全基因组阵列比较基因组杂交技术示范
August 5th, 2008
这个视频是一个全基因组平铺路径阵列比较基因组杂交，扫描整个人类基因组只用25-100纳克的DNA，可以从多种来源，包括档案福尔马林固定材料隔离技术示范的杂交协议。
以下简短演示是一段视频，展示了 27 K 兆碱基亚碱基阵列的杂交方案。该阵列或智能阵列由打印在单个玻片上的 26， 946 个单独测序的反向克隆组成。它们一式两份进行点样，每张幻灯片总共有 54， 000 个元素，打印在 18 x 54 毫米的区域内。
所得数据与高密度寡核苷酸阵列相当，无需生物信息学解释数据。使用大型插入阵列（如反向克隆）的一个主要优点是，它允许使用低至 100 ng 的样品 DNA，而无需扩增。这允许分析各种样品，例如来自血液、冷冻组织分选细胞的 DNA 和 FFPE 材料。
智能阵列已被证明在临床环境中有用。在 BC 癌症机构，多患者样本分析很容易适应平均工作周。用于细胞遗传学。
数组 CGH 中使用的大多数步骤类似于传统的 CGH 或鱼。允许将实验步骤快速引入已建立的实验室。DNA 的质量是对芯片结果影响最大的单一因素。
CGH 杂交、质量差或受污染的 DNA 会对 PSI 掺入产品产生不利影响，导致数据中出现暗淡的图像或噪声。NanoDrop 分光光度计是在杂交前评估 DNA 质量的出色工具。定量 DNA 组，使用用于测量核酸的 NanoDrop 和用于测量 DNA 50 空白的模式，使用 NanoDrop 加入 1.5 μL 与重悬样品相同的溶液。
在本例中，它是水 Tris。EDTA 已被证明对 PS D 掺入有潜在的负面影响。用 Kim 擦拭擦去空白擦拭，加入 1.5 μL 样品量度，并记录样品浓度。
NanoDrop 上的两个 60 对 2 80 读数是 DNA 质量的良好指标，其中 1.8 的比率是最佳的。双倍比法 2 60 对 2 80 和 2 60 对 2 30 为测定样品纯度提供了更好的方法。NanoDrop 显示一条曲线，表示相对于波长的吸光度。
没有峰的平滑曲线表明 DNA 擦拭质量良好，用水和 Kim 擦拭清洁 NanoDrop，或者如果样品有限，则将样品从基座上移出。该方案针对 100 至 400 ng 样品进行了优化。200 ng 是优质 DNA 的目标量要标记样品，需要以下试剂和设备。
缓冲液 SCI 3 个 SCI，5 个随机 ER，10 倍 DNTP 混合物，参考 DNA，无菌水，0.2 微升无菌 PCR 管，100 摄氏度的冰块，45 摄氏度的培养箱。设置一个用于参考 DNA 的反应管和一个反应管。对于样本 DNA，它们将分别用 sci-fi 和 SCI 3 标记。
在研究环境中，我们更喜欢使用 CY 3 作为样品 DNA，因为它更耐臭氧降解。将 DNA 水和管道缓冲液混合到样品中，然后对参比 DNA 重复此作。在我们的实验室中，我们将 10 倍缓冲液与随机 Optimus 相结合。
要制备五次溶液，请添加无菌水至总体积为 17 μL。将试管转移到加热块上，在 100 摄氏度下变性 5 分钟。立即转移到冰上。
加入 4 微升 10 倍 DNTP 混合物。添加侧眼。向样品 DNA 中加入 2 μL SCI 3 标记的 DCTP。
向参考 DNA 中加入 2 μL scifi 标记的 DCTP。加入 2.5 微升根管并混合。溶液可以是手工混合的，也可以是涡旋混合的。
在台式离心机中用快速脉冲将溶液短暂旋转至管底。转移到烤箱中，在 37 度下孵育过夜。过夜杂交时间可在 14 至 24 小时之间调整，而不会对标记过程产生不利影响。
为了适应实验室时间表，使用 MicroCon YM 30 色谱柱，向色谱柱中加入 100 μL 捕获的 1D NA。小心不要用卡住的移液器吸头接触膜。众所周知，即使从主要分销商处购买，也会发生 DNA 批次间差异。
建议大批量购买并在使用前进行测试。现在每个样品杂交将有两根试管，一根为蓝色，一根为红色。合并每个样品的试管并通过移液混合。
然后将整个溶液转移到 MicroCon 膜上。将色谱柱放入提供的 MicroCon 管中，以 13， 000 G 离心 10 分钟。MicroCon 色谱柱是一种体积排阻柱，可捕获带有掺入的侧染料的 DNA，并允许未掺入的染料通过膜清洗。
要洗涤任何残留的未掺入核苷酸或侧面，请在膜中加入 200 μL 无菌蒸馏水。再次以 13， 000 G 离心 10 分钟。丢弃试管，向 MicroCon 浓缩柱顶部添加 45 μL 杂交溶液。
我们使用的杂交解决方案是 Roche Scientific 的 Dig Easy，也可以将 5 微升共享鲱鱼精子添加到溶液中。传统上，这用于阻止与载玻片表面的非竞争性结合。新的结合物质的出现使这一步骤得以消除。
但是，有时会添加它以增加杂交溶液的粘度。倒置 MicroCon 柱并放入新标记的试管中。以 3000 G 离心试管 3 分钟。
溶液将积聚在新管的底部。1.5 微升溶液将用于 SD 掺入的定量。将 NanoDrop To 微阵列分析设置为空白。
NanoDrop 具有 1.5 微升挖掘能力。Easy 杂交缓冲液。用 NanoDrop 测量坯料。
读数应为零。用 kim 拭除拭除擦去空白抹布，加入 1.5 μL 样品量度，并记录样品掺入情况。NanoDrop 将为您提供 S3 和科幻染料掺入样品的每微升浓度的 PICA 摩尔，掺入如下。
应认为每微升 3 ole 的 Fluor 4 太少 要继续，NanoDrop 将显示吸光度与波长的关系图。应该可以看到两个峰，每个侧眼一个，用水和 kim 擦拭清洁 NanoDrop。将盖子 Slip 放在载玻片加热器上或加热块预热至 45 摄氏度以保持杂交温度。
将 42 微升探针溶液放在 22 毫米 x 60 毫米的盖玻片上。确保溶液中没有气泡。去除顽固气泡的一个快速技巧是拿一张新的盖玻片，然后用尖角戳破气泡。
将载玻片对准盖玻片和探针溶液。降低玻片的一个边缘，使其与杂交溶液接触。继续降低一个边缘，直到盖玻片以表面张力附着在载玻片上。
反转幻灯片。将玻片放入杂交盒中，预热至 45 摄氏度，并在下槽中加入 10 微升水以控制湿度。应练习此步骤，因为挖掘易在较低温度下结晶，并在载玻片上留下背景。
当溶液位于载玻片上时，这一点尤其重要，因为它是一层非常薄的液体。此时，密封盒并在 45 摄氏度下孵育 36 至 40 小时。从杂交盒中取出载玻片至关重要。
挖出，常温下易结晶。应立即将玻片浸入洗涤液中，并取下盖玻片。所有洗涤液都应是预制的，并且 pH 值为 7，非中性 pH 值可能会降低侧眼质量。
将洗涤液预热至 45 摄氏度。在打开杂交室之前，将大约 60 毫升洗涤液加入 Copeland 染色缸中。打开腔室。
用镊子取下载玻片，并将载玻片加入洗涤液中。在盖玻片仍贴上的情况下，等待 10 到 20 秒，然后用镊子取回盖玻片。它应该从滑梯上掉下来。
这是一个重要的步骤，因为它可以防止 dig easy 缓冲液结晶，并通过机械移除盖玻片来减少对载玻片的任何潜在划痕。在洗涤液中洗涤载玻片 3 次。每人一分钟，伴有激动。
冲洗载玻片 3 次。最后一次洗涤后，洗涤液中 SDS 的残留气泡不应可见。将玻片留在洗涤液中，直到准备离心。
在 50 mL Falcon 试管中以 700 G 离心 1 分钟。使用前确保 Falcon 管干燥。立即扫描玻片，因为信号强度会随着时间的推移而减弱。
根据环境臭氧水平，每个扫描仪都不同，但需要遵循一些通用准则。用于玻片成像。在扫描过程中，环境臭氧水平至关重要。
Sci-fi Die 对臭氧敏感，在长时间扫描时会迅速降解。已经表明，十亿分之五的臭氧会影响 S 5。这相当于晴朗的日子里轻微的交通污染。
建议使用臭氧计来记录环境臭氧水平。将为每个通道 S3 和 SCI 5 创建一个单独的映像。可以通过改变扫描仪的曝光、时间、激发、输入或捕获灵敏度来平衡通道。
这些图像现在已准备好进行分析。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本视频演示了全基因组平铺路径阵列CGH的杂交协议，使得以最少的DNA输入扫描整个人类基因组成为可能。该方法允许分析各种样本类型，包括存档材料。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- DNA分析
- 杂交技术
背景
- 该阵列由26,946个单独测序的背向克隆组成。
- 每个载玻片总共包含54,000个元素。
- 获得的数据与高密度寡核苷酸阵列相当。
- 数据分析不需要生物信息学解释。
研究目的
- 演示基因组扫描的杂交协议。
- 利用最少的DNA样本进行全面的基因组分析。
- 促进在基因组研究中使用多种样本类型。
使用的方法
- 全基因组平铺路径阵列CGH的杂交协议。
- 使用来自各种来源的25-100 ng的DNA。
- 应用在载玻片上点染的背向克隆的重复拷贝。
- 分析样本而无需扩增。
主要结果
- 成功以低DNA输入扫描人类基因组。
- 能够分析来自血液、冷冻组织和FFPE材料的DNA。
- 数据质量与高密度阵列相当。
- 无需复杂的生物信息学要求便可分析。
结论
- 该杂交协议对全基因组分析有效。
- 最少的DNA要求拓宽了样本类型的范围。
- 该方法增强了基因组研究的可访问性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
