种的第七天树突状细胞会迅速沉降到培养板底部，贴壁并开始铺展。

如您在此处Zichy站点的视频中所见，该视频是在培养箱中连续两天拍摄的，用于展示树突状细胞从第7天重新接种到第9天早期的发育过程。可通过添加抗原刺激来激活形态学上的树突状细胞，此处加入2 µg/mL的LPS以及用于与来自OT-II小鼠的T细胞共用的100 µg/mL卵清蛋白（ova），这些OT-II小鼠含有对卵清蛋白特异性的CD4阳性T细胞。如果您使用的是不同的抗原，则必须确保使用最佳浓度的抗原来刺激您的树突状细胞。此处将ova和LPS加入基础培养基中，使LPS的终浓度为2 µg/mL（总体积20 mL），ova的终浓度为100 µg/mL（总体积20 mL）。

这是一张典型的第10天树突状细胞培养物的照片。从这张照片中可以看到，其形态具有典型的抗原呈递细胞特征。您应始终通过流式细胞术检测CD11c阳性树突状细胞的比例。

这是为了确保您在实验中使用的树突状细胞具有相对较高的纯度。在此，我们使用 SEN Instruments 公司的 Inky Site 系统来监测在第10天经 LPS 处理并脉冲抗原的树突状细胞的活化情况。本视频记录了加入 LPS、Val 及多肽后的24小时内树突状细胞的动态变化，期间细胞活性增强，并出现一些明显的形态学改变。

当树突状细胞在抗原脉冲刺激后被激活，可通过加入300毫摩尔EDTA孵育并洗涤培养板再次收集细胞。随后离心沉淀细胞，用50毫升RPMI培养基洗涤两次，以去除多余的抗原，并用适当的细胞示踪染料对细胞进行标记。在本实验中，我将对腹股沟淋巴结中的细胞进行成像。

我们需要将二百万到五百万个树突状细胞注射到图中所示小鼠的侧腹部皮肤内。随后，给予24小时时间，使树突状细胞迁移至引流淋巴结。在本视频中，树突状细胞用CMF two hc（一种蓝色细胞示踪染料）进行标记。

可以看到树突状细胞与针对波形蛋白（volin）具有抗原特异性的标记T细胞相互作用。这些T细胞使用ccf SE进行标记。您也可以使用C-M-T-M-R或其他任何一种细胞示踪染料作为分子探针。这是T细胞与树突状细胞相互作用的早期激活阶段。

由于T细胞具有抗原特异性，你可以观察到T细胞正黏附在蓝色标记的树突状细胞的突起上。本实验方案到此结束，该方案演示了在双光子成像实验中制备和使用小鼠骨髓来源树突状细胞的方法。感谢观看，并祝你自己的实验顺利成功。