甲基化DNA免疫沉淀

本视频演示了一种甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）的实验方案，该方法可用于无偏倚地特异性分离甲基化DNA。哺乳动物中的DNA甲基化特征是在胞嘧啶的C5位点上添加一个甲基基团。

当存在于CpG二核苷酸中时，它是一种可逆的表观遗传标记，在正常发育以及多种疾病过程中发挥重要作用。DNA甲基化的正常功能包括女性X染色体失活、重复元件沉默、基因组印记以及基因组稳定性的维持。DNA甲基化还被证实参与多种疾病的发生，例如癌症、普拉德-威利综合征（Prader-Willi syndrome）、安格曼综合征（Angelman syndrome）以及免疫缺陷、着丝粒不稳定性与面部异常综合征（immunodeficiency, centromeric instability and facial anomaly syndrome）。

例如，在癌症中，异常的高甲基化和启动子区域的改变可能导致重要的抑癌基因沉默。而不当的低甲基化则会引起染色体不稳定和原癌基因的激活。该过程首先通过超声处理将DNA打断成大小在300至1000个碱基对之间的片段，随后将超声处理后的DNA在95摄氏度下变性。

加入可识别5-甲基胞嘧啶的初级抗体，并使其结合甲基化的DNA片段。使用与磁性dyna珠偶联的次级抗体来分离已被初级抗体结合的DNA片段。去除未甲基化的片段，随后用蛋白酶消化抗体。

KA苯基氯仿抽提可去除消化后的蛋白质，沉淀则纯化DNA，此时DNA富含甲基化片段。纯化后的DNA可用于PCR、微阵列及测序等应用。该实验通常作为两天的流程进行。

第一天包括DNA制备、超声处理、免疫沉淀以及蛋白质消化。第二天包括pH氯仿抽提和乙醇沉淀，以纯化并分离富含甲基化的DNA。实验所需的一些特殊材料包括硅化离心管、DNA超声破碎仪、一抗（抗5-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体）、二抗、与绵羊抗小鼠IgG偶联的Dyna珠，以及磁力管架。

Meetup 实验方案的第一步是 DNA 的制备。必须在实验前评估 DNA 的性质。了解样本 DNA 的状态（主要是双链还是单链）至关重要，因为准确测定样本 DNA 含量极为重要，而不同测定 DNA 含量的方法可能会受到非目标 DNA 类型存在的不利影响。

双链DNA的含量可通过分光光度法轻松测定。使用NanoDrop 3000时，加载1.5微升样品，将测量类型设为核酸，选择DNA 50作为计算方式，并用1.5微升水初始化仪器。清洁样品台后，用1.5微升溶剂进行空白校准。待测样品溶解后，再次清洁样品台，加载1.5微升样品，然后点击测量。

将给出浓度并可直接使用。为计算我所需的微升数，应使用A260/A280比值为1.8的样品，此时最为理想。准备一个1微克的样品。

然而，仅需200纳克的样本量即可获得成功的结果。进行实验时，将DNA样本加入一支洁净的硅化管中。加入足够的无菌水，使最终体积达到50微升。

DNA超声处理和免疫沉淀必须在硅化管中进行，以防止DNA和蛋白质非特异性结合到管壁上。DNA制备完成后，需对样品进行超声处理，以将DNA打断成片段，因为较小的DNA片段更有利于免疫沉淀的效率。将样品放入超声仪中，确保功率设置为高，仪器设定为超声30秒，间歇30秒。在超声间隔期间，向水槽中加入4°C的水至注水线处。

将样品超声处理七分钟。超声结束后，取出离心管并置于冰上。重要的是，需在实验前针对预期的样品和DNA大小优化超声处理条件。

例如，部分降解的 DNA 样品需要较短的超声处理时间。超声处理产物可通过标准电泳技术进行观察。此时所需 DNA 片段长度范围应为 300 至 1000 个碱基对，以供后续使用。

在微阵列和PCR检测中，应保留五分之一的DNA作为输入或参考DNA；在此情况下，将使用800纳克超声处理的DNA进行免疫沉淀，其余部分则保留作为参考DNA。媒体方案中的下一步是免疫沉淀（IP）反应，在加入一抗之前，必须对DNA进行变性。变性是必需的，因为一抗对单链DNA敏感。

将样品置于95摄氏度的水浴中10分钟。变性步骤完成后，立即将离心管转移至冰上，至少放置5分钟。这可以防止变性的DNA重新退火，从而在样品冷却后实现最佳的抗体结合。

短暂离心管子，使内容物沉降至管底。接着应加入一抗。抗体使用量需针对每一批次及每一个生产厂家进行滴定。

在此情况下，我们加入五微克的一抗，然后加入免疫沉淀缓冲液（IP缓冲液）至终体积为500微升。接下来，将IP DNA置于旋转仪中，在4摄氏度下孵育两小时。孵育过程中需要旋转，以防止抗体在管内发生聚集。

在完成一抗孵育前约15分钟时，清洗并准备磁性Dyna珠。首先，通过涡旋充分重悬小瓶中的珠子。然后，将30微升珠子转移至一个洁净的硅化管中，并将该管置于磁力架上，用于多个反应。

每反应转移 30 微升珠子，并额外多取一个反应所需的量，以补偿移液误差或珠子意外损失。例如，进行八个反应时，应取出九个反应所需的珠子，即 270 微升。

磁珠将被吸引至磁力架管壁的一侧。静置两分钟，使磁珠迁移并聚集在管壁上形成一条清晰的条带。随后，小心地用移液器吸除并弃去上清液，注意避免移液器吸头触碰管壁背面的磁珠，以免扰动。

弃去上清，加入过量的IP缓冲液，涡旋混匀，然后重新放回磁力架上静置两分钟。重复此洗涤步骤一次，最后将磁珠重悬于原始体积的IP缓冲液中。孵育结束后，从旋转仪上取出样本管。

为完成免疫沉淀，向反应体系中加入30 µL洁净的磁珠，并将离心管重新置于4°C的旋转仪上孵育两小时。在此孵育过程中，二抗（即抗小鼠IgG抗体）将结合至一抗（小鼠来源的一抗）上。抗小鼠抗体偶联于磁性Dyna珠，从而可方便地回收结合产物，并进行后续的纯化步骤。

当两种抗体的孵育完成后，将免疫沉淀管置于磁力架上静置两分钟。此时，甲基化的DNA会与一抗结合，而一抗又会与连接了磁珠的二抗结合。移除并弃去上清液，加入500微升免疫沉淀缓冲液。

混匀管内溶液，放回架子上静置两分钟。用 IP 缓冲液再重复洗涤一次。最后一次洗涤去除上清液后，重悬磁珠。

在400微升消化缓冲液中，加入100微克蛋白酶K处理反应体系，并于50摄氏度孵育过夜。蛋白酶K处理的目的是消化抗体蛋白以及与DNA结合的任何残留蛋白质，从而使甲基化DNA释放到溶液中。DNA纯化步骤在会议程序的第二天进行，从孵育器中取出消化管。

在通风橱中，向离心管中加入 500 µL pH 7 的等体积苯酚-氯仿，充分涡旋混匀。在 13,000 ×g 条件下离心 10 分钟。小心吸取上层水相，注意不要扰动界面或带出任何有机相。将水相转移至新的离心管中。

如果界面出现浑浊，可进行第二次抽提。接下来，加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠，此处为40微升。可加入1微升糖原作为载体，以促进沉淀物的纯化。

涡旋混匀管内溶液。然后加入两倍体积的100%乙醇，涡旋混匀后于-20°C冰箱中冷冻20分钟。冷冻后，在4°C条件下以13,000 ×g离心20分钟，使沉淀的DNA沉降。

在离心管底部会形成DNA沉淀。从离心机中取出离心管，小心移除乙醇，注意不要扰动管底的沉淀。

可能需要短暂离心以去除残留的乙醇。洗涤沉淀时，加入500 µL冰冷的70%乙醇，涡旋混匀，然后在13,000 ×g及4°C条件下再次离心20分钟。第二次离心完成后，弃去70%乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。

将离心管置于管架上，管盖打开，使沉淀干燥并让残留的乙醇挥发。最后，用10 µL无菌水重悬仅含甲基化富集DNA的沉淀，并在使用前留出足够时间使DNA沉淀充分溶解。建议通过PCR验证该步骤的操作效果。

可通过运行PCR反应来实现，该反应设计用于扩增能够差异显示甲基化和非甲基化DNA片段的产物，使用针对正常人DNA的引物进行扩增。H19印记控制区可与特异性扩增基因组中非甲基化区域的引物联合使用。示例引物序列及PCR扩增循环条件详见配套方案。

此时，需要取出在会议方案开始时预留的输入或参考 DNA。一组 PCR 反应将使用输入 DNA 进行设置，另一组则将使用经甲基化富集的免疫沉淀（IP）DNA。如果会议实验成功，则使用甲基化引物进行的 IP PCR 会产生扩增产物，而使用对照引物则不会产生扩增产物。

相反，输入的PCR应能使用两种引物扩增出产物，因为其中同时含有甲基化和非甲基化的DNA片段。富集了甲基化DNA片段的样品可用于多种下游应用，例如PCR测序和微阵列分析。

当与其他分子生物学技术结合时，可用于在特定位点或全基因组范围内研究DNA的甲基化状态，以进行甲基化谱型分析或表观基因组学研究。