成像效应在耳朵上的记忆体T细胞诱导后收养的DTH
August 14th, 2008
在这里，我们证明了诱导和记录一个迟发型超敏反应（DTH）反应在鼠耳进展的方法。这是由鼠耳组织编制的示范效应/记忆性T细胞反应的双光子成像。
大家好，我是 Melanie Matthew。我是加州大学欧文分校生理学和生物物理学系 Micah Hollins 实验室的研究生。今天，我们将与 Christine Beaton 博士一起向您展示我们如何对大鼠耳朵中的反应效应或记忆 T 细胞群进行成像。
Christine Beaton 博士将首先在大鼠耳中诱导迟发型超敏反应 DTH。然后，我们将继续通过两种照片显微镜对大鼠耳朵进行原位成像。两天前，我将 hyper 中白蛋白特异性 T 细胞的 GFP 标记注射到 Lewis 中。
今天我要挑战同一只老鼠的耳朵。所以我要在右耳注射白蛋白。在左耳中，我只是要注射一些 PBS。
我注射的白蛋白剂量为 20 微克/20 微升。我使用的白蛋白是德克萨斯红标记的白蛋白和未标记的白蛋白的一对一混合物。所以这就是我要向您展示如何注射的右侧。
所以我有左手，我是右撇子。所以我的左手摘下手套，以便能够将一根手指放在耳朵下面，将另一根手指放在上方，以拉伸皮肤，这样我就可以准确地看到我用针头的位置，并进入空气中的两层皮肤之间，这层皮肤非常薄。因此，为此，我使用 27 号针头将非常细的东西放入其中。
所以，如果我把它转过来，你肯定会看到德克萨斯州红葡萄酒的去向和 PBS 的去向。所以我们现在在挑战后 42 小时在这里，我将使用弹簧加载的千分尺来测量耳朵的厚度。因此，我将测量双耳，右耳受到白蛋白攻击，左耳没有受到攻击，厚度的差异将让我们了解炎症的强度。
哦，62 0 60 0 61,0 60 或 58 或 57 或 57。另一只耳朵 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46， 4 50。Hi.So Christine Beaton 刚刚给了我们一只老鼠，她在测量了 DTH 反应后取出了这只老鼠。
我们把他们装在冰上运到这里。这是老鼠的左耳。我们现在在 Ian Parker 的实验室里进行双光子显微镜检查。
因此，我将为这些耳朵准备原位双光子成像。所以我要在耳朵的底部准备一只老鼠的耳朵。组织要厚得多，我们有一些头发竖起来，如果我开始剪头发，会有点乱。
所以我要做的第一件事就是剪掉一些头发。我只是轻轻地握住耳朵。当你用拇指和食指握住组织时，我的手指使实际控制组织变得更加容易。
我更喜欢使用镊子，因为镊子，我只是，我就是感觉不到组织在做什么，我们总是担心会损坏组织。因此，我们希望能够感受到我们正在用它做什么。所以我就是喜欢用我的手指。
这是大鼠耳朵中从这里剥落的真皮层。所以当我修剪一些头发时，我能够轻轻地修剪一些真皮，只是剥落了。有一些非常小的解剖剪刀可以做到这一点，所以只是一些漂亮的弯曲剪刀。
您不想刺穿组织，您可以从耳朵底部一直向上移动到顶部，只需轻轻切掉一些真皮层即可。所以我们不需要一个非常大的成像窗口。这个区域就足够了，可以得到一些细胞浸润组织的漂亮图像。
所以你可以看到，我们在耳朵底部仍然有一些完整的血管，几乎一直到耳尖。这整个区域将非常适合 DTH 成像。所以我要继续切下我暴露的那块组织，做成一小块我们可以粘在成像台上的组织。
所以就在这里做一个剪辑，把它转过来。我可以在这里剪辑。我们有一小块漂亮的组织，可以在双光子镜上准备成像。
这些是牢不可破的塑料盖玻片，我们将其切割成组织的大小。然后我们使用 bet bond 将组织安装到这些上面。然后，我们使用硅脂将这些牢不可破的塑料盖玻片固定到我们的原位成像台上。
我要拿一小块空气纸巾，它有一点曲率，所以我必须在粘合它时把它弄平。不理想，但会奏效。所以你只需拿一个盖玻片剪下来，估计一下你的耳朵的大小，然后剪得比你想象的要大一点。
将我们的纸巾安装到盖玻片上。我们使用一种名为 bet long 的纸巾安全强力胶。我们从 3M 买来它，然后滴几滴到我们的盖玻片上。
我不想拥有太多。您还需要确保它均匀分布。所以我只拿一小块镜头纸，用它的一角把胶水吸过这里的盖玻片。
在额外的胶水处稍微升高一点，一旦这种胶水接触到水，它就会固化。因此，您需要非常小心地处理您的组织样本。所以我要在这里抓住它的组织角，我们可能不会成像，因为它在弯曲的部分。
我要把它擦干一点。它的底部，就在镜头纸上，所以它都干了。我要触摸它的一角，这个老鼠耳组织到盖玻片上。
而且它应该在我接触过的地方立即固化。其余部分，我只是通过轻轻按压它的边缘来稍微变平一点。所以希望我们能有一个好的成像框架。
所以现在我要做的是通过将胶水浸入介质中来固化胶水。因此，为了防止胶水沾到组织顶部，我们将其倒置，先慢慢地将其浸入培养基储液器的一角，它应该会很好地粘住，这样我们就可以在组织成像室中对其进行成像。所以现在我们要把我们准备进行原位成像的组织，即啤酒组织放在载物台上。
所以这是我们的纸巾，底部有硅脂，我们只需轻轻地将其放在介质流中。现在它粘在舞台底部的是硅脂。使用我们旁边的温度探头照亮介质流动。
现在我们要集中精力。所以我要打开我们的焦点，新的光线，我们明亮的果皮。所以我要把我们的 20 倍物镜放到腔室中。
确保它不接触组织。通过目镜观察并专注于我们的耳组织。就这样。
在这里，您可以在大鼠耳朵的真皮层中看到自发荧光的绿色毛囊。这个毛囊周围是一层致密的胶原蛋白。这是我们为 T fector 记忆细胞的 T 光子成像而删除的一层。
自发荧光毛囊会像真皮上层的明亮胶原蛋白一样模糊图像。好的，在这里您可以看到，我们有 APC 已经吸收了德克萨斯红共轭 volin，它们位于这些蓝色胶原纤维上。胶原纤维是蓝色的，因为我们沿着胶原纤维进入光子成像的二次谐波产生。
我们有高度运动的 tcell。它们在胶原纤维上爬行并与 APC 相互作用。所以在这个视频中，你看到了 Christine Beaton 博士在 Lewis 大鼠中诱导收养 DTH。
然后，我们向您展示了我们的成像准备设备、反应性 T 效应器记忆细胞、大鼠耳和我们的双光子技术。
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概述
本文演示了一种在大鼠耳朵中诱导和记录延迟型超敏反应（DTH）反应的方法，随后准备大鼠耳朵组织用于T细胞反应的二光子成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 神经科学
- 生物物理学
背景
- 延迟型超敏反应（DTH）是一种关键的免疫反应。
- 了解T细胞动力学对免疫学研究至关重要。
- 二光子显微镜允许对细胞反应进行原位成像。
- 大鼠模型常用于研究免疫反应。
研究目的
- 在大鼠耳朵中诱导和记录DTH反应。
- 可视化效应器和记忆T细胞群体。
- 增强对T细胞在体内行为的理解。
使用的方法
- 在大鼠耳组织中诱导DTH。
- 注射GFP标记的T细胞。
- 用于成像的二光子显微镜。
- T细胞反应的原位分析。
主要结果
- 在大鼠耳模型中成功诱导DTH。
- 使用二光子显微镜可视化T细胞群体。
- 对免疫反应在体内的动力学有了新的见解。
- 证明了该方法可以应用于进一步的免疫学研究。
结论
- 该方法提供了一种研究DTH反应的可靠方法。
- 二光子成像对于观察T细胞行为是有效的。
- 这项研究有助于理解免疫反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
