测量斑马鱼对光强度变化反应性的行为学实验

在Dowling实验室，我们研究斑马鱼视网膜的生理学与发育过程，以确定那些无法感知运动的斑马鱼突变体是否仍能感光，而非完全失明。为此，我们检测其视觉运动反应（VMR）。我们通常在受精后约四天收集斑马鱼。

将它们放入96孔板中，准备合适的成像装置，将视频追踪软件与孔板对齐，然后追踪斑马鱼在明暗转换或暗明转换后的运动反应，这就是我们所说的视觉运动反应（VMR）。大家好，我是来自哈佛大学约翰·道林实验室及分子与细胞生物学系的Farida Imran。

我是杰森·里奥（Jason Rio），来自哈佛大学分子与细胞生物学系亚历山大·希尔（Alexander Shear）实验室。今天我们将向您展示斑马鱼对光强增加和减少的视觉运动反应。

那么，让我们开始吧。首先，在28摄氏度下，将野生型斑马鱼幼鱼置于明暗光周期环境中培养，直至受精后至少四天，以进行视觉运动反应实验。为了获得最佳的行为学结果，我们通常采用的明暗循环为：上午9:00开始光照14小时，晚上11:00开始黑暗10小时。

避免幼虫过于密集。我们通常在单个培养皿中饲养不超过50条幼虫。受精后五天，我们将斑马鱼转移至96孔板中，每孔体积为650 µL，以提供更大的游泳空间。

使用塑料移液管将每孔轻轻转移一条幼虫。将斑马鱼转移至孔中后，向每孔加入足量的养鱼用水，使液面几乎与孔的顶部齐平。注意避免加水过多或过少，以防对记录相机造成光学干扰。

同时注意避免在孔中引入气泡。现在可以开始监测斑马鱼对明暗环境的运动反应。接下来，将已放置斑马鱼的培养板转移至记录装置。

接下来，我们开始检查记录装置。装有斑马鱼的96孔板将被放置在记录室内的这个白色托盘中，并用弹簧或橡皮筋固定。摄像头位于盒子后部，通过盒子顶部的反射镜进行对焦，以对准孔板。

通过旋转固定镜子的螺丝，可以调节这些镜子的角度。记录室由底部的红外LED照明，从而使相机即使在黑暗中也能记录鱼类的活动。

幼虫无法感知红外光，因此这种持续的红外照明不会影响实验。白色LED灯也从下方照亮记录室。对于持续数小时以上的实验，它们的控制与红外灯分开进行。

可通过缓慢流动的水填充腔室，以帮助在整个实验过程中维持恒定温度。水由小型水族泵从储水槽中抽出，并使用普通的水下加热器加热至28摄氏度。水通过一个较大的排水孔排出后，重新循环回储水槽，以尽量减少来自环境的杂散振动。

整个记录装置置于一个沉重的平衡台上。当记录设备准备就绪后，使用一个盒子的盖子覆盖动物，以进一步隔绝光线。现在我们开始对96进行校准。

将装有鱼的96孔板放入记录室之前，先在视频追踪软件的计算机网格中放置好培养板。进行长期实验时，若使用水浴，应缓慢将培养板放入水中，使水位能够逐渐调整，避免水溢出到培养板上。在视频追踪软件的视图中检查，确保计算机屏幕上可见所有幼鱼及实验区域。

使用软件的控制功能，将视频追踪软件的网格与96孔板的孔位对齐，确保每条鱼位于网格的一个方格内。此步骤对所有录制都非常重要。追踪计算机会分别为每个方格内的鱼计算其运动轨迹。

因此，如果计算机网格未对齐，某些鱼类的运动可能会丢失，甚至更糟的情况是，两条相邻的鱼会占据同一区域，在对齐后被计为一条鱼。灯光开启和关闭的时间已预先编程到计算机中。

我们通常在箱内进行三小时的弱光暗适应。这不仅能获得基线活动水平，还能让幼虫在移液和操作后有机会平静下来。接下来，我们关闭记录室的门并开始记录。

实践中，我们以每秒为单位记录每条鱼的活动情况，但视角软件实际上记录的是逐帧的数据。在屏幕下方，您可以看到一条鱼的实时轨迹。就像素移动而言，白色线条表示像素变化数量低于设定的阈值，绿色线条则表示像素变化超过该阈值设定。

阈值会因您所使用的特定相机和光照设置而略有不同。在我们的设置中，通常使用四个像素的阈值。也就是说，如果发生变化的像素少于四个，则被视为背景。

如果有超过四个像素在移动，则表明鱼正在运动。我们通过经验确定，该阈值能够检测到几乎所有幼鱼的游动和转向动作。尽管记录框已较好地隔离了幼鱼，我们仍会关闭房间内的灯光，并尽量避免机械噪声的干扰，例如开关房门、举办舞会或进行锻炼活动。

实验完成后，将收集的数据导入 Excel 表格或您常用的分析软件中。数据呈现形式如下：包含自实验开始以来的时间（秒）以及每条幼虫每秒的活动情况。

下图显示了单个幼虫在整个实验过程中活动情况，图中箭头指示了多次开启和关闭刺激的反应。该图显示了40条鱼在整个实验过程中的平均活动水平，箭头所示为多次开启和关闭刺激引起的反应。如图所示，开启和关闭反应显著且一致。

这种视觉运动反应实验也可以在突变型鱼类上进行。在这些研究中，我们通常将野生型鱼类和突变型鱼类以棋盘式排列方式接种在同一块培养板上，以实现最佳的对照效果。当在同一块培养板上使用突变型鱼类和野生型鱼类时，务必记录下每个孔中接种的鱼类类型。

以下是如何记录每个孔中所放置鱼类的建议。以下是视觉运动反应实验结果，比较了野生型与突变型幼鱼。同样，我们观察到野生型幼鱼表现出显著且一致的开灯和关灯反应。

然而，缺乏眼睛发育的垩眼突变型幼虫对光强度的增加或减少均未表现出显著的活动性增强，且其基础活动水平较低。这些结果将野生型的反应与NO OKR突变型（也称为NRC突变型）进行了比较。根据OKR检测结果，NRC突变型被认为完全失明。

通过VMR实验，我们证明了NRC突变体在光关闭时反应正常，但在光开启时反应延迟且迟缓。因此，NRC突变体并非如先前认为的完全失明。我们刚刚展示了斑马鱼幼鱼对光增强和光减弱的视觉运动反应。

进行此操作时，重要的是要记住在白天进行实验，因为鱼类在白天比在夜间更活跃，且对光强度变化的反应更明显。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。