Methylated DNA Immunoprecipitation

本视频演示了甲基化 DNA 免疫沉淀或 meetup 的实验方案。一种用于以无偏倚方式特异性分离甲基化 DNA 的方法。哺乳动物中的 DNA 甲基化的特征是在胞嘧啶的 C 5 位置添加甲基。

当存在于 A CPG 二核苷酸中时，它是一个可逆的表观遗传标记，在正常发育以及多种疾病过程中起重要作用。DNA 甲基化的正常功能包括女性 X 染色体失活、重复元件沉默、基因组印记和维持基因组稳定性。DNA 甲基化也被证明在许多疾病中发挥作用，例如癌症、der Willi 综合征、Engelman 综合征和免疫缺陷、中心不稳定和面部异常综合征。

例如，在癌症中，异常的高甲基化和启动子会导致重要的肿瘤抑制基因沉默。虽然不适当的低甲基化会导致染色体不稳定，但癌基因激活的相遇是通过首先将 DNA 声波滑冰成大小为 300 至 1000 个碱基对的片段来完成的。然后将超声处理的 DNA 在 95 摄氏度下变性。

加入识别 5 种引物甲嘧啶的一抗，并允许其结合甲基化 DNA 片段。与磁性 dyna 磁珠偶联的二抗用于分离与一抗结合的 DNA 片段。去除未甲基化的片段，抗体被蛋白酶消化。

KA 苯基氯仿纯化去除消化的蛋白质，沉淀纯化 DNA，现在 DNA 富含甲基化片段。Meetup 中，DNA 可用于 PCR 微阵列和测序等应用。聚会通常为期两天

第一天涉及 DNA 制备、超声处理、免疫沉淀和蛋白质消化。第二天包括 pH 氯仿提取和乙醇沉淀，以纯化和分离富含甲基化的 DNA。聚会需要一些特殊材料，包括硅化离心管、DNA 松动装置、一抗、抗五引物甲嗪小鼠、单克隆抗体、二抗、与绵羊偶联的 dyna 珠子、抗 US IgG 和磁管架。

聚会方案的第一步是 DNA 的制备。必须事先评估 DNA 的性质。需要了解样品 DNA 的状态，无论它主要是双链还是单链，因为样品的准确定量至关重要，并且测定 DNA 数量的各种方法可能会受到不需要的 DNA 种类的不利影响。

使用 NanoDrop 3 通过光谱光度法可以很容易地评估双链 DNA 的数量，加载 300 nd 加载 1.5 μL，并将测量类型设置为核酸，选择 DNA 50 作为计算，并用 1.5 μL 水初始化仪器。清洁底座并用 1.5 μL 液体空白仪器。将样品溶解在干净的基座中，加载 1.5 微升样品并进行打击测量。

将给出浓度并可以使用。要计算我需要的微升数，这里蘸取 1.8 的 A 2 60 比 2 80 的比例是理想的。制备 1 μg 样品。

然而，低至 200 ng 的样品就足以获得成功的结果。为了见面，将 DNA 样品加载到干净的硅化管中。加入足够的无菌水，使最终体积达到 50 微升。

DNA 超声处理和免疫沉淀必须在硅化管中进行，以防止 DNA 和蛋白质与管壁的非特异性结合。制备 DNA 后，样品必须进行超声超声处理以对 DNA 进行碎裂，因为免疫沉淀对较小的 DNA 片段更有效，将样品加载到超声处理液中，确保功率设置为高，并将机器设置为 30 秒。关闭 30 秒后，用 4 摄氏度的水将底座填充到填充线中。

对样品进行超声处理 7 分钟。超声处理完成后，取出试管并将其放在冰上。事先针对预期样品和 DNA 大小优化超声处理条件非常重要。

例如，部分降解的 DNA 样品需要更短的超声处理时间。超声处理产物可以通过标准电泳技术进行可视化。此时需要长度为 300 至 1000 个碱基对的 DNA 片段，以备后用。

在微阵列和 PCR 检测中，您应该保留五分之一的 DNA 作为输入 DNA 或参考 DNA，在这种情况下，800 ng 超声处理的 DNA 将用于免疫沉淀，其余的将留作参考 DNA。培养基方案的下一步是免疫沉淀或 IP 反应，在添加一抗之前，DNA 必须变性。需要变性，因为一抗对单链 DNA 敏感。

将样品置于 95 摄氏度的水浴中 10 分钟。变性步骤完成后，立即将试管转移到冰中至少 5 分钟。这将防止 Reen 跪下变性 DNA，并在样品冷却后实现最佳抗体结合。

短暂旋转试管，将内容物拉到底部。接下来，应添加一抗。应针对每个批次和每个制造商滴定使用的抗体量。

在这种情况下，我们加入 5 μg 一抗，然后加入免疫沉淀缓冲液或 IP 缓冲液，最终体积为 500 μL。接下来，将 IP DNA 放入旋转器中，并在 4 摄氏度下孵育 2 小时。需要旋转以防止孵育期间抗体在试管内聚集。

在一抗孵育完成前约 15 分钟，清洁并制备磁性 dyna 磁珠。首先，通过涡旋将微珠彻底重悬于小瓶中。然后将 30 μL 珠子转移到干净的硅化管中，并将该管放在磁力架上进行多次反应。

每次反应转移 30 μL 磁珠，再加上足够进行一次额外反应，以允许移液错误或意外损失一些磁珠。例如，对于 8 个反应。去除足够进行 9 次反应的磁珠或 270 μL。

磁珠将被拉向磁力架的壁。让珠子迁移并在管壁上形成明确的条纹。接下来，小心取出并丢弃上清液移液器，确保避免用移液器吸头干扰后壁上的珠子。

用过量的 IP 缓冲液涡旋置换上清液，然后将其放回磁力架上 2 分钟。再次重复此洗涤，并将洗涤珠重悬于其原始体积的 IP 缓冲液中。孵育完成后，从旋转器中取出样品管。

为了完成免疫沉淀，向反应中加入 30 μL 干净的微珠，并将试管放回旋转器中，在 4 摄氏度下放置 2 小时。在此孵育过程中，二抗（即抗小鼠 IgG）将与小鼠一抗结合。抗小鼠抗体与磁性 dyna 磁珠偶联，可轻松回收结合产物并执行纯化步骤。

与两种抗体孵育完成后，将 IP 管放在磁力架上 2 分钟。此时，甲基化 DNA 将与一抗结合，而一抗本身将与 dyna 珠偶联的二抗结合。取出并丢弃上清液，用 500 微升 IP 缓冲液替换。

混合试管中的内容物，然后将其放回架子上 2 分钟。再次用 IP 缓冲液重复此洗涤。从最后一次洗涤 Resus 中取出上清液后，最后一次悬浮珠子。

在 400 μL 消化缓冲液中，用 100 μg 蛋白酶 K 处理反应物，并在 50 摄氏度下孵育过夜。蛋白酶 K 处理对于消化抗体蛋白和与 DNA 相关的任何残留蛋白是必要的，从而使甲基化 DNA 释放到溶液中。DNA 纯化在 meetup 程序的第二天进行，从培养箱中取出消化管。

在通风橱中，向试管中加入 500 μL pH 值为 7 的一对一苯基氯仿，并在 13， 000 下彻底涡旋试管 10 分钟。G.小心地从管中取出顶部水相，不要干扰界面或去除任何有机层。将水相转移到新管中。

如果界面显示为云，则可以进行第二次提取。接下来，在本例中，加入 10 倍体积的 3 摩尔乙酸钠，40 微升。可以使用一微升糖原作为载体，以促进沉淀物的净化。

涡旋试管以混合内容物。然后加入两体积的 100% 乙醇，涡旋并在零下 20 摄氏度的冰箱中冷冻 20 分钟，冷冻后。将沉淀的 DNA 放入离心机中，以 13， 000 G 和 4 摄氏度离心 20 分钟。

沉淀将在试管底部形成。从离心机中取出试管并去除乙醇。小心不要打扰管底部的沉淀。

可能需要脉冲旋转以去除任何残留的乙醇。要清洗沉淀，加入 500 微升冷的 70% 乙醇涡旋，然后在 13， 000 G 和 4 摄氏度下再次旋转 20 分钟。第二次旋转完成后，去除 70% 乙醇脉冲旋转，并用移液管去除残留的乙醇。

将试管放在架子上，打开盖子以干燥沉淀并让剩余的乙醇蒸发。最后，Reus 悬浮仅包含甲基化富集 DNA 和 10 μL 无菌水的沉淀，让 DNA 沉淀在使用前有足够的时间溶解。最好通过 PCR 验证聚会熟练程度。

这可以通过运行 PCR 反应来完成，该反应旨在扩增产物，这些产物对甲基化和未甲基化的 DNA 片段进行了差异，用于正常人 DNA 引物的扩增。H 19 印迹对照区域可与旨在扩增基因组中未甲基化区域的引物结合使用。示例，引物序列和 PCR 循环条件可在随附的方案中找到。

此时，有必要检索在 meetup 协议开始时留出的输入或参考 DNA。一组 PCR 反应将使用输入 DNA 构建，另一组将使用富含甲基化的 IP DNA。如果聚会成功，IP PCR 将使用甲基化引物产生产物，而不使用对照引物产生产物。

相反，起始 PCR 应使用两种引物产生产物，因为它同时包含甲基化和非甲基化。DNA 片段。甲基化片段富集的 DNA 可用于多种下游应用，例如 PCR 测序和微阵列分析。

当与其他分子生物学技术结合时，它可用于以位点特异性或全基因组方式研究 DNA 的甲基化状态，以进行甲基化分析或研究表观基因组学。