从人死后脑组织神经元细胞核分离
October 1st, 2008
脑组织细胞的异质性，构成一个明显的局限性染色，因为大多数分析缺乏单细胞分辨率的表观遗传标记的研究。通常是神经元与神经胶质细胞和其他非神经元细胞混合。我们提供了一个协议提取和收集从人脑的神经元细胞核。
为了研究控制人脑中神经元特异性基因表达的染色质 DNA 相互作用，必须首先获得纯的神经元核群才能做到这一点。死后人脑组织匀浆，并使用密度梯度离心分离总细胞核。然后用通过流量计分选分离的神经元特异性抗体标记细胞核，最后通过超速离心浓缩。
嗨，我是来自马萨诸塞大学医学院精神病学系 Sharon mc Barian 博士实验室的 Anish Matan。今天，我将向您展示从死后人脑组织中分离神经元核的程序。那么让我们开始吧。
对于每个要分选的细胞核样本，从 1000 毫克冷冻的死后脑组织开始。有了这个量，荧光激活分选后可以获得大约 500 万个神经元核。要开始细胞核提取，将 250 毫克脑组织放入含有 5 密耳裂解缓冲液的羽绒管中，然后将其置于冰上。
一旦组织解冻，它在冰上解冻一分钟。放下后，将匀浆组织转移到 15 mil 透明超速离心管中，然后将管子放在冰上。对剩余的组织重复这种匀浆。
接下来，小心地将 9 密耳的蔗糖溶液移液到超速离心管的底部，以设置浓度梯度，使匀浆的组织溶液位于蔗糖溶液的顶部。现在称量超速离心管以确保它们在超速离心过程中保持平衡。通过在顶层添加裂解缓冲液来调整重量 称量试管称重后，使用 SW 28 转子超速离心机样品以 107163.6 RCF 在 4 度下放置 2.5 小时。
离心完成后，吸出 snat 以及在浓度梯度处发现的碎片层。小心不要打扰管底部的沉淀，其中包含细胞核。接下来，向每个沉淀中加入 500 微升 1 XPBS，并在冰上静置 20 分钟。
20 分钟后，Resus 通过上下移液来悬浮沉淀。在冰上孵育可以让颗粒自行溶解一点，这使得细胞核更容易重悬，从而减少细胞核承受的压力。然后将复苏悬液和细胞核转移到两个 mil 离心管中。
将来自两个超百分管的核酸溶液混合到每个微量离心管中，然后再次将样品置于冰上。现在核酸提取已经完成，我将进行免疫染色步骤，以便按事实分离神经元核，将含有细胞核的样品分选与由一抗和二抗以及阻断链接组成的免疫染色混合物一起孵育，使 1.2 μL 神经元特异性抗体的免疫染色混合物成为 300 μL 的 1 个 XPBS。然后加入 100 微升封闭混合物，在一个 XPBS 中含有 0.5% BS、A 和 10% 正常代码血清。
最后，加入 1 微升称为 LOR 4 88 的二抗。此外，为该 Immuno 染色混合物的阴性对照样品制备 Immuno 染色剂。排除一抗 new end，并用 1.2 μL 的 one XPBS 替换它。
现在涡旋免疫染色混合物，并在染色混合物孵育时在室温下避光孵育 5 分钟。为阴性对照样品 Eloqua 准备对照细胞核样品 20 微升复苏跨度细胞核放入含有 980 微升 1 XPBS 的 2 mil 管中。还要准备一个未染色的对照，其中仅包含细胞核溶液和 PBS。
现在 Eloqua 将 20 微升细胞核放入另一根试管中，并使用一个 XPBS 将体积提高到 1 密耳。然后将所有样品放回冰上。到目前为止，免疫染色混合物已经完成。
孵育时，将 401 μL 混合物加入适当的样品中。细胞核样品接受含有 new 和 LOR 4 88 的混合物。阴性对照样品接受仅含有二抗 LOR 4 88 的混合物，而未染色的对照样品中未添加免疫染色剂。
接下来，将样品转移到 Coldron 中，并在黑暗中旋转 45 分钟。现在 45 分钟的孵育已经完成，我将把样品带到马萨诸塞大学医学院流式细胞术核心设施，进行一些荧光激活分选。在运送到核心设施的过程中，样品应保存在冰上和黑暗中。在流式细胞术核心设施中，样品首先通过 40 微米过滤器过滤，然后在低温下通过仪器几分钟。
这样做是为了在排序之前获得一些初步数据。未染色的对照确定负荧光的程度。根据此信息，调整机器对荧光的灵敏度。
染色对照用于控制流感。此时由于荧光外引起的任何背景噪声都会设置分选所需的适当门。几种不同的门用于对样品进行分类。
以下是第一个浇口的一些典型数据。此传真分析图表显示了调整浇口后的代表性样本。第一个门根据荧光和一般视觉体验等设置的组合识别碎片和活细胞核的模式。
x 轴表示前向散点，它对应于相对大小，而 Y 轴表示站点散点，它考虑了内部复杂性，例如粒度。第一个门也可以给出在我们的样本中发现的不同细胞核的大小。这允许将碎片与实际的原子核分开，以下是来自第二个门的一些典型数据。
此传真图表显示了第二个门的示例，它允许在丢弃任何聚集体的同时单独对细胞核进行排序。该门着眼于原子核通过激光所需的时间长度差异。那些是聚集体的通常需要更长的时间才能通过。
这个特定参数非常重要，因为包含聚集体会干扰纯度，因为一些荧光核可能与非荧光核结合。最后，这是来自第三个门的典型数据。该门设置为与我们的二抗中发现的氟的荧光波长相匹配的特定荧光波长。
在此传真图中，您可以看到沿 x 轴的荧光水平和沿 Y 轴的深红色通道检测器 PECY 7。与单色直方图相比，这些点状印迹可以提供更好的视觉效果。放置 SCADA 允许将新的阳性神经元核与新的和阴性的非神经元核进行分类和分离。
选择所有门后，原子核被分类到一个 XPBS 中。一旦整个样品都经过事实分选，通过仪器运行分选样品的 Eloqua 来检查分选的纯度。下面是一个最佳结果的示例。
这里将预排序样本（包含细胞核的混合种群）与已消除大部分阴性细胞核的分选 Eloqua 进行比较。请注意，纯度百分比基于基于设置的门控污染样品的事件数。请记住，样品第一次通过机器时，可能会发生一些漂白，从而导致一些变暗，为此，可能需要进行一些调整。
样品分选后，开始处理细胞核。为此，取 10 密耳分选的样品，加入 2 密耳蔗糖溶液、50 微升 1 摩尔氯化钙和 30 微升 1 摩尔乙酸镁。如果分选样品少于 10 mil，则通过添加 1 个 XPBS 将体积提高到 10 mil 或相应地调整其他材料。
接下来，将样品倒置数次，并将其置于冰上 15 分钟。15 分钟后，离心样品在水平转子 1 中，786 RCF 在 4 度下放置 15 分钟。离心后，小心吸出上清液，不要干扰试管底部的白色沉淀。
然后将沉淀溶解在 200 微升先前实验所需的适当溶液中。在这种情况下，我们将溶解沉淀和下沉缓冲液，用于后续的 ChIP 实验。然后通过管道上下重悬沉淀。
此时，您可以将细胞核转移到较小的管中，并将其放入零下 80 摄氏度的冰箱中。在进一步使用之前，我刚刚向您展示了如何从人类死后脑组织中分离神经元核。利用这个细胞核，您可以进行许多不同的分析，例如染色质免疫沉淀。
执行此程序时，请务必记住始终将样品放在冰上，因为细胞核是未固定的，并且在长时间温度下会降解。此外，按照生物安全 2 级或更高安全标准处理人体组织也很重要。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本文介绍了一种从死后人脑组织中分离神经元核的协议，解决了大脑研究中细胞异质性带来的挑战。该方法允许研究调节神经元基因表达的染色质DNA相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 表观遗传学
- 细胞生物学
背景
- 脑组织包含神经元和非神经元细胞的混合物。
- 大多数测定缺乏在单细胞水平上研究表观遗传标记的分辨率。
- 分离纯净的神经元核对理解基因表达至关重要。
- 本研究提供了实现这种分离的详细协议。
研究目的
- 从人脑组织中获得纯净的神经元核群。
- 促进神经元中染色质相互作用的研究。
- 提高对神经元特异性基因表达机制的理解。
使用的方法
- 死后人脑组织的均质化。
- 使用密度梯度离心分离总核。
- 用神经元特异性抗体标记核。
- 流式度分选和超速离心浓缩。
主要结果
- 建立了一个可靠的神经元核分离协议。
- 该方法允许研究神经元中的染色质相互作用。
- 在神经学研究中理解基因表达的潜在应用。
- 在研究脑组织中的表观遗传标记方面提高了分辨率。
结论
- 该协议增强了专门研究神经元核的能力。
- 它解决了脑组织细胞异质性带来的局限性。
- 这种方法可以推进神经元基因表达和表观遗传学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating pure neuronal nuclei from heterogeneous brain tissue enables precise interrogation of chromatin dynamics and gene regulation mechanisms in neurons, addressing a critical limitation in neuropsychiatric and neurodegenerative target validation. This approach supports mechanistic de-risking by providing a disease-relevant system for epigenetic assays, improving predictive confidence in early discovery stages. The method facilitates translational biomarker identification and preclinical model development by enabling downstream applications such as ChIP-seq and DNA methylation analysis in a purified neuronal context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal-specific transcriptional and epigenetic landscapes to validate disease-associated targets.
- Operational Value: Reduces confounding signals from glial and non-neuronal cells, improving target specificity and hypothesis clarity.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking chromatin states to neuronal gene expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal nuclei for chromatin-based assays including ChIP, ATAC-seq, and methylation profiling.
- Operational Value: Standardizes input material for epigenetic screening platforms, enhancing reproducibility across campaigns.
- Scientific Value: Enables quantitative, single-nucleus resolution readouts essential for assay sensitivity and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant human neuronal system to assess target engagement and epigenetic modulation in postmortem tissue.
- Operational Value: Bridges discovery findings with preclinical validation by maintaining neuronal identity across experimental workflows.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct assessment of chromatin modifications in human neurons.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic interrogation of neuronal chromatin states prior to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal gene regulation pathways by isolating nuclei for downstream omics applications.
- Screening: Delivers standardized, purified neuronal nuclei suitable for high-content epigenetic screening assays.
- Analytics: Generates quantitative chromatin and DNA modification readouts that inform target prioritization and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects epigenetic discoveries in human neurons to preclinical models via conserved regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal nuclei isolation platform applicable across multiple brain regions and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing biological noise from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of neuronal chromatin assays through standardized isolation and sorting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic insight into neuronal target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of epigenetic and gene regulation targets with stronger human relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, epigenetics, and flow cytometry for proper execution and interpretation.
- Dependent on access to ultracentrifugation, fluorescence-activated cell sorting, and antibody validation infrastructure.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in nuclei yield and purity.
- Must account for postmortem interval and tissue preservation status when applying to diverse donor cohorts.
- Limited to unfixed tissue applications; not compatible with formalin-fixed or paraffin-embedded samples.
