Name: 成像效应在耳朵上的记忆体T细胞诱导后收养的DTH (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 了解在大鼠耳部诱导迟发型超敏反应并进行双光子成像的技术。该方法通过GFP标记T细胞，实现效应记忆T细胞群体的原位可视化，为免疫学研究提供可靠的活体成像方案。

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诱导过继性迟发型超敏反应
请参见 JoVE 文章：<a href="https://www.jove.com/video/325">大鼠过继性迟发型超敏反应的诱导与监测</a> Christine Beeton, George K. Chandy 加州大学欧文分校生理学与生物物理学系 《视觉化实验杂志》，第8期
在此，我们对该方案进行了改进，使用抗原（卵清蛋白）与德克萨斯红（Texas-Red）以1:1比例偶联，并与未标记抗原混合，以便可视化吞噬性抗原提呈细胞。
耳组织采集
<ol>
<li>根据已批准的动物实验方案，在预定时间点实施安乐死。此处我们采用过量麻醉剂异氟烷进行操作，过程在通风良好的通风橱内的密闭容器中完成。通过断头或打开胸腔并剪断心脏的方式，确认动物已死亡。 </li>
<li>使用大剪刀进行单次剪切，尽可能贴近动物体部将耳部取下（图1）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="小鼠耳部注射示意图；标注注射部位；耳部取下操作步骤。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_1.jpg"> 图1. 大鼠耳部的取下 </li>
<li>将取下的耳组织置于含有约10 ml冰上预冷的1×PBS或RPMI-1640培养基的15 ml锥形管中。将组织样本置于冰上保存，直至准备进行成像处理。 </li>
<li>应尽快对组织进行成像；然而我们发现，与立即取材并成像的组织相比，组织在冰上保存1至2小时对组织内细胞迁移活性无明显影响。</li>
</ol>
成像用组织制备
一、表皮层和真皮层的去除
*注意：必须保持深层真皮层的完整性。若操作正确，较大的血管将保持完整，且耳部软骨不会暴露。该技术难度较高，尤其是在无炎症（对照条件）的情况下，建议使用解剖显微镜辅助操作。
<ol>
<li>将锥形管中的组织和培养基一同放入10 cm的组织培养皿中。 </li>
<li>戴手套后，用手轻轻捏住大鼠耳尖（远端），使耳的背侧朝上（图2）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="猫注射示意图，显示安全给药的注射部位和毛发修剪区域。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_2.jpg"> 图2. 修剪耳部毛发 </li>
<li>用拇指压住耳部上方以固定组织，同时使用闭合的Dumont #5镊子尖端将表皮与真皮深层分离。或者，如果耳缘存在皮肤/真皮深层的悬垂部分，可用镊子夹住该部分并轻轻拉扯，使其与下方组织分离（图3）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="真皮解剖示意图；注射部位、开始去除表皮、将表皮与组织分离。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_3.jpg"> 图3. 去除上层表皮 </li>
<li>当小片皮肤已与下方组织分离后，交替使用剪刀在真皮层之间剪切，并用镊子轻轻移除并剥离松动的皮肤，重复此分离步骤。 </li>
<li>暴露一块5 × 5 mm或更大的耳部组织区域，该区域应距离初始抗原注射部位至少3 mm（图4）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="显微镜检查前的组织准备，示意图显示样本被切割为5 mm见方用于成像研究。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_4.jpg"> 图4. 暴露用于成像的组织 </li>
</ol>
二、将组织固定到成像载物台上
<ol>
<li>将塑料盖玻片裁剪至略大于已制备组织的尺寸。 </li>
<li>在载玻片上均匀涂抹一层薄薄的3M Vetbond™组织安全胶。 </li>
<li>捏住已制备组织的一角（选择不用于成像的区域），从培养液中取出，并将组织底面轻压在镜头纸或Kym擦拭纸上，以去除多余液体。 </li>
<li>将组织边缘接触涂有胶水的载玻片（Vetbond在湿润组织上会立即固化）。轻轻拉平组织，使对侧末端最后接触载玻片（图5） <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="使用Vetbond盖玻片进行组织固定；示意图逐步展示固定过程。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_5.jpg"> 图5. 将组织固定于盖玻片上 </li>
<li>通过翻转组织样本/载玻片，并将其浸入液体培养基中，使组织面朝下并与液面呈约45度角，从而固化Vetbond™。将组织倒置并以一定角度保持，有助于防止多余的胶水在组织暴露表面固化。组织表面的胶水会阻挡激光（图6）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="液体表面接触角约为45度；示意图说明流体动力学概念。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_6.jpg"> 图6. 通过浸入培养基中固化Vetbond组织胶 注意：步骤2–5可能需要少量练习才能掌握。建议在首次正式操作前，先使用废弃或多余的组织样本进行练习。 </li>
<li>在载玻片底部涂抹少量硅脂。 </li>
<li>将载玻片放入灌流室中。在加入组织前，请确保灌流液正在流动，且温度维持在37°C并已充分氧合。轻轻按压载玻片边缘，使硅脂在灌流室底部与塑料盖玻片之间形成密封。</li>
</ol>
三、双光子成像
<ol>
<li>使用明场透射光，将焦点对准组织顶部。随后关闭所有光源。 </li>
<li>根据多光子显微镜系统的要求，打开激光器和光电倍增管（PMTs）。 </li>
<li>高度有序的纤维蛋白（如胶原蛋白和肌球蛋白）中的二次谐波产生（SHG）会在激发激光波长的一半处产生信号。我们使用900 nM的激发光，从而在450 nm处产生SHG信号，该信号可通过显微镜的“蓝色”通道进行观察。SHG的产生是一种非线性（双光子）过程，因此可提供类似于荧光双光子激发的光学“断层”效应。当纤维垂直于激光方向时，SHG信号效率达到峰值；而与激光方向平行的纤维则无法被观察到。1 </li>
<li>寻找一个细胞丰富的良好成像区域，设置采集区域，使大多数细胞位于中心位置，然后开始成像。注意：在迟发型超敏反应（DTH）中，T细胞及其他浸润细胞常集中分布，而其他区域则缺乏浸润细胞2。因此，可能需要花费一定时间在组织中搜寻最佳成像区域。 </li>
<li>在成像过程中通过评估细胞运动速度和极性来检查细胞活力。使用能够提供可接受图像质量的最低激光功率，以确保光损伤最小化。 </li>
<li>根据需要更换新的组织样本。</li>
</ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

在诱导过继性迟发型超敏反应后对耳部效应记忆t细胞的成像

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

迟发型超敏反应（DTH）是一种免疫反应，其主要效应细胞为CCR7- 效应/记忆性T淋巴细胞。本文中，我们展示了一种在大鼠耳部诱导并记录DTH反应进程的方法，随后演示如何制备大鼠耳组织，以用于双光子成像观察CCR7- 效应/记忆T细胞的反应。
通过腹腔注射表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的、Ova特异性的CCR7- 效应/记忆T细胞系（Beeton, C J. 可视化实验，第8期），在大鼠体内诱导过继性迟发型超敏反应（DTH）。细胞注射后使其在大鼠体内平衡48小时，随后进行攻击：一只耳朵注射生理盐水（对照耳），另一只耳朵注射Ova与Texas-Red标记的Ova（Ova-TR）按1:1比例混合的溶液，以便可视化观察组织驻留的抗原呈递细胞。
我们介绍一种组织制备方法，可用于在免疫反应过程中对深层真皮层内细胞的运动性进行成像，同时结合二次谐波生成技术对胶原纤维进行可视化观察。将耳部组织切成 5 x 5 mm 的方块（稍大一些更佳），用 Vetbond™ 将其固定在塑料盖玻片上，然后用硅脂将其固定在成像腔室中，并在 37°C 下以通入氧气的组织培养基进行灌流。

本文展示了一种在大鼠耳部诱导并记录迟发型超敏反应（DTH）进程的方法，随后展示了为进行双光子成像以观察效应/记忆性T细胞反应而制备大鼠耳部组织的实验步骤。

在诱导过继性迟发型超敏反应后对耳部效应记忆T细胞的成像

迟发型超敏反应（DTH）是一种免疫反应，其主要效应细胞为CCR7-效应/记忆性T淋巴细胞。本文中，我们展示了一种……

您好，我是 Melanie Matthew。我是加州大学尔湾分校生理学与生物物理学系 Micah Hollins 实验室的一名研究生。今天，我将与 Christine Beaton 博士一起向您展示我们如何对大鼠耳朵中的应答效应 T 细胞或记忆 T 细胞群体进行成像。Christine Beaton 博士将首先在大鼠耳部诱导迟发型超敏反应（DTH），随后通过双光子显微镜对大鼠耳部进行原位成像。两天前，我将 GFP 标记的白蛋白特异性 T 细胞注射至 Lewis 大鼠体内。今天，我将对同一只大鼠的耳部进行干预。在右耳，我将注射白蛋白；而在左耳，我仅注射一些PBS。我注射的白蛋白剂量为20微克，溶于20微升溶液中。所用的白蛋白是等量混合的德克萨斯红标记白蛋白与未标记白蛋白。接下来，我将向您展示注射的操作方法。所以我用我的左手，我是右撇子。我把左手的手套脱掉，以便能将一根手指放在耳下，另一根手指放在耳上，拉紧皮肤，这样我就能准确看清针头的位置，并将针插入皮肤的两层之间，那里有一层很薄的空气。为此，我使用27号针头，以便用极细的针具进行操作。因此，如果我把它翻转过来，你就能清楚地看到 Texas red 的分布位置以及 PBS 的分布位置。目前，我们已处于激发后的 42 小时，接下来我将使用弹簧加载的测微计来测量耳部厚度。我将测量两只耳朵，即接受白蛋白激发的右耳和未接受激发的左耳，两者厚度的差异将帮助我们评估炎症反应的强度。哦，62 0 60 0 61，0 60 或 58 或 57 或 57。另一只耳朵是 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46，4 50。你好。Christine Beaton 刚刚把测量迟发型超敏反应（DTH）后取出的大鼠交给我们。我们已将样本置于冰上运送至此。这是来自大鼠的左耳。现在我们在 Ian Parker 的实验室进行双光子显微镜观察。因此，我将为这些耳朵进行原位双光子成像的准备工作。我将从大鼠耳朵的耳基部开始处理其中一个耳朵。该部位组织较厚，并且有一些竖起的毛发，如果直接开始切割，会显得比较杂乱。首先，我将剪掉部分毛发。我轻轻抓住耳朵，用手指夹住组织，这样用拇指和食指夹持时能更方便地控制组织。我更喜欢用手而不是镊子，因为用镊子时，我总是感觉不太清楚组织的具体情况，而且我们一直担心会损伤组织。因此，我们希望能够切实感知到操作时的状况，所以我更喜欢用手操作。这是大鼠耳部的真皮层从此处分离的现象。因此，当我修剪掉部分毛发时，能够轻轻剪除一些已经自然剥离的真皮组织。可以使用一些非常小巧的解剖剪刀，最好是略带弧度的剪刀来完成此操作。不要刺破组织，应从耳部基部向顶部轻轻切开，逐步分离部分真皮层。因此，我们并不需要很大的成像窗口，仅此区域就足以获得清晰的细胞浸润组织图像。因此，您可以看到耳部基底处仍保留着一些完整的血管，并且这些血管几乎一直延

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成像效应在耳朵上的记忆体T细胞诱导后收养的DTH

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