从人死后脑组织中分离神经元细胞核

为了研究调控人脑中神经元特异性基因表达的染色质DNA相互作用，首先必须获得纯化的神经元细胞核。通过将死后人脑组织匀浆化，并利用密度梯度离心法分离出全部细胞核，随后使用神经元特异性抗体对细胞核进行标记，并通过流式分选技术分离，最后经超速离心浓缩。

大家好，我是 Anish Matan，来自马萨诸塞大学医学院精神病学系 Sharon mc Barian 博士的实验室。今天我将向大家演示一种从死后人脑组织中分离神经元细胞核的实验方法。现在让我们开始吧。

对于每个待分选的细胞核样品，起始材料为一千毫克冷冻的死后脑组织。利用此数量的组织，经荧光激活分选后可获得约500万个神经元细胞核。开始细胞核提取时，将250毫克脑组织放入含有5毫升裂解缓冲液的Dounce匀浆器中，并置于冰上。

组织解冻后，将其在冰上放置一分钟。解冻后，将匀浆组织转移至15 ml透明超速离心管中，然后将试管置于冰上。对剩余组织重复此匀浆步骤。

接下来，小心地将九毫升蔗糖溶液用移液器缓慢加入超速离心管底部，以形成浓度梯度，使匀浆组织溶液位于蔗糖溶液上方。现在称量超速离心管，确保在超速离心过程中保持平衡。通过向顶层加入裂解缓冲液来调整各管重量。称量完成后，将离心管放入超速离心机中，使用SW 28转子，在4°C条件下以107163.6 ×g离心2.5小时。

离心完成后，吸除上清液以及浓度梯度中可见的碎片层。注意不要扰动管底的沉淀物，其中含有细胞核。接着，向每个沉淀物中加入500 µL的1×PBS，冰上静置20分钟。

20分钟后，通过上下吹打重悬沉淀。冰上孵育可使沉淀自行略微溶解，从而更易于重悬细胞核，减少细胞核所受的机械应力。随后将重悬的沉淀和细胞核转移至两支毫升离心管中。

将两个超速离心管中的核酸溶液合并至每个微量离心管中，再次将样品置于冰上。现在核酸提取已完成，我将进入免疫染色步骤，以通过流式分选分离神经元细胞核。含有细胞核的样品将与免疫染色混合液共同孵育，该混合液由一抗和二抗以及封闭液组成。配制免疫染色混合液的方法如下：将1.2微升神经元特异性一抗NeuN加入300微升1×PBS中，然后加入100微升封闭液，封闭液包含0.5% BSA和10%正常山羊血清溶于1×PBS中。

最后，加入1 µL名为LOR 488的二抗。同时为此免疫染色混合物准备一份阴性对照样本的免疫染色，省略一抗new end，并以1.2 µL的1×PBS替代。

现在涡旋震荡免疫染色混合物，并在避光条件下于室温孵育5分钟。在孵育染色混合物的同时，准备对照核样本：取20微升重悬的核样本加入含有980微升1×PBS的2毫升离心管中，作为阴性对照样本Eloqua。同时准备一份未染色对照，其中仅包含核溶液和PBS。

现在将20微升的细胞核移至另一管中，并加入1毫升1×PBS将体积补足。然后将所有样品放回冰上。此时免疫染色混合物已经制备完成。

将401微升混合液加入相应的样品中孵育。核样品加入含有新抗体和LOR 488的混合液。阴性对照样品仅加入含二抗LOR 488的混合液，而不染色对照样品则不添加任何免疫染色剂。

接下来，将样品转移至冷转仪中，在避光条件下旋转孵育45分钟。45分钟孵育完成后，我将把样品送至马萨诸塞大学医学院流式细胞术核心实验室进行荧光激活分选。在运送至核心实验室的过程中，样品应始终保持在冰上并避光。在流式细胞术核心实验室中，样品首先通过40微米滤膜过滤，然后在保持低温的条件下上机运行数分钟。

这样做的目的是在分选前获得一些初步数据。未染色对照用于确定阴性荧光的程度。根据此信息，调整仪器对荧光的灵敏度。

染色对照用于控制荧光。此时由于荧光产生的任何背景噪声均可用于设定分选所需的适当门控。采用多种不同的门控来分选样品。

以下是第一个门控的典型数据。该流式细胞分析图显示了门控调整后的代表性样本。第一个门控根据荧光信号以及总体视觉经验等多种设置组合，识别碎片和活细胞核的模式。

X 轴代表前向散射，对应于相对大小，而 Y 轴代表侧向散射，反映内部复杂性，例如颗粒度。第一个门控还可以提供样本中不同细胞核大小的参考信息。这有助于将碎片与真正的细胞核区分开来，以下是来自第二个门控的一些典型数据。

此流式图显示了第二个门控的示例，可用于单独分选细胞核，同时排除任何聚集体。该门控依据细胞核通过激光所需时间的差异进行区分。通常情况下，聚集体通过所需的时间更长。

这一特定参数非常重要，因为聚集体的存在可能会影响纯度，某些荧光核可能与非荧光核结合。最后，这是来自第三道门的典型数据。该道门设置为与二抗中标记的荧光素相匹配的特定荧光波长。

在此散点图中，您可以看到横轴显示的是荧光水平，纵轴为深红色通道检测器 PECY7。与单色直方图相比，这些点状图提供了更直观的视觉效果。使用门控（SCADA）可以将新型的阳性神经元核与新型的阴性非神经元核进行分选和分离。

在选定所有门控参数后，将细胞核分选至一个XPBS中。待整个样本完成分选后，通过仪器对分选后的样本进行Eloqua检测，以评估分选纯度。以下是一个理想结果的示例。

此处比较分选前的样品（包含混合的细胞核群体）与经过分选的Eloqua样品（已去除大部分阴性细胞核）。请注意，纯度百分比是基于设门范围内污染样品的事件数量计算得出。需要注意的是，样品首次通过仪器时可能会发生部分荧光淬灭，从而导致信号减弱；为校正此现象，可能需要进行一些调整。

样本分选完成后，开始处理细胞核。取10 mL分选后的样本，加入2 mL蔗糖溶液、50 µL 1 M氯化钙溶液和30 µL 1 M乙酸镁溶液。如果分选后的样本少于10 mL，可用1×PBS补足至10 mL，或相应调整其他添加物的用量。

接下来，将样品上下颠倒混匀数次，置于冰上静置15分钟。15分钟后，将样品在摆桶转子中以1,786 ×g离心15分钟，温度设为4°C。离心结束后，小心吸除上清液，注意不要扰动管底的白色沉淀。

然后将沉淀溶解于200微升后续实验所需的适当溶液中。本实验中，我们将沉淀溶解于缓冲液中，用于后续的染色质免疫沉淀实验。随后通过反复吹打重悬沉淀。

此时，可将细胞核转移至较小的离心管中，并置于–80 °C冰箱中保存，以备后续使用。至此，我已向您演示了如何从人死后脑组织中分离神经元细胞核。利用这些细胞核，您可以开展多种不同的分析，例如染色质免疫沉淀实验。

进行此操作时，重要的是要始终将样品置于冰上，因为细胞核未经过固定，在较高温度下可能发生降解。此外，处理人体组织时必须遵循生物安全二级或更高级别的安全标准。以上即为注意事项。

感谢观看，祝您的实验顺利。