使用CyDye DIGE Fluor公司最小染料的细胞表面蛋白的选择性标签

我叫 Maria，在瑞典 NOS 的 Y Healthcare 工作。细胞表面蛋白通常参与细胞与其环境之间的通讯，因此对研究特别感兴趣，旨在更深入地了解疾病以及由细胞环境变化引起的其他生物变异。在本视频中，我将向您展示一个简单的侧眼躲避细胞表面标记方案，您将能够在没有物理增强的情况下直观地富集这些低丰度蛋白质，并使用该技术研究这些细胞表面蛋白质的差异。

如果您觉得这项技术很有趣，可以在 2D 手册中找到更多信息。此外，我们还有关于此特定主题的应用说明，您可以从作业中下载。在顶部看到的细胞表面标记方案中，您可以在细胞仍然完整时对其进行标记。在标记过程中，染料只能接触到细胞表面的蛋白质。

标记步骤后，分析细胞以验证细胞表面特异性标记。将标记样品分馏成膜蛋白和胞质蛋白。平行制备未分级分离的样品。

为了进行比较，这种分级分离分析不是必需的，但在这里进行只是为了表明细胞表面方案对细胞表面专业提示是特异性的。我们还执行了标准的 ETH 非饮食标记方案，如下所示，在标记之前细胞是谎言，这样所有细胞蛋白都可以进行标记。标记步骤后，对样品进行 2D 电泳。

A 使用非酶程序分离贴壁细胞，以避免消化靶向细胞表面蛋白。在该方案中，我们使用橡胶警察，但使用酶三细胞解离培养基也是一种选择计数，并将细胞悬液分成每管 5 至 1000 万个细胞的准组。然后将细胞沉淀并在 H-P-S-S-P-H 7.4 中洗涤，以去除细胞培养物的痕迹。

血清蛋白和荧光成分的培养基污染会干扰标记和检测。在悬浮液中生长的细胞在洗涤后在标记步骤之前直接沉淀和洗涤。将细胞调色板重悬于 200 μL 冰冷的标记缓冲液中，其中含有 HPSS pH 8.5 和 1 磨牙尿。

为了获得最佳细胞表面蛋白的标记条件，请始终检查 pH 值。在标记之前，我们对 1000 万个 CHO 细胞使用了 600 个 pic 模具侧眼。侧眼与细胞数量的最佳比例将根据细胞类型而变化。

因为我们不知道细胞表面的确切蛋白质浓度。如何确定蛋白质侧眼标记的最佳条件在 2D 电泳原理和方法手册中进行了介绍。将细胞与侧眼 D 地板、最小骰子在黑暗中的冰上孵育 20 分钟。

标记反应后，通过加入 20 μL 10 毫摩尔赖氨酸淬灭未反应性染料。现在，标记细胞在冷的 HPSS pH 7.4 缓冲液中洗涤两次，以去除多余的侧眼。因此，在下一步（即细胞裂解）中，将没有游离染料可用于不需要的细胞内标记或蛋白质。

现在标记细胞表面的蛋白质，并洗涤细胞并准备进行 lic。将来自丢失洗涤步骤的沉淀重悬于 150 μL 冷裂解缓冲液中，该缓冲液含有 7 个摩尔尿、2 个尿球、4% CHAPS 30 毫摩尔树、5 毫摩尔乙酸镁 pH 8.5，并在冰上放置至少 1 小时，偶尔涡旋。样品现在可以进行 2D 分离了。

电解的第一步是准备用于再水化的 IPD 条带。通过添加与所用试纸的 pH 区间相对应的 IPG 缓冲液来制备区域补液，并将溶液添加到补液托盘的镜头中。撕掉 IPG 试纸条的保护膜，小心地将试纸条与干燥的凝胶面朝下放入装有再水化溶液的再水化托盘中。

盖上 IPG 盒盖，将胶条再水化过夜。在第一维，等电聚焦，蛋白质根据它们的 pi 被分离。这是使用 IPG four three 执行的。

将再水化的试纸条置于歧管中，电极安装在顶部。使用样品应用帽从每个样品中加入 50 μg。我们要么直接施用未分馏的样品，而没有事先分馏，要么在施用之前将样品分馏成膜和胞质组分。

导线闭合以保护荧光样品避光。根据建议对仪器进行编程并运行过夜。使用成人 12 凝胶时，大 12% lamby 凝胶的成本更高。

加入 Coster 置换溶液以避免管道中出现聚合的 acry 凝胶。使用前，让凝胶在室温下聚合过夜。等电聚焦后，去除条带并在含有 SDS 的缓冲液中分两步平衡，使用 DTT 减少半胱氨酸残基的二硫键，然后用乙酰胺烷基化以避免丙烯酰胺修饰。

将 IPG 胶条浸入电泳缓冲液中，并小心地放在两个大的 dig 凝胶的顶部。通过添加顶部含有溴 anol 蓝色的熔化 2% agro 溶液，避免在胶条和凝胶密封之间滞留空气。凝胶现在已准备好在第二维 SDS 页面中进行第二维 SDS 页面分离。

蛋白质将根据分子量进行分离，这是使用 Toneal Six 系统进行的。用阳极电泳缓冲液填充电泳室，插入凝胶，并用阴极电泳缓冲液程序填充顶部隔室。根据建议，使用电源，并在避光的情况下运行第二维大约 4 到 5 小时，或直到染料前沿到达凝胶底部。

第二维电泳后，使用台风荧光成像仪中的夹持器放置凝胶盒。可以同时扫描 2 块凝胶和 3 个通道。这两个 DL 的结果显示样品中膜蛋白的高分辨率，即使在 A two DL 中检测到疏水性蛋白存在一些已知的限制。

结果表明，细胞表面标记方案对标记细胞表面蛋白具有高度特异性。由于细胞表面蛋白是专门标记的，因此它们更容易可视化，并且避免了大量胞质蛋白的衰减。具有未分馏膜组分或胞质组分的凝胶的荧光图像显示在顶部。

下面是使用银的相同凝胶后染色的图像。结果显示胞质蛋白没有荧光标记，但银染显示凝胶中存在蛋白质。结果还显示了未分级分离和膜级分的相似点图模式，表明在 2D 电泳之前不需要分级分离，这使得该方案既简单又方便。

SI 2、SI 3 和 SCI 5 显示出相似的标记模式，并且都与细胞表面方案兼容。使用所有三个侧眼 DI 地板最小 dy 进行饮食实验，以研究不同时间长度的血清饥饿 CHO 细胞中细胞表面蛋白的差异表达。合并实验中所有样品的 CY 两个细胞表面样品，用作内标。

饥饿期间可以跟踪几种细胞表面蛋白的差异变化。使用细胞表面方案检测到超过 18 种新型膜蛋白，这些蛋白在制备凝胶中用于查找蛋白质身份的标准方案未检测到。有必要对细胞表面样品进行加标，以便于与分析数据集上的斑点匹配。

结果就在那里。结果显示大量细胞表面蛋白的高分辨率。该方案对细胞表面蛋白非常特异性，未观察到细胞内蛋白的标记。

与标准方案相比，使用这种方法，您能够检测到更多的细胞表面蛋白，而且正如您已经看到的，这是一个非常简单的方案。您只需在细胞表面蛋白仍然完整时对其进行标记，然后直接在 2D 电泳上运行它们，无需膜分级。因此，这是研究细胞表面蛋白以及使用 D 技术的不同之处的非常好的方案。