Name: 代骨髓衍生的双光子成像使用的小鼠树突状细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学习从小鼠骨髓中分离和培养成熟树突状细胞的方法，利用双光子成像技术实时观察抗原呈递细胞与T细胞的相互作用。该方案为免疫学研究提供了可靠的细胞制备流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

美国国立卫生研究院 Kirchstein 奖学金 博士前奖学金 AI-64128（MPM），GM-41514（MDC），GM-48071（I.P.）

1) 从小鼠体内取出双侧股骨
<ol>
<li>使用解剖剪剪除肌肉，暴露关节（膝关节和髋关节）上下方的股骨。用解剖镊夹住股骨中部，于关节上下方进行剪切，尽可能保留完整的骨骺部分。</li>
<li>使用小型解剖剪尽可能清除残留的肌肉组织。将股骨转移至盛有RPMI的培养皿中。</li>
<li>此后所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。</li>
</ol>
2）股骨灭菌：
<ol>
<li>在通风橱中，将骨骼从 RPMI 转移至一个盛有冰上预冷的 70% 乙醇的小型培养皿中。</li>
<li>让骨骼在冰上的乙醇中浸泡 5 分钟。</li>
</ol>
3）在无菌条件下收集骨髓：
<ol>
<li>将骨骼转移至含有无菌过滤的初级树突状细胞培养基的小型培养皿中。</li>
<li>用无菌镊子夹住骨骼，置于废弃用的培养皿或离心管上方，用无菌剪刀剪去每个骨骺（骨骼两端）。切割应暴露位于骨骼中央、呈鲜红色的骨髓组织。</li>
<li>用一支无菌注射器（26–28号针头），吸取约100–200 mL无菌培养基。</li>
<li>用无菌镊子夹住骨骼，置于盛有新鲜无菌培养基的培养皿上方，将针头插入骨骼的一侧。将针尖置于靠近骨骼顶端的位置，缓慢用无菌培养基冲洗骨骼内部。若针头位于骨骼中央，应可顺利插入。</li>
<li>骨髓会以小块状或整块形式被冲洗出来。&nbsp;应将其完全冲出骨骼，落入无菌培养基的培养皿中。</li>
<li>根据需要重复此步骤，直至将骨骼中的骨髓完全冲洗干净。</li>
<li>当骨骼被彻底清除骨髓后，会呈现白色且半透明状。</li>
<li>对另一侧股骨重复此操作。每根股骨清洗干净后即弃去。</li>
</ol>
4) 重悬并离心骨髓细胞：
<ol>
<li>将细胞转移至无菌的离心管中。</li>
<li>如果骨髓组织仍较完整，需非常轻柔地在培养皿中反复吹打培养基，以将骨髓组织分散成单细胞悬液。此过程可能需要数分钟，应缓慢操作，避免因剪切力过大而损伤细胞。</li>
<li>参照常规哺乳动物细胞的处理方法进行离心。</li>
</ol>
5）细胞裂解：
<ol>
<li>离心结束后，从离心机中取出离心管，将上清液倒入生物安全柜中的小废液管（50 mL 离心管）中。</li>
<li>通过轻轻弹击管底重新悬浮沉淀。</li>
<li>使用无菌过滤水和 10x DPBS 或 10x PBS，按以下体积进行水裂解以去除红细胞（RBCs）：
<ul>
<li>900 mL 无菌过滤水</li>
<li>100 mL 10x DPBS 或 10x PBS</li>
</ul>
</li>
<li>加入水后 5–10 秒内加入 100 mL 10x PBS。此步骤必须立即进行，以确保仅裂解红细胞。建议提前将两支移液器吸满并准备好。</li>
<li>加入 5 mL – 10 mL 无菌 DC 基础培养基。</li>
</ol>
6) 细胞计数：
<ol>
<li>在通风橱中，轻轻旋转并略微倒置试管，混匀6至11 mL骨髓细胞，&nbsp;45度倾斜（倾斜角度以培养基不接触管顶为宜）</li>
<li>将10 mL培养基转移至无菌管中用于计数。 </li>
<li>重悬细胞并再次离心。</li>
</ol>
7) 铺板树突状细胞：
<ol>
<li>细胞应以 1 × 10⁶/mL 的密度接种。</li>
<li>从离心机中取出细胞，弃去上清液，并用适量的初级树突状细胞培养基重悬细胞以进行接种。</li>
<li>放入组织培养孵育箱中。&nbsp;</li>
</ol>
8）培养护理与成熟：
在添加更多培养基或用于任何实验之前，务必检查细胞培养状况。观察细胞的整体健康状态，并检查是否存在潜在污染。
第0天：已接种树突状细胞。
第3天：移除75%的培养基和非贴壁细胞，并重新加入初级树突状细胞培养基。
第6天：初次细胞接种后，按以下步骤重新接种细胞：
<ol>
<li>移除培养基（此时应含有部分非贴壁树突状细胞），并转移至无菌的50 mL Falcon管中，使培养板表面略微湿润（避免贴壁细胞干燥） </li>
<li>向每块培养板中加入含3 mM EDTA的PBS，并静置&nbsp;静置5分钟。 </li>
<li>将培养板倾斜至45度角，轻轻吹打培养基，使其沿培养板底部反复上下流动，以温和地去除未贴壁细胞。</li>
<li>EDTA/PBS 应变得更粘稠，表明细胞正从培养板底部被收集起来。 </li>
<li>经过数分钟后，可将细胞混合物转移至50 mL离心管中。 </li>
<li>每块培养板完成此操作后，均需对细胞进行离心。</li>
<li>在新的无菌10 cm培养皿中，用继代DC培养基以每皿1 × 10^6的密度接种细胞并计数。将细胞放回组织培养孵箱中。</li>
</ol>
第10-11天
用于刺激/抗原负载的成熟树突状细胞。
9）树突状细胞刺激：
<ol>
<li>使用脂多糖（LPS）与目标肽联合进行细胞激活和肽的负载。根据所用LPS来源的不同，不同的刺激条件可能产生更优的效果。此外，树突状细胞呈递所需的目标肽用量应进行优化。本方案中的刺激条件为100 ng/mL LPS和100 µg/mL OVA（卵清蛋白）。&nbsp;</li>
<li>收获或使用前，用抗原负载并用LPS处理18–24小时。</li>
</ol>
树突状细胞培养基：添加所有成分后进行无菌过滤
有关不同树突状细胞培养条件及其所获得的树突状细胞表型的综述，请参见讨论部分。这些培养条件旨在产生成熟的树突状细胞，使其在皮下注射后18-24小时内迅速归巢至引流淋巴结，并有效呈递抗原。
初级树突状细胞培养基：所有成分添加完毕后进行无菌过滤
<ul>
<li>500 mL IMDM（移除 55–60 mL，以获得 500 mL 的终体积）</li>
<li>50 mL 热灭活 FBS</li>
<li>5 mL 200 mM L-谷氨酰胺，终浓度为 2 mM</li>
<li>100 IU/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素（取 10,000 IU/mL 青霉素和 10,000 mg/mL 链霉素储备液各 5 mL）</li>
<li>50 µM β-巯基乙醇（β-Me）（14.3 M β-Me 储备液，在通风橱中按 1:100 稀释，每 100 mL 培养基加入 35 µL，以获得 50 µM 的终浓度）</li>
<li>20–30 ng/mL GM-CSF</li>
<li>100–400 IU/mL IL-4，约相当于 10–40 ng/mL</li>
</ul>
用于成熟的次级DC培养基*
100 ng/mL TNF-α（加入初级DC培养基中） * 注意：GM-CSF + IL-4 应诱导生成未成熟树突状细胞。使用 GM-CSF + IL-4（400 IU/μL）+ TNF-α（100 μg/mL）将诱导生成类似于成熟单核细胞来源的树突状细胞。已知成熟树突状细胞摄取抗原的效率低于未成熟树突状细胞，且培养物中可能有基质细胞释放的内源性TNF-α4。

<ol><li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li>
<li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture%2C+but+in+contrast+to+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%2C+without+inducing+their+functional+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li>
<li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signals+in+CD4%2B+T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li>
<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
</ol>

树突状细胞是适应性免疫反应的关键介导者，也是迄今为止已知最有效的抗原提呈细胞。文献中关于人和小鼠树突状细胞的培养方法，在所用细胞因子类型上存在差异，这些细胞因子用于影响不同类型树突状细胞的发育。值得注意的是，通过使用GM-CSF、flt3L、IL4、IL13、TNF-alpha和IFN-gamma的不同组合，可在体外诱导生成成熟、未成熟、炎症性以及稳态样小鼠骨髓来源树突状细胞3-7在此，我们介绍一种简单的方法，用于制备成熟的鼠源性树突状细胞，该细胞在皮下注射后能够归巢至引流淋巴结，提呈抗原并激活初始T细胞。所获得的树突状细胞群体通常超过85%为CD11c高表达，并在LPS激活后可诱导表达CD80/86。在培养第7天添加TNF-α为可选步骤，可促进获得更成熟的表型8。细胞的维持培养 体外 朗格汉斯树突状细胞培养中，TNF-α 是一种重要的存活因子，但不能刺激细胞成熟9需要注意的是，已有报道称培养基中存在内源性来源（可能是基质细胞）的TNF-α7其他成功用于成像皮下注射树突状细胞的方法包括从脾脏中对CD11c+细胞进行阳性筛选，以及对内源性树突状细胞群体进行...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

文献中报道了多种制备小鼠树突状细胞的方法。本文介绍一种可获得超过85% CD11c高表达树突状细胞的培养方法，该细胞在皮下注射后可归巢至引流淋巴结，并向抗原特异性T细胞呈递抗原（见视频）。此外，我们使用Essen Instruments公司的Incucyte系统监测树突状细胞的成熟过程，结果显示在培养第10天，细胞形态具有成熟树突状细胞的典型特征，且&lt;85%的细胞为CD11c高表达。通过双光子成像对周围淋巴结中抗原呈递过程的研究表明，树突状细胞与T细胞的相互作用可分为三个 distinct 阶段1, 2。第一阶段表现为高迁移活性的抗原特异性T细胞与携带抗原的树突状细胞之间发生短暂的连续接触1, 2。第二阶段的特征是抗原特异性T细胞与携带抗原的树突状细胞之间形成持久性接触1, 2。最后，第三阶段表现为T细胞从树突状细胞上脱离，恢复迁移能力并开始增殖1, 2。这是利用双光子成像技术分析负载抗原并用细胞示踪染料标记的树突状细胞所介导的抗原特异性相互作用的一个实例。

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。

文献中报道了多种小鼠树突状细胞的制备方法。本文介绍一种可获得超过85%纯度的方法……

从骨髓中制备树突状细胞可提供大量优质的抗原呈递细胞，可用于活体免疫系统双光子成像的体外或体内实验。引入抗原呈递细胞后，可在活体淋巴结环境中研究抗原特异性的细胞间相互作用。本文演示了骨髓的无菌分离以及培养生成成熟树突状细胞的技术。此外，我们追踪了树突状细胞从第1天到第11天的发育过程。该发育过程通过静态图像以及使用Scent Technologies IncuSite系统拍摄的培养箱内视频进行展示。最后，我们展示了骨髓来源的树突状细胞在镜像淋巴结中向OT two T细胞呈递cove抗原的过程。大家好，我是梅兰妮·马修（Melanie Matthew），来自加州大学附近的米卡·哈利实验室。你是否曾经好奇过，在细胞生长过程中，培养箱内部究竟发生了什么？今天？在本实验方案中，我们将向您展示如何在实验现场使用S系列仪器。Inky现场设备可让您在培养箱中实时监测细胞培养的生长情况。在本方案中，我们将演示如何从小鼠中分离并制备骨髓来源的巨噬细胞。首先，我将向您演示如何去除股骨并分离骨髓。首先将动物固定。接着，用70%乙醇润湿动物体表。沿动物体正中线做第一个切口。然后按照我在此处的示范，从腿部内侧进行切割。为了暴露股骨上方的肌肉组织，应将肌肉拨开，并用解剖镊夹住粗大的股骨。用解剖镊夹住骨骼后，沿骨骼向下移动，并在关节下方不远处进行第一处切割。然后沿股骨长度方向向上剪开，尽量靠近身体处进行切割。这可能会导致少量出血，尤其是剪到股动脉时。在移除股骨的过程中，必须确保骨骼保持完整。如您在此处所见，骨的两端未被切割或破坏。股骨取出后，剪除任何多余的组织，并将股骨放入盛有PMI培养基的小培养皿中。在去除多余组织时，务必确保股骨不会干燥。此时，应将股骨转移至含有70%乙醇的培养皿中，并置于冰上5到10分钟。本视频中，我们将在实验台继续操作。然而，在实验的这一阶段，所有操作均应在组织培养罩内进行。将骨骼浸泡于乙醇后，可将其转移至盛有无菌培养基的较大培养皿中，以进行骨髓的去除。现在我们已准备好去除并重悬骨髓。用无菌培养基填充胰岛素注射器，并将其放置一旁以备后续使用。用无菌镊子夹住骨头，将其悬于盛放废弃组织的小培养皿上方，从两侧切除骨骺或骨的末端。将胰岛素注射器插入骨的一端，将骨髓冲洗至含有15 mL培养基的容器中。用生理盐水再冲洗骨髓腔一至两次，直至所有骨髓组织被完全冲出。当骨髓完全被冲出后，骨骼将几乎呈全白色。将清洁后的骨骼放入废弃皿中，并对另一侧股骨重复上述操作。完成此步骤后，轻柔地分散在洗涤过程中未完全解离的骨髓组织块，以制备单细胞悬液。此过程需通过移液操作持续5到10分钟。将单细胞悬液转移至一支50 mL离心管中，并用10 mL培养基至少洗涤培养板三次。每次均需离心细胞，弃去培养基，并通过用手指用力且快速地轻弹管底来重悬细胞。为去除红细胞（RBCs），我们采用水裂解法。另一种去除红细胞的方法是氯化铵裂解法。这两种方法已在之前的 JoVE 视频文章中描述过：使用米兰 max 纯化法从小鼠淋巴结中分离 CD4 阳性 T 细胞（JoVE 第 9 期），以及从大鼠脾细胞制备 T 细胞生长因子（JoVE 第 10 期）。在去除红细胞后，您现在可以开始进行细胞培养了。因此，在带您了解树突状细胞培养之前，我想先向您介绍 Incus 平台。Incus 平台能够在培养箱内实时监测细胞的生长情况，从而让我们观察细胞的行为或异常行为。培养建立后，将其放入合适尺寸的托盘中，并推上培养箱的观察窗。然后在计算机上设置时间间隔，选择需要成像的孔位，让成像系统自动为您采集数据。本方案中的视频将展示树突状细胞在体外的形态学变化。这些视频直接从 Incus 网站程序导出。随着树突状细胞从第1天发育至第11天，可以观察到细胞真实形态的变化，细胞体积增大并逐渐呈现树突状细胞表型。裂解并去除红细胞后，细胞在原代树突状细胞培养基中洗涤，并以每毫升500万个细胞的密度接种。这些细胞最初应在原代树突状细胞培养基中进行培养，随后转移到添加了40纳克/毫升IL-4和100纳克/毫升TNF-α的继代DC培养基中继续培养。这些细胞因子将促进成熟树突状细胞的发育，使其形态和特性类似于单核细胞来源的树突状细胞。接下来，我将向您展示细胞在培养过程中的形态变化，以及如何长期维持这些细胞培养。接种细胞后，可在首次更换培养基前将树突状细胞培养 72 小时。这是你在第一天接种细胞后典型的培养状态。以下是细胞的形态。在第三天，可以看到细胞已开始贴附于培养板上，但尚未呈现典型的树突状细胞表型。在第四天，吸除培养基，并加入10 mL新鲜的初代树突状细胞培养基。在第四天，我们将去除淋巴细胞及其他任何非贴壁细胞。现在可以将细胞重新放回培养箱中继续培养三天，即在初次接种后的第七天进行。以下是典型的细胞培养状态。此时可以判断细胞需要进行传代和重新接种。第7天，通过吸出培养基，然后加入300毫摩尔的无菌EDTA，并孵育5分钟，将树突状细胞从培养板上分离。接着，将培养板倾斜45度角，反复用移液器将EDTA溶液冲洗培养板背面，持续数分钟，以确保完全去除所有贴壁的树突状细胞。将细胞收集到一个50毫升的锥形管中，并用二次DC培养基洗涤两次。然后将细胞重新悬浮并以每板500万个细胞的密度接种。新接种的第七天树突状细胞会迅速沉降到培养板底部，贴壁并开始铺展。如您在此处Zichy站点的视频中所见，该视频是在培养箱中连续两天拍摄的，用于展示树突状细胞从第7天重新接种到第9天早期的发育过程。可通过添加抗原刺激来激活形态学上的树突状细胞，此处加入2 µg/mL的LPS以及用于与来自OT-II小鼠的T细胞共用的100 µg/mL卵清蛋白（ova），这些OT-II小鼠含有对卵清蛋白特异性的CD4阳性T细胞。如果您使用的是不同的抗原，则必须确保使用最佳浓度的抗原来刺激您的树突状细胞。此处将ova和LPS加入基础培养基中，使LPS的终浓度为2 µg/mL（总体积20 mL），ova的终浓度为100 µg/mL（总体积20 mL）。这是一张典型的第10天树突状细胞培养物的照片。从这张照片中可以看到，其形态具有典型的抗原呈递细胞特征。您应始终通过流式细胞术检测CD11c阳性树突状细胞的比例。这是为了确保您在实验中使用的树突状细胞具有相对较高的纯度。在此，我们使用 SEN Instruments 公司的 Inky Site 系统来监测在第10天经 LPS 处理并脉冲抗原的树突状细胞的活化情况。本视频记录了加入 LPS、Val 及多肽后的24小时内树突状细胞的动态变化，期间细胞活性增强，并出现一些明显的形态学改变。当树突状细胞在抗原脉冲刺激后被激活，可通过加入300毫摩尔EDTA孵育并洗涤培养板再次收集细胞。随后离心沉淀细胞，用50毫升RPMI培养基洗涤两次，以去除多余的抗原，并用适当的细胞示踪染料对细胞进行标记。在本实验中，我将对腹股沟淋巴结中的细胞进行成像。我们需要将二百万到五百万个树突状细胞注射到图中所示小鼠的侧腹部皮肤内。随后，给予24小时时间，使树突状细胞迁移至引流淋巴结。在本视频中，树突状细胞用CMF two hc（一种蓝色细胞示踪染料）进行标记。可以看到树突状细胞与针对波形蛋白（volin）具有抗原特异性的标记T细胞相互作用。这些T细胞使用ccf SE进行标记。您也可以使用C-M-T-M-R或其他任何一种细胞示踪染料作为分子探针。这是T细胞与树突状细胞相互作用的早期激活阶段。由于T细胞具有抗原特异性，你可以观察到T细胞正黏附在蓝色标记的树突状细胞的突起上。本实验方案到此结束，该方案演示了在双光子成像实验中制备和使用小鼠骨髓来源树突状细胞的方法。感谢观看，并祝你自己的实验顺利成功。

generation-bone-marrow-derived-murine-dendritic-cells-for-use-2

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

代骨髓衍生的双光子成像使用的小鼠树突状细胞

我们提供了生成新生嵌合体的逐步操作说明，以及为进行双光子显微镜离体成像而进行的胸腺解剖与制备方法。...

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。...

小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

近年来，利用磁共振成像（MRI）进行细胞示踪受到了广泛关注。本实验方案描述了使用富含氟（19F）的颗粒对树突状细胞进行标记、将标记后的细胞体内应用，以及通过19F/1H...

监测树突状细胞迁移的19F / 1H磁共振成像方法

本研究中，我们介绍了一种 体外 可高效生成浆细胞样树突状细胞的培养系统 由 在Flt3配体存在下，将普通淋巴样祖细胞与AC-6饲养细胞共培养。...

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

学习从小鼠骨髓中分离和培养成熟树突状细胞的方法，利用双光子成像技术实时观察抗原呈递细胞与T细胞的相互作用。该方案为免疫学研究提供了可靠的细胞制备流程。

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

探索更多视频