Name: 从MEFs基质胶3:传代的胚胎干细胞从基质胶到基质胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: 学习在无饲养层条件下使用基质胶培养和传代人胚胎干细胞的方法。本视频演示如何通过免疫荧光显微镜验证细胞多能性，帮助研究人员掌握干细胞维持技术。

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Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究得到了加州再生医学研究所（CIRM）种子基金 RS1-00313 的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）再生医学与干细胞研究Broad中心的成员，特别是 Amander Clark 博士、Jerome Zack 博士，以及UCLA Broad研究所干细胞核心设施的工作人员对本研究工作的支持。

将人胚胎干细胞从基质胶转移至基质胶
通常，一个在Matrigel上生长至融合的6孔板人胚胎干细胞可按1:3至1:5的比例传代至另一个Matrigel板，传代后4-5天孔内细胞再次达到融合状态。
<ol>
<li>在传代前，按照上述方法准备 CM 和 Matrigel 培养板。</li>
<li>传代当天，用 1×PBS（pH 7.4）清洗每个待传代的孔，每孔加入 1 ml 浓度为 1 mg/ml 的 Dispase（用 DMEM/F12 培养基将 5 mg/ml 储存液稀释），在 37°C 下孵育 3 分钟。</li>
<li>用 1×PBS（pH 7.4）清洗每个孔三次，每孔加入 1 ml 不含 bFGF 的 ES 培养基，使用细胞刮刀将细胞集落从孔底刮下，收集悬浮的 hESC 细胞至 50 ml 离心管中，在室温下以 200g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。</li>
<li>将 hESC 细胞重铺至 Matrigel 培养板时，先用 DMEM/F12 清洗 Matrigel 培养板，每孔加入 2.5 ml 添加了 10 ng/ml bFGF 的 CM 培养基。用适量添加了 10 ng/ml bFGF 的 CM 培养基重悬 hESC 细胞沉淀，轻轻吹打细胞悬液 3 次。（注意：当用于传代的 hESC 来自 Matrigel 培养板时，细胞团块非常容易分散，因此吹打 3 次已足够，过多吹打可能导致集落过度破碎，产生单细胞。）将 0.5 ml hESC 细胞团悬液分装至 6 孔 Matrigel 培养板的每孔中，使最终体积达到每孔 3 ml。将培养板放入 37°C 培养箱中培养。</li>
</ol>
通过免疫荧光显微镜检测多能性标志物
采用免疫荧光显微镜检测人胚胎干细胞在培养过程中多能性标志物 Oct-4 和 SSEA-4 的表达情况。
<ol>
<li> 吸去一个孔中的培养基，用 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次。向孔中加入 2 ml 3.7% 多聚甲醛，室温固定 10 分钟。</li>
<li> 用 1×PBS（pH 7.4）冲洗一次，向孔中加入 2 ml 甲醇，置于 -20°C 处理 2 分钟。</li>
<li> 用 1×PBS（pH 7.4）冲洗一次，加入 1 ml 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温封闭 5 分钟。</li>
<li> 加入 1 ml Oct-4 或抗人/鼠 SSEA-4 抗体（以 0.2% BSA 按 1:200 稀释），室温孵育 1 小时或 4°C 过夜。（注意：若进行 SSEA-4 染色，可直接进入第 6 步）</li>
<li> 用 1×PBS（pH 7.4）洗涤三次，加入 1 ml FITC 标记的兔 IgG 二抗（以 0.2% BSA 按 1:500 稀释），室温避光孵育 1 小时。</li>
<li> 用 1×PBS（pH 7.4）洗涤三次，在孔中央滴加一滴封片液（如需观察细胞核，可选用含 DAPI 的封片液）。将盖玻片覆盖于细胞上，用指甲油封边，通过免疫荧光显微镜观察结果。</li>
</ol>
人类胚胎干细胞接收
ES 培养基（胚胎干细胞培养基）：
DMEM/F12 - 400ml Knockout 血清替代物 - 100ml 非必需氨基酸 - 5ml 200mM GlutaMax / BME 溶液 - 5ml 青霉素 / 链霉素 - 5ml
充分混匀，并将最终的hESC培养基分装至500 ml瓶中，4°C保存。最多可保存两周。
MEF 培养基：
DMEM - 1000ml FBS - 100ml 非必需氨基酸 - 10ml 谷氨酰胺 - 10ml 青霉素/链霉素 - 10ml
充分混匀，并将最终的MEF培养基在4°C下保存。
200 mM 谷氨酰胺 / BME 溶液：
Glutamax - 100 ml β-巯基乙醇（14.3 M 储存液）- 140 µl 将两种溶液充分混合，然后分装为每份 10 ml。将分装液保存于 -20°C。 bFGF 溶液（储存液终浓度：10 微克/毫升）： bFGF（FGF2）- 50 µg 含 0.1% BSA 的 1×PBS 缓冲液，pH 7.4 - 5 ml
将50微克bFGF溶解于5毫升0.1% BSA中，配制成10 µg/ml的储存液。分装为500 µl每份，于-80°C保存。
IV型胶原酶溶液（1毫克/毫升）：
胶原酶IV - 50mg DMEM/F12培养基 - 50ml
将胶原酶IV粉末加入一个50 ml Falcon离心管中。在生物安全柜中，加入50 ml无菌DMEM/F12培养基。涡旋混匀溶液 &lt; 1 分钟，确保粉末完全溶解。在通风橱中，使用 0.22 µm 滤器过滤溶液至新的无菌 50 ml Falcon 管中。该溶液在 4°C 保存条件下最多可稳定存放 2 周。
Dispase 溶液（1 mg/ml）：
Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 培养基 - 8ml 将市售的 5mg/ml Dispase 溶液分装，并于 -20°C 保存。使用 DMEM/F12 将 Dispase 稀释至 1mg/ml。该溶液可在 4°C 保存 1 周。

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

本系列共3个视频，演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）（视频1），如何将细胞传代至不含饲养层细胞的Matrigel培养板（视频2），以及如何在无饲养层细胞的Matrigel条件下维持hESCs的培养（视频3）。大量先前研究表明，为了维持存活且未分化的hESCs，需将其培养在失活的MEF饲养层细胞上。然而，在许多实验中，需要获得完全不含饲养层细胞污染的纯hESC群体。为实现这一目标，我们展示了如何将hESCs从MEF饲养层培养板传代至无饲养层细胞的Matrigel培养板，以及如何在无饲养层条件下维持并连续传代hESC克隆。按照本方案操作，在Matrigel培养板的第一代传代中可能仍存在少量MEF饲养层细胞污染，但此类污染通常易于观察识别。自Matrigel第二代传代起，通常不再检测到MEF污染，从而获得可用于实验的纯hESC群体。需要通过免疫荧光染色与显微镜检查，或流式细胞术检测hESC多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认hESCs在培养过程中维持于未分化状态。

<table><tbody><tr><td>Knockout血清替代物（KSR）</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> 非必需氨基酸</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>试剂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>生物医学工程</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>试剂</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>试剂</td><td>干细胞技术</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 </td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>试剂</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>试剂</td><td>BD 生物科学</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 抗体</td><td>试剂</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>抗-h/mSSEA-4 藻红蛋白&amp;#8211;rythrin 标记的小鼠 IgG3</td><td>试剂</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗兔IgG</td><td>试剂</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

从 mef 到 matrigel 3：将人胚胎干细胞从 matrigel 传代至 matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时，还通过免疫荧光显微镜检测验证了在无饲养层细胞条件下培养的hESCs的多能性。

本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时演示了通过免疫荧光显微镜检测在无饲养层细胞条件下培养的hESCs多能性的方法。本视频为共3部分中的第3部分。

从 MEF 到 Matrigel 3：将人胚胎干细胞从 Matrigel 传代至 Matrigel

本视频演示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何对其进行连续传代……

将生长在Matrigel上的人胚胎干细胞进行传代时，使用两种Matrigel。我们从一个在Matrigel上已长满的六孔板胚胎干细胞开始，可将其以1:3至1:5的比例传代至另一个Matrigel包被的培养板中。这样，在传代当天进行分种后，培养孔可在4至5天内再次达到完全汇合状态。用 1 mL pH 7.4 的 XPBS 洗涤将要分装的每个孔。然后向每孔加入 1 mL 浓度为 1 毫克/毫升的 dis paste，于 37 摄氏度孵育 3 分钟。再用 1 mL pH 7.4 的 XPBS 洗涤每个孔 3 次。然后加入1毫升不含BF GF的胚胎干细胞培养基，使用细胞刮刀将细胞集落从孔板底部刮下。将重悬的胚胎干细胞收集至15毫升Falcon离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟形成细胞沉淀。为了将人胚胎干细胞重新接种到Matrigel包被的培养板上，首先用D-M-E-M-F 12洗涤Matrigel板，并加入2.5毫升甲基纤维素条件培养基，该培养基补充有10纳克/毫升的因子。细胞经离心后，每孔加入含10纳克/毫升bFGF的适当体积的培养基，重悬人耳源性干细胞沉淀。用移液器将细胞悬液轻轻吹打混匀3次。请注意，Matrigel 中的干细胞团块容易分散，因此吹打三次即可充分打散团块，但又不会使细胞集落过小。最后，每孔加入 0.5 毫升人 amry 干细胞悬液，使每孔终体积为 3 毫升。最后，确保细胞团块均匀分散，然后将培养板放入37摄氏度的培养箱中。根据特定的人羊水干细胞系，人羊水干细胞在传代后四到五天会再次达到汇合状态。当克隆开始相互接触时，重要的是要确定你所培养的人羊水干细胞是否仍保持多能性或干性。在人类胚胎干细胞培养过程中，为了检测细胞的多能性，我们采用免疫荧光显微镜检测多能性标志物OCT4和SSEA4的表达情况，观察六孔板中的其中一个孔。六孔板中的细胞经过固定并用OCT4和SSEA4进行染色。如果观察到细胞对这两种标志物均呈现荧光标记阳性，则表明我们的人类胚胎干细胞已维持多能性，可用于后续实验。我们刚刚向您展示了如何在无饲养层条件下，于基质胶上培养和维持具有多能性的高活性人胚胎干细胞，包括胚胎干细胞、成纤维细胞和饲养层细胞的培养。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

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从 MEF 到 Matrigel 2：将 hESC 从 MEF 分离并接种到 Matrigel 上

人类胚胎干细胞向特定细胞类型的定向分化在再生医学领域引起了广泛关注。我们提供了一种简明、逐步的实验方案，用于确定 体内...

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由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

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通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

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