Name: 从人死后脑组织神经元细胞核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习从人死后脑组织分离神经元细胞核的方法，通过密度梯度离心和流式分选技术获得高纯度细胞核。该方案有助于研究神经元特异性基因表达和染色质相互作用，为神经科学与表观遗传学研究提供重要工具。

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作者感谢马萨诸塞大学医学院流式细胞术核心 facility 的 Richard Konz 博士及工作人员提供的建议和技术支持。本研究还使用了糖尿病内分泌学研究中心资助项目 DK032520 支持的核心资源。本工作获得了美国国家心理健康研究所（NIMH）、国家药物滥用研究所（NIDA）以及国家儿童健康与人类发展研究所资助项目的资助。

细胞核提取
<ol>
<li>将&nbsp;250 mg 冷冻的死后脑组织放入含 5 mL 裂解缓冲液1 的玻璃匀浆器中，并置于冰上。为了在 FACS 分选后获得约 500 万个细胞核，我们通常每样本使用 1000 mg 组织。</li>
<li>待组织解冻后，在冰上匀浆 1 分钟。</li>
<li>取匀浆后的组织，转移至 15 mL 透明超速离心管中，并将离心管置于冰上。</li>
<li>用移液器吸取 9 mL 蔗糖溶液2，将移液器尖端置于透明超速离心管底部，缓慢释放蔗糖溶液2，使匀浆液在蔗糖溶液2上方形成浓度梯度。</li>
<li>称量超速离心管，确保所有离心管在超速离心机旋转过程中保持平衡。若需调整重量，可通过向顶层加入裂解缓冲液1进行校正。</li>
<li>称重完成后，将离心管放入转子吊桶中。</li>
<li>将所有吊桶放入 SW28 转子，并小心地将转子放入超速离心机中。</li>
<li>在 4°C 条件下，以 107163.6 RCF 离心 2.5 小时。</li>
<li>离心结束后，使用真空泵小心吸除上清液以及浓度梯度中的碎片层，注意不要扰动管底含有细胞核的沉淀。</li>
<li>向每份沉淀中加入 500 µL 1× PBS，冰上静置 20 分钟。此步骤可使沉淀自行轻微溶解，便于后续通过上下吹打机械性完全溶解，从而减少细胞核所受的机械应力。</li>
<li>细胞核在冰上孵育 20 分钟后，通过移液上下吹打，彻底将细胞核溶解于 1× PBS 中。</li>
<li>将含细胞核的溶液从超速离心管中取出，将两管溶液合并至一个 2 mL 微量离心管中。再次将样品置于冰上。</li>
</ol>
FACS 免疫染色
<ol>
<li>此时，配制免疫染色混合液，包含一抗、二抗和封闭液。每个样本中加入含有1.2 µL NeuN抗体的300 µL 1×PBS、100 µL封闭液（含0.5% BSA和10%正常山羊血清的1×PBS）以及1 µL Alexa Fluor 488。对于对照样本，省略一抗NeuN，仅额外添加1×PBS。</li>
<li>将免疫染色混合液涡旋混匀，在室温下避光孵育5分钟。</li>
<li>在染色混合液孵育期间，制备样本的对照。进行FACS分选时，需要一个仅含细胞核的样本作为“未染色对照”；还需要第二个阴性对照样本，即仅加入二抗Alexa Fluor 488而不加一抗NeuN的细胞核样本。</li>
<li>取20 µL含细胞核的溶液加入至含有1×PBS的2 mL微量离心管中作为未染色对照；另取20 µL加入至另一支含有980 µL 1×PBS的2 mL离心管中作为阴性对照。用1×PBS将含细胞核的样本体积重新补至1 mL。所有样本均放回冰上保存。</li>
<li>免疫染色混合液完成孵育后，将其401 µL内容物加入相应的样本中。细胞核样本将加入含有NeuN和Alexa Fluor 488的混合液，而阴性对照样本&nbsp;将只加入仅含二抗Alexa Fluor 488的混合液。</li>
<li>将样本转移至冷室中，在避光条件下旋转孵育45分钟。</li>
<li>样本在避光条件下孵育45分钟后，置于冰上并运送至FACS实验平台。在运送过程中，样本应始终保持在冰上并避光。</li>
</ol>
流式细胞分选
<ol>
<li>在FACS实验中心，将样品通过40 μm滤膜过滤，然后上机检测。&nbsp;它们&nbsp;通过仪器运行几分钟，同时保持低温，以在分选前获得一些初步数据。</li>
<li>此时，需要设置用于分选的适当门控。分选样品时会使用几种不同的门控。第一个门控可提供样品中不同细胞核大小的初步信息，&nbsp;可实现分离&nbsp;来自实际细胞核的碎片。第二个门控用于对细胞核进行单个分选，此时任何聚集体均被丢弃。最后，第三个门控设定在特定荧光波长，与二抗所携带的荧光染料波长相匹配。通过设置此门控，可分选并分离 NeuN +（即神经元细胞核）与 NeuN - 细胞核。</li>
<li>在选定所有门控参数后，可将细胞核分选至1×PBS中。</li>
<li>待全部样品过柱后，取部分分选后的样品通过仪器检测分选纯度。确保样品的荧光信号不弥散，而是集中于单一象限内。建议选择纯度超过90%的样品。</li>
</ol>
流式细胞分选后
<ol>
<li>样本分选完成后，即可开始处理细胞核。取10 mL分选后的样本，加入2 mL蔗糖溶液2、50 µL 1 M CaCl2和30 µL 1 mM Mg(Ace)2。请注意，由于细胞核未固定，操作过程中务必始终将样本置于冰上。</li>
<li>若分选后的样本体积少于10 mL，可加入1×PBS补足至10 mL，或相应调整其他添加物的用量。</li>
<li>轻轻颠倒混匀数次，置于冰上静置15分钟。</li>
<li>冰浴孵育15分钟后，将样本在4°C条件下，以1786 RCF离心15分钟（使用水平转子）。</li>
<li>用真空装置小心吸弃上清液，注意不要扰动管底的白色沉淀。</li>
<li>将沉淀溶解于后续实验所需的200 µL溶液中，并用移液器反复吹打混匀。</li>
<li>将溶液转移至较小的离心管中，保存于-80°C冰箱，待后续使用。</li>
</ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

本文所述方案对于研究神经元染色质的表观遗传变化，以及更广泛地研究神经元细胞核的分子表型，在正常发育与衰老过程中，或在神经或精神疾病状态下，具有特别重要的意义。当脑组织的细胞异质性（包括在衰老过程或疾病影响下神经元与胶质细胞比例的潜在变化）成为关注重点时，该方法尤其具有优势1。例如，我们近期将本分离方案与染色质免疫沉淀技术相结合，揭示了脑源性神经营养因子（BDNF）基因启动子区域以及其它神经元基因上的神经元特异性组蛋白甲基化模式2。此前已有类似方法用于从成年大脑皮层中分离神经元，以进行回顾性出生时间测定3。该分选技术也已在小鼠脑组织中应用2，并且由于细胞核在冷冻-解冻组织中的稳定性良好，我们预计本文所述方法可适用于多种物种。由于目前即使仅使用低至10,000个细胞，也能实现对基因组更全面的覆盖进行染色质免疫沉淀分析4，因此实际所需的起始材料可能远低于我们上述推荐的1000 mg。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;b&gt;试剂：&lt;/b&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格&gt;&lt;胸段&gt;&lt;tr&gt;&lt;跨列数&quot;3&quot; 对齐=&quot;左侧&quot;&gt;1. 裂解缓冲液&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;0.32 M&lt;/td&gt;&lt;td&gt;蔗糖&lt;/td&gt;&lt;td&gt;5.47 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;5 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;250 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;3 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Mg(乙酸盐)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;150 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;0.1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;EDTA&lt;/td&gt;&lt;td&gt;10 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris-HCl，pH 8&lt;/td&gt;&lt;td&gt; 500 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;1 mM &lt;/td&gt;&lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt;&lt;td&gt;17 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Triton X-100&lt;/td&gt;&lt;td&gt;50 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; 样式=&quot;内边距：8px 0 16px 0&quot; 对齐=&quot;中心&quot;&gt;用灭菌水定容至 50 ml&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;表格&gt;&lt;胸段&gt;&lt;tr&gt;&lt;跨列数=&quot;3&quot; 对齐=&quot;左侧&quot;&gt;2. 蔗糖溶液&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;1.8 M&lt;/td&gt;&lt;td&gt;蔗糖&lt;/td&gt;&lt;td&gt;30.78 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;3 mM &lt;/td&gt;&lt;td&gt;Mg(乙酸盐)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;150 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt;&lt;td&gt;17 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris-HCl，pH 8&lt;/td&gt;&lt;td&gt;500 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; style=&quot;内边距：8px 0 16px 0&quot; 对齐=&quot;中心&quot;&gt;用灭菌水定容至 50 ml&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;表格&gt;&lt;胸腹部&gt;&lt;tr&gt;&lt;跨列数=&quot;3&quot; 对齐=&quot;左侧&quot;&gt;3. Dounce 缓冲液&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0.242 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;4 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0.163 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0.03 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; 样式=&quot;内边距：8px 0 16px 0&quot; 对齐=&quot;中心&quot;&gt;用去离子水定容至200 ml，并调节pH至7.5&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

从人死后脑组织中分离神经元细胞核

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

人类大脑中的神经元大多在产前发育阶段即进入终末分化状态，因此其细胞核在整个生命周期中持续存在。然而，目前对于神经元染色质和细胞核结构在发育、衰老过程中，以及在慢性神经精神疾病状态下的变化仍知之甚少。迄今为止，大多数基于染色质和DNA的检测方法（荧光原位杂交FISH除外）缺乏单细胞分辨率。由于脑组织具有高度的细胞异质性，通常不同类型神经元亚群与多种胶质细胞及其他非神经元细胞相互混杂，这给研究带来了显著限制。一种可能的解决方案是建立细胞类型特异性的培养体系，但包括神经元在内的大多数中枢神经系统细胞在体外最多仅能维持数周，因此无法充分模拟贯穿整个生命周期的表观遗传调控机制。本文提供一种从冷冻（未经固定）的人类死后脑组织中提取和纯化细胞核的实验方案。该方法包括在低渗裂解缓冲液中提取细胞核，随后进行超速离心及使用抗NeuN抗体进行免疫标记。标记后的神经元细胞核通过荧光激活分选技术单独收集。该方法适用于多种物种的广泛脑区，可用于针对组蛋白位点特异性和修饰特异性抗体的染色质免疫沉淀研究，以及DNA甲基化和其他相关检测。

脑组织的细胞异质性对染色质中表观遗传标记的研究构成了显著限制，因为大多数检测方法缺乏单细胞分辨率。神经元通常与胶质细胞及其他非神经元细胞混杂在一起。本文提供了一种从人脑中提取和收集神经元细胞核的实验方案。

人类大脑中的神经元大多在产前发育期间进入终末分化状态，因此其细胞核在整个生命周期中持续存在。然而，……

为了研究调控人脑中神经元特异性基因表达的染色质DNA相互作用，首先必须获得纯化的神经元细胞核。通过将死后人脑组织匀浆化，并利用密度梯度离心法分离出全部细胞核，随后使用神经元特异性抗体对细胞核进行标记，并通过流式分选技术分离，最后经超速离心浓缩。大家好，我是 Anish Matan，来自马萨诸塞大学医学院精神病学系 Sharon mc Barian 博士的实验室。今天我将向大家演示一种从死后人脑组织中分离神经元细胞核的实验方法。现在让我们开始吧。对于每个待分选的细胞核样品，起始材料为一千毫克冷冻的死后脑组织。利用此数量的组织，经荧光激活分选后可获得约500万个神经元细胞核。开始细胞核提取时，将250毫克脑组织放入含有5毫升裂解缓冲液的Dounce匀浆器中，并置于冰上。组织解冻后，将其在冰上放置一分钟。解冻后，将匀浆组织转移至15 ml透明超速离心管中，然后将试管置于冰上。对剩余组织重复此匀浆步骤。接下来，小心地将九毫升蔗糖溶液用移液器缓慢加入超速离心管底部，以形成浓度梯度，使匀浆组织溶液位于蔗糖溶液上方。现在称量超速离心管，确保在超速离心过程中保持平衡。通过向顶层加入裂解缓冲液来调整各管重量。称量完成后，将离心管放入超速离心机中，使用SW 28转子，在4°C条件下以107163.6 ×g离心2.5小时。离心完成后，吸除上清液以及浓度梯度中可见的碎片层。注意不要扰动管底的沉淀物，其中含有细胞核。接着，向每个沉淀物中加入500 µL的1×PBS，冰上静置20分钟。20分钟后，通过上下吹打重悬沉淀。冰上孵育可使沉淀自行略微溶解，从而更易于重悬细胞核，减少细胞核所受的机械应力。随后将重悬的沉淀和细胞核转移至两支毫升离心管中。将两个超速离心管中的核酸溶液合并至每个微量离心管中，再次将样品置于冰上。现在核酸提取已完成，我将进入免疫染色步骤，以通过流式分选分离神经元细胞核。含有细胞核的样品将与免疫染色混合液共同孵育，该混合液由一抗和二抗以及封闭液组成。配制免疫染色混合液的方法如下：将1.2微升神经元特异性一抗NeuN加入300微升1×PBS中，然后加入100微升封闭液，封闭液包含0.5% BSA和10%正常山羊血清溶于1×PBS中。最后，加入1 µL名为LOR 488的二抗。同时为此免疫染色混合物准备一份阴性对照样本的免疫染色，省略一抗new end，并以1.2 µL的1×PBS替代。现在涡旋震荡免疫染色混合物，并在避光条件下于室温孵育5分钟。在孵育染色混合物的同时，准备对照核样本：取20微升重悬的核样本加入含有980微升1×PBS的2毫升离心管中，作为阴性对照样本Eloqua。同时准备一份未染色对照，其中仅包含核溶液和PBS。现在将20微升的细胞核移至另一管中，并加入1毫升1×PBS将体积补足。然后将所有样品放回冰上。此时免疫染色混合物已经制备完成。将401微升混合液加入

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从人死后脑组织神经元细胞核分离

我们描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从死后人脑颞上回第三层的同质细胞群体——锥体神经元中分离并提取RNA的方法。随后，我们对mRNA进行线性扩增（基于T7系统），并将样本杂交至Affymetrix人类X3P微阵列。...

从人死后脑组织的单细胞群体中获取高质量RNA

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

从死后组织中分离心肌细胞核

本视频介绍了从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单细胞核的实验方案。所分离的单细胞核可作为测序技术的样本，例如单细胞核RNA（snRNA）测序和单细胞核转座酶可及染色质分析（snATAC）测序，以深入研究中枢神经系统胶质瘤中所观察到的肿瘤间和肿瘤内异质性。...

从新鲜冷冻胶质瘤组织中分离细胞核：一种获取完整胶质瘤肿瘤样本细胞核的方法

该视频展示了一种从小鼠海马齿状回（DG）的胶质细胞和干细胞中分离完整细胞核的方法。将DG组织在冰冷的匀浆缓冲液中进行机械解离，以释放细胞核。弃去组织碎片及其他释放出的细胞器，细胞核经DNA染料以及与神经元核抗原（NeuN）特异性结合的荧光素标记抗体染色。随后采用荧光激活细胞核分选技术，分离出NeuN阴性的非神经元细胞核。...

一种从海马齿状回非神经元细胞中分离细胞核的技术

本视频演示了使用荧光激活细胞核分选（FANS）从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的实验步骤，该方法可用于研究不同细胞群体在多种神经科学领域的应用。...

使用荧光激活细胞核分选技术从脑组织中分离细胞群体

肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。...

从新鲜冷冻脑肿瘤组织中分离细胞核用于单核RNA测序和ATAC测序

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。...

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

学习从人死后脑组织分离神经元细胞核的方法，通过密度梯度离心和流式分选技术获得高纯度细胞核。该方案有助于研究神经元特异性基因表达和染色质相互作用，为神经科学与表观遗传学研究提供重要工具。

从人死后脑组织中分离神经元细胞核

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