在诱导过继性迟发型超敏反应后对耳部效应记忆T细胞的成像

您好，我是 Melanie Matthew。我是加州大学尔湾分校生理学与生物物理学系 Micah Hollins 实验室的一名研究生。今天，我将与 Christine Beaton 博士一起向您展示我们如何对大鼠耳朵中的应答效应 T 细胞或记忆 T 细胞群体进行成像。

Christine Beaton 博士将首先在大鼠耳部诱导迟发型超敏反应（DTH），随后通过双光子显微镜对大鼠耳部进行原位成像。两天前，我将 GFP 标记的白蛋白特异性 T 细胞注射至 Lewis 大鼠体内。

今天，我将对同一只大鼠的耳部进行干预。在右耳，我将注射白蛋白；而在左耳，我仅注射一些PBS。

我注射的白蛋白剂量为20微克，溶于20微升溶液中。所用的白蛋白是等量混合的德克萨斯红标记白蛋白与未标记白蛋白。接下来，我将向您展示注射的操作方法。

所以我用我的左手，我是右撇子。我把左手的手套脱掉，以便能将一根手指放在耳下，另一根手指放在耳上，拉紧皮肤，这样我就能准确看清针头的位置，并将针插入皮肤的两层之间，那里有一层很薄的空气。为此，我使用27号针头，以便用极细的针具进行操作。

因此，如果我把它翻转过来，你就能清楚地看到 Texas red 的分布位置以及 PBS 的分布位置。目前，我们已处于激发后的 42 小时，接下来我将使用弹簧加载的测微计来测量耳部厚度。我将测量两只耳朵，即接受白蛋白激发的右耳和未接受激发的左耳，两者厚度的差异将帮助我们评估炎症反应的强度。

哦，62 0 60 0 61，0 60 或 58 或 57 或 57。另一只耳朵是 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46，4 50。你好。Christine Beaton 刚刚把测量迟发型超敏反应（DTH）后取出的大鼠交给我们。

我们已将样本置于冰上运送至此。这是来自大鼠的左耳。现在我们在 Ian Parker 的实验室进行双光子显微镜观察。

因此，我将为这些耳朵进行原位双光子成像的准备工作。我将从大鼠耳朵的耳基部开始处理其中一个耳朵。该部位组织较厚，并且有一些竖起的毛发，如果直接开始切割，会显得比较杂乱。

首先，我将剪掉部分毛发。我轻轻抓住耳朵，用手指夹住组织，这样用拇指和食指夹持时能更方便地控制组织。

我更喜欢用手而不是镊子，因为用镊子时，我总是感觉不太清楚组织的具体情况，而且我们一直担心会损伤组织。因此，我们希望能够切实感知到操作时的状况，所以我更喜欢用手操作。

这是大鼠耳部的真皮层从此处分离的现象。因此，当我修剪掉部分毛发时，能够轻轻剪除一些已经自然剥离的真皮组织。可以使用一些非常小巧的解剖剪刀，最好是略带弧度的剪刀来完成此操作。

不要刺破组织，应从耳部基部向顶部轻轻切开，逐步分离部分真皮层。因此，我们并不需要很大的成像窗口，仅此区域就足以获得清晰的细胞浸润组织图像。

因此，您可以看到耳部基底处仍保留着一些完整的血管，并且这些血管几乎一直延伸到耳尖。这一整片区域都非常适合进行迟发型超敏反应（DTH）成像。接下来，我将把已暴露的这部分组织切下，制备成一小块组织样本，以便将其固定在我们的成像载台上。

因此在这里切一下，然后将其翻转。我可以在这一位置进行切割。这样就得到了一小块组织，可用于我们的双光子显微镜成像前的制备。

这些是我们根据组织大小裁剪的不可破碎的塑料盖玻片。然后使用 bet bond 将组织固定在这些盖玻片上。接着，使用硅脂将这些不可破碎的塑料盖玻片固定在原位成像载台。

我将取用这块较小的空气组织，它带有一点弧度，因此在用胶固定时需要将其展平。虽然并不理想，但可以满足要求。取一片盖玻片，根据耳朵的大小大致估量，剪成比你预想稍大一些的尺寸即可。

为了将组织贴附到盖玻片上，我们使用一种对组织安全的超级胶水，称为 bet long。该产品购自 3M 公司，只需在盖玻片上滴加几滴即可。

我不希望使用过多。同时，你还需要确保胶水均匀分布。因此，我将取一小片镜头纸，用其角落将胶水在盖玻片上均匀吸涂开。

会有一点多余的胶水，一旦这种胶水接触到水就会固化。因此，处理组织样本时必须格外小心。我将捏住组织的这个角落，这里可能不会用于成像，因为它位于弯曲的部分。

我会将其稍微擦干一点，底部在镜头纸上轻轻擦拭，确保完全干燥。然后，我将用这块大鼠耳组织的角部接触盖玻片。

它应该在我触碰的位置立即凝固。其余部分，我只需轻轻按压边缘，使其稍微平整一些。这样我们就能获得一个理想的成像视野。

现在，我将通过将组织浸入培养基中来固化胶水。为了防止胶水沾到组织表面，我们将组织倒置，先将其中一个角缓慢地浸入培养基储液中，这样组织应能很好地固定住，随后我们就可以在组织成像室中对其进行成像。接下来，我们将把之前准备好的用于原位成像的啤酒组织样本放置到显微镜载物台上。

这是我们的组织样本，底部涂有硅脂，只需将其轻轻放入培养基的液流中即可。现在它已通过硅脂固定在载物台底部。在组织旁边用温度探针监测培养基液流的温度。

现在我们将进行对焦。我将打开对焦用的新光源，即高亮度照明灯。接下来，我将使用 20 倍物镜，并将其降入观察室中。

确保其不接触组织。通过目镜观察，聚焦于我们的耳部组织。即可见到。

此处可见大鼠耳部真皮层中发出自体荧光的绿色毛囊。毛囊周围是一层致密的胶原蛋白，这层结构将在T细胞效应记忆细胞的双光子成像前被去除。

自体荧光的毛囊会与真皮上层明亮的胶原蛋白信号相互干扰，从而影响成像效果。如图所示，我们可以观察到已摄取 Texas red 标记羊毛硫氨酸的抗原提呈细胞（APCs），它们位于这些蓝色的胶原纤维周围。胶原纤维呈现蓝色是由于在双光子成像中沿胶原纤维产生的二次谐波信号所致。

我们的T细胞具有高度运动性。它们在胶原纤维上上下爬行，并与抗原呈递细胞（APC）相互作用。在本视频中，您看到Christine Beaton博士在Lewis大鼠中诱导了过继性迟发型超敏反应（DTH）。

接着，我们向您展示了用于成像的耳部样本制备方法、应答性效应记忆T细胞、大鼠耳部组织以及实现该成像的双光子技术。