Name: 甲基化的DNA免疫沉淀 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: 学习甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）技术，利用抗5-甲基胞嘧啶抗体特异性分离甲基化DNA片段。该方法适用于表观遗传学研究，可揭示DNA甲基化在正常发育及癌症等疾病中的关键作用。

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我们感谢布朗实验室和林实验室的成员参与本视频和文章的审阅工作。本研究得到了加拿大卫生研究院和迈克尔·史密斯健康研究基金会的资金支持。

DNA 提取与样品制备
多种不同来源的DNA（培养细胞、新鲜冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织）均可用于甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。必须使用高度纯化的DNA，避免组蛋白等蛋白质残留。同时应尽可能去除样本中的RNA，因其可能干扰DNA定量及抗体结合。用于MeDIP的DNA用量可根据样本可获得量在200 ng至1 µg之间调整。本方案以1 µg DNA为例进行说明。以下方案可从培养细胞中提取高质量的双链DNA。对于其他类型的样本，应采用相应的DNA提取方法。
<ol>
<li>在1.7 ml离心管中的细胞沉淀中加入400 μl裂解缓冲液。</li>
<li>向管中加入100 μg蛋白酶K，在50°C下过夜孵育。</li>
<li>加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。</li>
<li>在室温下以13 000 g离心10分钟。</li>
<li>将水相（上层）转移至新管中。</li>
<li>重复步骤3至5一次。</li>
<li>加入500 µl 1:1 pH 7的酚/氯仿溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。</li>
<li>在室温下以13 000 g离心10分钟。</li>
<li>将水相（上层）转移至新管中。</li>
<li>加入40 μg RNase A，在37°C孵育1小时。</li>
<li>加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。</li>
<li>在室温下以13 000 g离心10分钟。</li>
<li>将水相（上层）转移至新管中。</li>
<li>重复步骤11至13一次。</li>
<li>加入500 µl 1:1 pH 7的酚/氯仿溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。</li>
<li>在室温下以13 000 g离心10分钟。</li>
<li>将水相（上层）转移至新管中。</li>
<li>加入1/10体积的3 M醋酸钠（40 μl），充分混匀。</li>
<li>加入2倍体积（900 μl）的100%乙醇，充分混匀后于-20°C放置20分钟。</li>
<li>在4°C下以13 000 g离心20分钟。</li>
<li>弃去乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。</li>
<li>加入500 μl预冷的70%乙醇洗涤，在4°C下以13 000 g离心20分钟。</li>
<li>弃去70%乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。</li>
<li>将沉淀在室温下开盖风干10分钟，以彻底去除残留乙醇。</li>
<li>在4°C下用50 μl无菌dH₂O过夜重悬DNA。</li>
<li>使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度。A260:A280比值为1.8时为理想状态。</li>
<li>使用含100 bp DNA标记物的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和片段大小范围。可将低至10 ng的基因组DNA上样至1.7%琼脂糖凝胶，随后使用对微量DNA高度敏感的染料（如SYBR Gold）进行染色。</li>
<li>每个样品使用一个硅化管，将1 µg DNA用无菌dH2O补至总体积50 μl。</li>
</ol>
DNA 超声处理
DNA 超声处理和 MeDIP 实验方案必须在硅化管中进行，以防止蛋白质非特异性结合到管壁上。DNA 样品的最佳超声时间应根据凝胶电泳结果确定的 DNA 片段化程度而定（步骤 27）。例如，从培养细胞中提取的 DNA 分子量通常非常高，因此需要比从存档样本中提取的 DNA 更长的超声时间，因为后者往往已部分降解。如果所有样品的分子量均一致地较高，则可合理地按照本实验方案所述直接进行超声处理，而无需逐一检测每个样品。如果样品本身已存在片段化（如存档样本），则需调整超声程序，可能需要缩短超声时间，以获得 300–1000 bp 的片段。若预计处理的样品存在部分降解情况，可在代表性样本上优化超声参数。根据凝胶电泳观察到的 DNA 片段化程度（步骤 27），实验人员可预先确定该类样品的最佳超声时间。本文描述的方法使用高分子量 DNA，通过自动化超声设备（Diagenode 的 Bioruptor，UCD-200 TM）进行超声处理，以获得 300–1000 bp 的 DNA 片段。
<ol>
<li>Biorupter 中的水温必须保持在 4°C。</li>
<li>在自动设置下超声处理 7 分钟（最大功率，开启 30 秒，关闭 30 秒）。</li>
<li>取 800 ng（40 μl）超声处理后的产物，置于经硅烷化处理的 1.7 ml 离心管中，用于免疫沉淀（IP）反应。</li>
<li>保留剩余的 200 ng（10 μl）作为输入（IN）参考 DNA（置于 4°C 保存）。</li>
</ol>
甲基化DNA的免疫沉淀
<ol>
<li>将用于免疫沉淀（IP）反应的 DNA（800 ng）在水浴中于 95°C 变性 10 分钟。</li>
<li>立即置于冰上冷却。在进行下一步操作前，确保 DNA 在冰上完全冷却（约 5 分钟）。</li>
<li>加入 5 μg 单克隆抗体。</li>
<li>加入 IP 缓冲液（本方案中始终在室温下使用），使终体积达到 500 μl。</li>
<li>在 4°C 下于旋转管架中孵育 2 小时。</li>
<li>在步骤 5 即将完成前，开始准备 Dynabeads（进行步骤 6–11）。首先，通过涡旋充分重悬瓶中的磁珠。</li>
<li>每反应另加 1 份，向新的硅化管中转移 30 μl（约 2 × 107）重悬的 Dynabeads（例如，若进行 8 个反应，则取出 9 份所需的磁珠，即 270 μl）。</li>
<li>将管置于磁力架上，室温静置 2 分钟。</li>
<li>用移液器吸除上清液。吸取过程中，避免移液枪头接触管内壁（磁珠被磁铁吸附的一侧）。</li>
<li>将管从磁力架上取下，用过量 IP 缓冲液（750 μl–1000 μl）重悬磁珠，再放回磁力架上，室温静置 2 分钟。</li>
<li>重复洗涤一次，然后将洗涤后的磁珠用与步骤 7 中取出体积相同的 IP 缓冲液重悬。</li>
<li>向每个 IP 反应中加入 30 μl 洗涤后的 Dynabeads。</li>
<li>在 4°C 下于旋转管架中孵育 2 小时。</li>
<li>孵育完成后，将管置于磁力架上，室温静置 2 分钟。</li>
<li>吸除上清液，避免移液枪头接触管内壁（磁珠被磁铁吸附的一侧）。加入 500 μl IP 缓冲液，混匀管内物质后放回磁力架上，室温静置 2 分钟。用 500 μl IP 缓冲液再洗涤一次。</li>
<li>最后一次洗涤去除上清液后，将磁珠重悬于 400 μl 消化缓冲液中。</li>
<li>加入 100 μg 蛋白酶 K 处理反应，并在 50°C 下过夜孵育。</li>
</ol>
免疫沉淀 DNA 的纯化
<ol>
<li>添加 500 &mu;l 1:1 酚/氯仿 pH 7，充分涡旋混匀。</li>
<li>室温下以13 000 g离心10分钟。</li>
<li>移取水相（上层）至新离心管中。</li>
<li>如果水相与有机相之间的界面显得浑浊，则重复步骤1至3。</li>
<li>加入1/10th 3 M 醋酸钠溶液40 &mu;l）并涡旋振荡。</li>
<li>添加 1 &mu;l 糖原的20 &mu;g/&mu;l）并涡旋震荡。</li>
<li>加入2倍体积（1000 &mu;l) 100% 乙醇，涡旋混匀，置于 -20&deg;C 20分钟</li>
<li>13 000 g 离心 20 分钟 4&deg;C.</li>
<li>去除乙醇，瞬时离心，去除残留乙醇。</li>
<li>添加 500 &mu;l 用预冷的70%乙醇洗涤。短暂涡旋振荡，然后在13 000 g离心20分钟 4&deg;C.</li>
<li>移除70%乙醇，短暂离心，用移液枪吸去残留乙醇。</li>
<li>将沉淀物在室温下敞盖风干10分钟，以彻底去除残留的乙醇。</li>
<li>将DNA沉淀重悬于 10 &mu;l 无菌去离子水20. </li>
</ol>
通过 PCR 进行验证
<ol>
<li>可通过使用正常人类 DNA（男性或女性）进行 MeDIP 实验，并检测已知富含甲基化的区域，以验证 MeDIP 操作是否成功。</li>
<li>将 30% 的 MeDIP 产物转移至一个 PCR 管中，另取 30% 的 MeDIP 产物转移至另一个 PCR 管中。</li>
<li>将 10 ng 的输入 DNA（IN DNA）加入一个 PCR 管中，另取 10 ng 的输入 DNA 加入另一个 PCR 管中。此时您应已准备好四个独立的 PCR 反应。</li>
<li>按照表 1 所示，使用 H19 和 CTRL 引物进行 PCR 扩增。</li>
<li>为 PCR 反应配制两种预混液（每种引物对应一种），总体积为 12.5 µl，具体组分见表 2。</li>
<li>按照表 3 所列条件进行 PCR 扩增的热循环程序。</li>
<li>取 5 µl PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，用于可视化检测。</li>
<li>成功的 MeDIP 实验预期结果见表 4。</li>
</ol>
表格
表1：用于PCR验证的H19和CTRL引物。 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>引物组合</td>
<td>正向引物</td>
<td>反向引物</td>
<td>预期产物大小</td>
</tr>
<tr>
<td>H19</td>
<td>H19_F 5’-cgagtgtgcgtgagtgtgag</td>
<td>H19_R 5’-ggcgtaatggaatgcttgaa</td>
<td>174 bp</td>
</tr>
<tr>
<td>CTRL（对照）</td>
<td>CTRL_F 5’-gagagcattagggcagacaaa</td>
<td>CTRL_R 5’-gttcctcagacagccacattt</td>
<td>139 bp</td>
</tr>
</tbody>
</table>

表2. PCR反应的主混合液。 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>H19混合液（每反应）</td>
<td>CTRL混合液（每反应）</td>
</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
<td>6.875</td>
<td>6.875</td>
</tr>
<tr>
<td>10X缓冲液</td>
<td>1.25</td>
<td>1.25</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP混合液（各10 mM）</td>
<td>0.25</td>
<td>0.25</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2（50 mM）</td>
<td>0.25</td>
<td>0.25</td>
</tr>
<tr>
<td>引物（H19_F/R或CTRL_F/R）（每对F/R各10 µM）</td>
<td>0.625</td>
<td>0.625</td>
</tr>
<tr>
<td>Platinum Taq</td>
<td>0.25</td>
<td>0.25</td>
</tr>
</tbody>
</table>

表3. PCR扩增循环条件。 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>95°C</td>
<td>5:00</td>
</tr>
<tr>
<td rowspan="3">40X </td>
<td>95°C</td>
<td>0:30</td>
</tr>
<tr>
<td>56°C</td>
<td>0:30</td>
</tr>
<tr>
<td>72°C</td>
<td>0:15</td>
</tr>
</tbody>
</table>

表4. 成功进行甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的预期PCR结果。 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td colspan="2" align="center">模板DNA</td>
</tr>
<tr>
<td>使用的引物</td>
<td>输入（IN）</td>
<td>免疫沉淀（IP）</td>
</tr>
<tr>
<td>H19</td>
<td>阳性</td>
<td>阳性</td>
</tr>
<tr>
<td>CTRL</td>
<td>阳性</td>
<td>阴性</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
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<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
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<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
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<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

人们日益认识到DNA甲基化在疾病中发挥的重要作用，因此检测这种修饰的分析方法的开发正变得愈发重要3, 12, 13。MeDIP技术是一种适用于全基因组水平和位点特异性水平筛查的可行工具6, 7。该技术仅需少量起始DNA即可快速评估DNA甲基化水平，并便于在不同样本之间进行简单比较。MeDIP产物的下游应用包括多种微阵列技术，如全基因组和CpG岛寡核苷酸微阵列、针对特定基因座的直接PCR检测，以及测序分析。
MeDIP 提供了一种独特的DNA甲基化检测方法，该方法依赖抗体来区分甲基化和非甲基化的DNA6。尽管MeDIP比传统的亚硫酸氢盐测序方法更快，且不像限制性酶切分析那样局限于特定序列的分析，但其免疫沉淀效果会受到DNA序列的影响，包括CpG密度、重复元件的存在及其组成。因此，与所有实验一样，适当的对照对于MeDIP结果的分析和解释至关重要。
在MeDIP技术的多个步骤中需格外谨慎，包括：使用硅化管以防止DNA非特异性结合管壁；确保超声处理后DNA充分片段化；以...

<table><tbody><tr><td>Biorupter 超声破碎仪</td><td>工具</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml SafeSeal 微量离心管</td><td>其他</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 分光光度计</td><td>工具</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一抗：抗-5&amp;rsquo;-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体</td><td>试剂</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>二抗：Dynabeads M-280 羊抗小鼠 IgG 磁珠</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>磁力管架</td><td>工具</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller 混匀仪</td><td>工具</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100，室温保存</td></tr><tr><td>消化缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

甲基化dna免疫沉淀

Methylated DNA Immunoprecipitation

DNA甲基化模式的鉴定是表观遗传学研究中的常见实验步骤，因为已知甲基化对基因表达具有重要影响，并参与正常发育以及疾病的发生。1-4因此，能够区分甲基化DNA与非甲基化DNA对于生成此类研究的甲基化谱图至关重要。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）是一种从目标样本中有效提取甲基化DNA的技术。5-7. 仅需 200 ng 的 DNA 样品即可满足抗体或免疫沉淀（IP）反应的需求。DNA 经超声处理断裂为 300–1000 bp 大小的片段，并分为免疫沉淀（IP）和输入（IN）两部分。IP DNA 随后经加热变性，再与抗-5'mC 抗体孵育，使单克隆抗体能够结合甲基化的 DNA。接着加入含有可与一抗特异性结合的二抗的磁珠，并进行孵育。这些磁珠连接的二抗将结合第一步中使用的单克隆抗体。利用磁铁将与抗体复合物结合的 DNA（即甲基化 DNA）从溶液中分离出来。随后使用 IP 缓冲液进行多次洗涤，以去除未结合的非甲基化 DNA。然后用蛋白酶 K 消化甲基化 DNA/抗体复合物，降解抗体，仅保留完整的甲基化 DNA。富集后的 DNA 通过苯酚:氯仿抽提法纯化以去除蛋白质成分，再经沉淀并重悬于水中，以备后续使用。可采用 PCR 技术通过分析已知不含甲基化序列和已知含有甲基化序列区域的 IP 与 IN DNA 扩增产物，来验证 MeDIP 实验的效率。纯化后的甲基化 DNA 可用于位点特异性（PCR）或全基因组范围（微阵列和测序）的甲基化研究，尤其适用于与其他研究工具（如基因表达谱分析和芯片比较基因组杂交（CGH））联合应用时。8对DNA甲基化的进一步研究将有助于发现新的表观遗传学靶点，这些靶点可能在开发针对癌症等以异常甲基化DNA为特征的疾病的新型治疗或预后研究工具方面具有重要价值。2, 4, 9-11.

本视频演示了甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的实验方案。MeDIP是一个为期两天的实验流程，利用对5-甲基胞嘧啶（anti-5 mC）具有特异性的抗体，从基因组DNA样本中选择性地富集甲基化的DNA片段。

甲基化DNA免疫沉淀

DNA甲基化模式的鉴定是表观遗传学研究中的常见步骤，因为已知甲基化对基因表达和细胞功能具有重要影响。

本视频演示了一种甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）的实验方案，该方法可用于无偏倚地特异性分离甲基化DNA。哺乳动物中的DNA甲基化特征是在胞嘧啶的C5位点上添加一个甲基基团。当存在于CpG二核苷酸中时，DNA甲基化是一种可逆的表观遗传标记，在正常发育以及多种疾病过程中发挥着重要作用。DNA甲基化的正常功能包括女性X染色体失活、重复元件沉默、基因组印记以及基因组稳定性维持。研究还表明，DNA甲基化在多种疾病中发挥作用，例如癌症、普拉德-威利综合征（Prader-Willi syndrome）、安格曼综合征（Angelman syndrome）以及免疫缺陷、着丝粒不稳定性与面部异常综合征（immunodeficiency, centromeric instability and facial anomaly syndrome）。例如，在癌症中，异常的高甲基化和启动子区域的改变可导致重要的肿瘤抑制基因失活。而不当的低甲基化则会引起染色体不稳定和原癌基因的激活。该过程首先通过超声处理将DNA打断成300至1000个碱基对大小的片段，随后将超声处理后的DNA在95摄氏度下变性。加入识别5-甲基胞嘧啶的一抗，并使其与甲基化的DNA片段结合。使用与磁性dyna珠偶联的二抗来分离已被一抗结合的DNA片段。去除未甲基化的片段，随后用蛋白酶消化抗体。KA苯基氯仿抽提可去除消化后的蛋白质，沉淀则纯化DNA，此时DNA富含甲基化片段。纯化后的DNA可用于PCR、微阵列及测序等应用。该实验通常作为两天的实验流程进行。第一天包括DNA制备、超声处理、免疫沉淀和蛋白质消化。第二天包括酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，以纯化并分离富含甲基化的DNA。实验所需的一些特殊材料包括硅化离心管、DNA超声破碎仪、一抗（抗5-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体）、二抗、与绵羊抗小鼠IgG偶联的磁珠（Dyna Beads）以及磁力架。Meetup 实验方案的第一步是 DNA 的制备。必须在实验前评估 DNA 的性质。了解样本 DNA 的状态（主要是双链还是单链）至关重要，因为准确测定样本 DNA 含量极为重要，而多种 DNA 定量方法可能会受到非目标 DNA 类型存在的不利影响。双链DNA的含量可通过分光光度法轻松测定。使用NanoDrop 3、300型仪器时，加载1.5微升样品，将测量类型设为核酸，选择DNA 50作为计算方式，并用1.5微升水初始化仪器。用1.5微升液体清洁基座并对仪器进行空白校正。将样品溶解后，清洁基座，加载1.5微升样品，然后点击测量。将给出浓度并可直接使用。为计算我所需的微升数，应使用 A260/A280 比值为 1.8 的样本，此时最为理想。准备一个 1 微克的样品。然而，仅需200纳克的样本量即可获得成功的结果。例如，将DNA样本加入一支洁净的硅化管中，再加入足够的无菌水，使最终体积达到50微升。DNA超声处理和免疫沉淀必须在硅化管中进行，以防止DNA和蛋白质非特异性结合到管壁上。DNA制备完成后，需对样品进行超声处理，以将DNA打断成片段，因为较小的DNA片段更有利于免疫沉淀的效率。将样品放入超声仪中，确保功率设置为高，仪器设定为超声30秒，暂停30秒。在暂停期间，向水槽中加注4°C的水至注水线。将样品超声处理七分钟。超声结束后，取出离心管并置于冰上。重要的是，需在实验前针对预期的样品和DNA大小优化超声条件。例如，部分降解的 DNA 样品需要较短的超声处理时间。超声处理产物可通过标准电泳技术进行观察。此时应获得长度在 300 至 1000 个碱基对之间的 DNA 片段，以供后续使用。在微阵列和PCR检测中，应保留五分之一的DNA作为输入或参考DNA；在此情况下，将使用800纳克超声处理的DNA进行免疫沉淀，其余部分则保留作为参考DNA。媒体方案中的下一步是免疫沉淀（IP）反应，在加入一抗之前，必须对DNA进行变性。变性是必需的，因为一抗对单链DNA敏感。将样品置于95摄氏度的水浴中10分钟。变性步骤完成后，立即将离心管转移至冰上，至少放置5分钟。这将防止变性的DNA重新退火，并在样品冷却后实现抗体的最佳结合。短暂离心管子，使内容物沉降至管底。接着应加入一抗。抗体使用量需针对每一批次及每一个生产厂家进行滴定。在此情况下，加入五微克的一抗，然后加入免疫沉淀缓冲液（IP缓冲液）至终体积为500微升。接下来，将IP DNA置于旋转仪中，在4摄氏度下孵育两小时。孵育过程中需要旋转，以防止抗体在管内发生聚集。在完成一抗孵育前约15分钟时，清洗并准备磁性Dyna珠。首先，通过涡旋充分重悬小瓶中的珠子。然后，将30 µL珠子转移至一个洁净的硅化管中，并将该管置于磁力架上，用于多个反应。每反应转移30微升珠子，并额外多取一个反应所需的量，以补偿移液误差或珠子意外损失。例如，进行八个反应时，应取出九个反应所需的珠子，即270微升。磁珠将被吸引至磁力架的管壁一侧。静置两分钟，使磁珠迁移并聚集在管壁上形成清晰的条带。随后，小心使用移液器吸取并弃去上清液，注意避免移液器吸头触碰管壁后侧的磁珠，以免扰动沉淀。弃去上清，加入过量的免疫沉淀缓冲液（IP buffer），涡旋混匀，然后重新置于磁力架上静置两分钟。重复此洗涤步骤一次，最后将磁珠重悬于原始体积的免疫沉淀缓冲液中。当孵育结束后，从旋转仪上取回样本管。为了完成免疫沉淀，向反应体系中加入 30 微升洁净的磁珠，并将离心管置于 4 摄氏度的旋转仪中孵育 2 小时。在此孵育期间，二抗（即抗小鼠 IgG）将结合到一抗（小鼠来源的一抗）上。抗小鼠抗体与磁性 Dyna 珠偶联，从而便于富集结合产物并进行后续的纯化步骤。当两种抗体的孵育完成后，将免疫沉淀管置于磁力架上静置两分钟。此时，甲基化的DNA会与一抗结合，而一抗又会与连接了磁珠的二抗结合。移除并弃去上清液，加入500微升免疫沉淀缓冲液。混匀管内物质，放回架上静置2分钟。用IP缓冲液重复洗涤一次。最后一次洗涤去除上清后，重悬磁珠以进行后续操作。在400微升消化缓冲液中，加入100微克蛋白酶K处理反应，并在50摄氏度下孵育过夜。蛋白酶K处理对于消化抗体蛋白以及与DNA相关的任何残留蛋白质是必要的，从而使甲基化DNA释放到溶液中。DNA纯化在会议程序的第二天进行，从孵育器中取出消化管。在通风橱中，向离心管中加入 500 µL pH 7 的等体积苯酚-氯仿溶液，充分涡旋混匀。在 13,000 ×g 条件下离心 10 分钟。小心吸取上层水相，注意不要扰动界面或带出任何有机相。将水相转移至新的离心管中。如果界面出现浑浊，可进行第二次抽提。接着，加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠，此处为40微升。可加入1微升糖原作为载体，以促进沉淀物的纯化。涡旋混匀管内溶液。然后加入两倍体积的100%乙醇，涡旋混匀后于-20°C冰箱中冷冻20分钟。冷冻后，在4°C条件下以13,000 ×g离心20分钟，使沉淀的DNA沉降。DNA沉淀将形成于离心管底部。从离心机中取出离心管，并移除乙醇。操作时注意不要扰动管底的沉淀物。可能需要短暂离心以去除残留的乙醇。洗涤沉淀时，加入500 µL冰冷的70%乙醇，涡旋混匀，然后在4°C条件下以13,000 ×g离心20分钟。第二次离心完成后，弃去70%乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。将离心管置于管架上，管盖打开，使沉淀干燥并让残留的乙醇挥发。最后，用10 µL无菌水重悬富含甲基化DNA的沉淀，并在使用前留出足够时间使DNA沉淀充分溶解。建议通过PCR验证该步骤的操作有效性。可通过运行PCR反应来实现，该反应设计用于扩增能够差异显示甲基化和非甲基化DNA片段的产物，使用针对正常人DNA的引物进行扩增。H19印记控制区可与特异性扩增基因组中非甲基化区域的引物联合使用。示例引物序列及PCR扩增循环条件详见随附的实验方案。此时，需要取出在会议方案开始时预留的输入或参考 DNA。一组 PCR 反应将使用输入 DNA 进行设置，另一组则将使用经甲基化富集的免疫沉淀（IP）DNA。如果会议实验成功，则使用甲基化引物时，免疫沉淀 PCR 应产生扩增产物，而使用对照引物时则无产物生成。相反，输入的PCR应能使用两种引物扩增出产物，因为其中同时含有甲基化和非甲基化的DNA片段。富集了甲基化DNA片段的样品可用于多种下游应用，例如PCR测序和微阵列分析。当与其他分子生物学技术结合使用时，可用于在特定位点或全基因组范围内研究DNA的甲基化状态，以进行甲基化谱型分析或表观基因组学研究。

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