Name: 成像效应在耳朵上的记忆体T细胞诱导后收养的DTH (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 了解在大鼠耳部诱导迟发型超敏反应并进行双光子成像的技术。该方法通过GFP标记T细胞，实现效应记忆T细胞群体的原位可视化，为免疫学研究提供可靠的活体成像方案。

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诱导过继性迟发型超敏反应
请参见 JoVE 文章：<a href="https://www.jove.com/video/325">大鼠过继性迟发型超敏反应的诱导与监测</a> Christine Beeton, George K. Chandy 加州大学欧文分校生理学与生物物理学系 《视觉化实验杂志》，第8期
在此，我们对该方案进行了改进，使用抗原（卵清蛋白）与德克萨斯红（Texas-Red）以1:1比例偶联，并与未标记抗原混合，以便可视化吞噬性抗原提呈细胞。
耳组织采集
<ol>
<li>根据已批准的动物实验方案，在预定时间点实施安乐死。此处我们采用过量麻醉剂异氟烷进行操作，过程在通风良好的通风橱内的密闭容器中完成。通过断头或打开胸腔并剪断心脏的方式，确认动物已死亡。 </li>
<li>使用大剪刀进行单次剪切，尽可能贴近动物体部将耳部取下（图1）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="小鼠耳部注射示意图；标注注射部位；耳部取下操作步骤。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_1.jpg"> 图1. 大鼠耳部的取下 </li>
<li>将取下的耳组织置于含有约10 ml冰上预冷的1×PBS或RPMI-1640培养基的15 ml锥形管中。将组织样本置于冰上保存，直至准备进行成像处理。 </li>
<li>应尽快对组织进行成像；然而我们发现，与立即取材并成像的组织相比，组织在冰上保存1至2小时对组织内细胞迁移活性无明显影响。</li>
</ol>
成像用组织制备
一、表皮层和真皮层的去除
*注意：必须保持深层真皮层的完整性。若操作正确，较大的血管将保持完整，且耳部软骨不会暴露。该技术难度较高，尤其是在无炎症（对照条件）的情况下，建议使用解剖显微镜辅助操作。
<ol>
<li>将锥形管中的组织和培养基一同放入10 cm的组织培养皿中。 </li>
<li>戴手套后，用手轻轻捏住大鼠耳尖（远端），使耳的背侧朝上（图2）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="猫注射示意图，显示安全给药的注射部位和毛发修剪区域。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_2.jpg"> 图2. 修剪耳部毛发 </li>
<li>用拇指压住耳部上方以固定组织，同时使用闭合的Dumont #5镊子尖端将表皮与真皮深层分离。或者，如果耳缘存在皮肤/真皮深层的悬垂部分，可用镊子夹住该部分并轻轻拉扯，使其与下方组织分离（图3）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="真皮解剖示意图；注射部位、开始去除表皮、将表皮与组织分离。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_3.jpg"> 图3. 去除上层表皮 </li>
<li>当小片皮肤已与下方组织分离后，交替使用剪刀在真皮层之间剪切，并用镊子轻轻移除并剥离松动的皮肤，重复此分离步骤。 </li>
<li>暴露一块5 × 5 mm或更大的耳部组织区域，该区域应距离初始抗原注射部位至少3 mm（图4）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="显微镜检查前的组织准备，示意图显示样本被切割为5 mm见方用于成像研究。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_4.jpg"> 图4. 暴露用于成像的组织 </li>
</ol>
二、将组织固定到成像载物台上
<ol>
<li>将塑料盖玻片裁剪至略大于已制备组织的尺寸。 </li>
<li>在载玻片上均匀涂抹一层薄薄的3M Vetbond™组织安全胶。 </li>
<li>捏住已制备组织的一角（选择不用于成像的区域），从培养液中取出，并将组织底面轻压在镜头纸或Kym擦拭纸上，以去除多余液体。 </li>
<li>将组织边缘接触涂有胶水的载玻片（Vetbond在湿润组织上会立即固化）。轻轻拉平组织，使对侧末端最后接触载玻片（图5） <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="使用Vetbond盖玻片进行组织固定；示意图逐步展示固定过程。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_5.jpg"> 图5. 将组织固定于盖玻片上 </li>
<li>通过翻转组织样本/载玻片，并将其浸入液体培养基中，使组织面朝下并与液面呈约45度角，从而固化Vetbond™。将组织倒置并以一定角度保持，有助于防止多余的胶水在组织暴露表面固化。组织表面的胶水会阻挡激光（图6）。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="液体表面接触角约为45度；示意图说明流体动力学概念。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_6.jpg"> 图6. 通过浸入培养基中固化Vetbond组织胶 注意：步骤2–5可能需要少量练习才能掌握。建议在首次正式操作前，先使用废弃或多余的组织样本进行练习。 </li>
<li>在载玻片底部涂抹少量硅脂。 </li>
<li>将载玻片放入灌流室中。在加入组织前，请确保灌流液正在流动，且温度维持在37°C并已充分氧合。轻轻按压载玻片边缘，使硅脂在灌流室底部与塑料盖玻片之间形成密封。</li>
</ol>
三、双光子成像
<ol>
<li>使用明场透射光，将焦点对准组织顶部。随后关闭所有光源。 </li>
<li>根据多光子显微镜系统的要求，打开激光器和光电倍增管（PMTs）。 </li>
<li>高度有序的纤维蛋白（如胶原蛋白和肌球蛋白）中的二次谐波产生（SHG）会在激发激光波长的一半处产生信号。我们使用900 nM的激发光，从而在450 nm处产生SHG信号，该信号可通过显微镜的“蓝色”通道进行观察。SHG的产生是一种非线性（双光子）过程，因此可提供类似于荧光双光子激发的光学“断层”效应。当纤维垂直于激光方向时，SHG信号效率达到峰值；而与激光方向平行的纤维则无法被观察到。1 </li>
<li>寻找一个细胞丰富的良好成像区域，设置采集区域，使大多数细胞位于中心位置，然后开始成像。注意：在迟发型超敏反应（DTH）中，T细胞及其他浸润细胞常集中分布，而其他区域则缺乏浸润细胞2。因此，可能需要花费一定时间在组织中搜寻最佳成像区域。 </li>
<li>在成像过程中通过评估细胞运动速度和极性来检查细胞活力。使用能够提供可接受图像质量的最低激光功率，以确保光损伤最小化。 </li>
<li>根据需要更换新的组织样本。</li>
</ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

在诱导过继性迟发型超敏反应后对耳部效应记忆t细胞的成像

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

迟发型超敏反应（DTH）是一种免疫反应，其主要效应细胞为CCR7- 效应/记忆性T淋巴细胞。本文中，我们展示了一种在大鼠耳部诱导并记录DTH反应进程的方法，随后演示如何制备大鼠耳组织，以用于双光子成像观察CCR7- 效应/记忆T细胞的反应。
通过腹腔注射表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的、Ova特异性的CCR7- 效应/记忆T细胞系（Beeton, C J. 可视化实验，第8期），在大鼠体内诱导过继性迟发型超敏反应（DTH）。细胞注射后使其在大鼠体内平衡48小时，随后进行攻击：一只耳朵注射生理盐水（对照耳），另一只耳朵注射Ova与Texas-Red标记的Ova（Ova-TR）按1:1比例混合的溶液，以便可视化观察组织驻留的抗原呈递细胞。
我们介绍一种组织制备方法，可用于在免疫反应过程中对深层真皮层内细胞的运动性进行成像，同时结合二次谐波生成技术对胶原纤维进行可视化观察。将耳部组织切成 5 x 5 mm 的方块（稍大一些更佳），用 Vetbond™ 将其固定在塑料盖玻片上，然后用硅脂将其固定在成像腔室中，并在 37°C 下以通入氧气的组织培养基进行灌流。

本文展示了一种在大鼠耳部诱导并记录迟发型超敏反应（DTH）进程的方法，随后展示了为进行双光子成像以观察效应/记忆性T细胞反应而制备大鼠耳部组织的实验步骤。

在诱导过继性迟发型超敏反应后对耳部效应记忆T细胞的成像

迟发型超敏反应（DTH）是一种免疫反应，其主要效应细胞为CCR7-效应/记忆性T淋巴细胞。本文中，我们展示了一种……

您好，我是 Melanie Matthew。我是加州大学尔湾分校生理学与生物物理学系 Micah Hollins 实验室的一名研究生。今天，我将与 Christine Beaton 博士一起向您展示我们如何对大鼠耳朵中的应答效应 T 细胞或记忆 T 细胞群体进行成像。Christine Beaton 博士将首先在大鼠耳部诱导迟发型超敏反应（DTH），随后通过双光子显微镜对大鼠耳部进行原位成像。两天前，我将 GFP 标记的白蛋白特异性 T 细胞注射至 Lewis 大鼠体内。今天，我将对同一只大鼠的耳部进行干预。在右耳，我将注射白蛋白；而在左耳，我仅注射一些PBS。我注射的白蛋白剂量为20微克，溶于20微升溶液中。所用的白蛋白是等量混合的德克萨斯红标记白蛋白与未标记白蛋白。接下来，我将向您展示注射的操作方法。所以我用我的左手，我是右撇子。我把左手的手套脱掉，以便能将一根手指放在耳下，另一根手指放在耳上，拉紧皮肤，这样我就能准确看清针头的位置，并将针插入皮肤的两层之间，那里有一层很薄的空气。为此，我使用27号针头，以便用极细的针具进行操作。因此，如果我把它翻转过来，你就能清楚地看到 Texas red 的分布位置以及 PBS 的分布位置。目前，我们已处于激发后的 42 小时，接下来我将使用弹簧加载的测微计来测量耳部厚度。我将测量两只耳朵，即接受白蛋白激发的右耳和未接受激发的左耳，两者厚度的差异将帮助我们评估炎症反应的强度。哦，62 0 60 0 61，0 60 或 58 或 57 或 57。另一只耳朵是 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46，4 50。你好。Christine Beaton 刚刚把测量迟发型超敏反应（DTH）后取出的大鼠交给我们。我们已将样本置于冰上运送至此。这是来自大鼠的左耳。现在我们在 Ian Parker 的实验室进行双光子显微镜观察。因此，我将为这些耳朵进行原位双光子成像的准备工作。我将从大鼠耳朵的耳基部开始处理其中一个耳朵。该部位组织较厚，并且有一些竖起的毛发，如果直接开始切割，会显得比较杂乱。首先，我将剪掉部分毛发。我轻轻抓住耳朵，用手指夹住组织，这样用拇指和食指夹持时能更方便地控制组织。我更喜欢用手而不是镊子，因为用镊子时，我总是感觉不太清楚组织的具体情况，而且我们一直担心会损伤组织。因此，我们希望能够切实感知到操作时的状况，所以我更喜欢用手操作。这是大鼠耳部的真皮层从此处分离的现象。因此，当我修剪掉部分毛发时，能够轻轻剪除一些已经自然剥离的真皮组织。可以使用一些非常小巧的解剖剪刀，最好是略带弧度的剪刀来完成此操作。不要刺破组织，应从耳部基部向顶部轻轻切开，逐步分离部分真皮层。因此，我们并不需要很大的成像窗口，仅此区域就足以获得清晰的细胞浸润组织图像。因此，您可以看到耳部基底处仍保留着一些完整的血管，并且这些血管几乎一直延伸到耳尖。这一整片区域都非常适合进行迟发型超敏反应（DTH）成像。接下来，我将把已暴露的这部分组织切下，制备成一小块组织样本，以便将其固定在我们的成像载台上。因此在这里切一下，然后将其翻转。我可以在这一位置进行切割。这样就得到了一小块组织，可用于我们的双光子显微镜成像前的制备。这些是我们根据组织大小裁剪的不可破碎的塑料盖玻片。然后使用 bet bond 将组织固定在这些盖玻片上。接着，使用硅脂将这些不可破碎的塑料盖玻片固定在原位成像载台。我将取用这块较小的空气组织，它带有一点弧度，因此在用胶固定时需要将其展平。虽然并不理想，但可以满足要求。取一片盖玻片，根据耳朵的大小大致估量，剪成比你预想稍大一些的尺寸即可。为了将组织贴附到盖玻片上，我们使用一种对组织安全的超级胶水，称为 bet long。该产品购自 3M 公司，只需在盖玻片上滴加几滴即可。我不希望使用过多。同时，你还需要确保胶水均匀分布。因此，我将取一小片镜头纸，用其角落将胶水在盖玻片上均匀吸涂开。会有一点多余的胶水，一旦这种胶水接触到水就会固化。因此，处理组织样本时必须格外小心。我将捏住组织的这个角落，这里可能不会用于成像，因为它位于弯曲的部分。我会将其稍微擦干一点，底部在镜头纸上轻轻擦拭，确保完全干燥。然后，我将用这块大鼠耳组织的角部接触盖玻片。它应该在我触碰的位置立即凝固。其余部分，我只需轻轻按压边缘，使其稍微平整一些。这样我们就能获得一个理想的成像视野。现在，我将通过将组织浸入培养基中来固化胶水。为了防止胶水沾到组织表面，我们将组织倒置，先将其中一个角缓慢地浸入培养基储液中，这样组织应能很好地固定住，随后我们就可以在组织成像室中对其进行成像。接下来，我们将把之前准备好的用于原位成像的啤酒组织样本放置到显微镜载物台上。这是我们的组织样本，底部涂有硅脂，只需将其轻轻放入培养基的液流中即可。现在它已通过硅脂固定在载物台底部。在组织旁边用温度探针监测培养基液流的温度。现在我们将进行对焦。我将打开对焦用的新光源，即高亮度照明灯。接下来，我将使用 20 倍物镜，并将其降入观察室中。确保其不接触组织。通过目镜观察，聚焦于我们的耳部组织。即可见到。 此处可见大鼠耳部真皮层中发出自体荧光的绿色毛囊。毛囊周围是一层致密的胶原蛋白，这层结构将在T细胞效应记忆细胞的双光子成像前被去除。自体荧光的毛囊会与真皮上层明亮的胶原蛋白信号相互干扰，从而影响成像效果。如图所示，我们可以观察到已摄取 Texas red 标记羊毛硫氨酸的抗原提呈细胞（APCs），它们位于这些蓝色的胶原纤维周围。胶原纤维呈现蓝色是由于在双光子成像中沿胶原纤维产生的二次谐波信号所致。我们的T细胞具有高度运动性。它们在胶原纤维上上下爬行，并与抗原呈递细胞（APC）相互作用。在本视频中，您看到Christine Beaton博士在Lewis大鼠中诱导了过继性迟发型超敏反应（DTH）。接着，我们向您展示了用于成像的耳部样本制备方法、应答性效应记忆T细胞、大鼠耳部组织以及实现该成像的双光子技术。

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成像效应在耳朵上的记忆体T细胞诱导后收养的DTH

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一种眼组织中效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型

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立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型

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经皮诱导免疫调节的小鼠模型

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